ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

この方法の全体的な目標は、ステージ特異的なシグナル操作アプローチを使用して、ヒト多能性幹細胞の分化をプリミティブまたは決定的な造血プログラムに導くことです。この方法は、ヒトの最終的な造血のシグナルおよび転写調節因子の理解など、この分野の多くの重要な問題に対処できます。この手法の主な利点は、ステージ固有の操作を即座に使用することです。

この手順を実証しているのが、私の研究室のポスドクであるCarissa Degeです。プロトコールを開始するには、マウス胚性ファイバーブラストまたはMEFsで70%から80%のコンフルエンシーまでマウス胚性ファイバーブラストまたはMEF上で増殖させた、事前に調製したヒト多能性幹細胞株またはHPSCSを、5%のCO2を含む摂氏37度のインキュベーターで70%から80%のコンフルエンシーに取得します。HPSC培地を吸引し、各ウェルに37°Cの0.25%トリプシンEDTAを1ミリリットル加えます。

1分後、トリプシンを吸引し、各ウェルに1ミリリットルのストックメディアを追加します。セルスクレーパーを使用して、プレートからセルをこすり落とします。次に、各ウェルに1ミリリットルの洗浄バッファーを加えます。

2ミリリットルの血清ピペットで、細胞を3〜5回粉砕して大きな塊を分解します。そして、細胞を50ミリリットルの円錐管に移します。HPSCを330 x Gで5分間遠心分離します。

スピン後、HPSC培地を添加し、細胞を再懸濁します。次に、再懸濁したHPSCを2ミリリットルをMATコードプラスチック製品の各ウェルに加え、細胞を一晩インキュベートします。24時間後、メディアを吸引し、摂氏37度の0.05%トリプシンEDTAと1分間交換します。.

トリプシンEDTAを吸引します。1ミリリットルのストック培地を加え、セルスクレーパーで細胞を激しく掻き取ります。次に、1ミリリットルの洗浄メディアを追加します。

2ミリリットルの血清ピペットで、細胞を3回粉砕し、50ミリリットルの円錐管に移します。細胞を220 x Gで5分間遠心分離します。次に、培地を吸引し、20ミリリットルの洗浄培地を追加し、5ミリリットルの血清ピペットを使用して細胞を穏やかに再懸濁します。

遠心分離および吸引後、Day Zero培地中の胚様体またはEBを慎重に再懸濁します。EBを含む2ミリリットルの分化培地を、10ミリリットルの血清ピペットを使用して、6ウェルの低接着性細胞培養皿の各ウェルに分注します。EBを摂氏37度の5%CO2、5%O2マルチガスインキュベーターに入れます。

24時間後、2ミリリットルのDay Oneメディアを追加します。細胞をマルチガスインキュベーターで一晩インキュベートします。18時間後、5ミリリットルの血清ピペットでEBを静かに回収し、100 x Gで5分間回転させます。

培養物全体を洗浄し、10ミリリットルのIscoveのModified Dulbecco MediumまたはIMDMと組み合わせます。培養物を再び100 X Gで5分間回転させて破片を除去した後、培地を吸引します。P1000ピペットを使用して、Day Two MediaでEBを静かに再懸濁します。

次に、ウェルあたり2ミリリットルのEBを6ウェルの低接着性細胞培養プレートに分注します。3マイクロモルのCHIR99021またはIWP2を追加して、それぞれ決定的または原始的な造血前駆細胞を特定します。プレートを摂氏37度のマルチガスインキュベーターで30時間インキュベートします。

30時間後、EBを2ミリリットルの血清ピペットで50ミリリットルの円錐管に移し、330×Gで5分間センティフしてEBを単離します。EBを静かに再懸濁し、10ミリリットルのIMDMで洗浄します。Day 3 MediaでEBを再懸濁し、低接着性の6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルを分注します。

細胞を摂氏37度のマルチガスインキュベーターで72時間インキュベートします。72時間のインキュベーション後、各ウェルに2ミリリットルのDay Six Mediaを加えます。次に、EBを摂氏37度のマルチガスインキュベーターでさらに48時間インキュベー

分化の 8 日目にCHIR99021処理した EB を分離し、次のセクションに進みます。EBを330 x Gで5分間遠心分離します。上清を吸引します。

次に、EBに0.25%トリプシンEDTAの2ミリリットルを追加します。EBを5秒間ボルテックスし、Ebを摂氏37度の水浴で8分間インキュベートします。次に、5ミリリットルの停止溶液を加え、EBを遠心分離します。

次に、上清を吸引します。EBを5ミリリットルのコラゲナーゼII.チューブに5秒間ボルテックスし、その後、EBを摂氏37度の水浴中でインキュベートします。60分後、EBを5秒間ボルテックスし、5ミリリットルの停止溶液を追加します。

遠心分離後、上清を吸引し、細胞を1ミリリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。細胞を40ミクロンのセルストレーナーに通して、未解離の細胞塊を取り除きます。CD34陽性の血行性内皮前駆細胞の抗体標識とFACS単離を進めます。

FACS単離後、HE培地中の細胞を再懸濁します。細胞を50マイクロリットルのアリコートに入れ、96ウェルの低接着性培養プレートに分散させ、細胞を一晩インキュベートします。翌朝、造血前駆細胞は6〜10個の細胞の塊に凝集するはずです。

50ミリリットルの量の再凝集細胞を、24ウェルMATコードプレートの中央に静かに移します。細胞が付着するまで、プレートをマルチガスインキュベーターに4〜6時間静かに置きます。4〜6時間後、細胞が付着するのを待つために、調製したばかりのHE培地1ミリリットルを各ウェルにゆっくりと加えます。

造血細胞が見えるまで、マルチガスインキュベーターで細胞をインキュベートします。次に、HE培地を細胞から穏やかに除去し、40ミクロンの細胞ストレーナーを通過してフロースルーを収集することにより、最終的な造血前駆細胞を採取します。残りの接着細胞については、0.5ミリリットルの0.25%トリプシンEDTAを細胞に加え、摂氏37度のインキュベーターで5分間インキュベートします。

トリプシン化後、各ウェルに0.5ミリリットルの停止溶液を追加します。細胞を同じ40ミクロンのセルストレーナーに通して、接着細胞と非接着細胞をすべてプールし、細胞を回転させます。OP9培地中のOP9 DL4細胞の1つのウェルに2,000〜10,000個のFACS単離細胞を添加します。

摂氏37度、5%CO2インキュベーターでインキュベートします。4〜5日ごとに細胞を継代するには、1ミリリットルのピペットで細胞を粉砕します。40ミクロンのフィルターを通して、塊を取り除きます。

遠心分離後、培地を吸引します。細胞を2ミリリットルの新鮮なT細胞培地に再懸濁し、新鮮なOP9 DL4細胞上に置きます。少なくとも21日間の冷培養後、細胞を激しく粉砕し、40ミクロンのフィルターを通過して細胞の破片を取り除きます。

330 x Gで5分間遠心分離し、上清を吸引してから、標準的なフローサイトメトリーを続行します。フローサイトメトリーは、IWP2で処理した分化培養物が、異なるCD34陽性、CD43陰性、およびCD34低CD43陽性集団をもたらすことを示しています。一方、CHIRで処理した分化培養物は、分化8日目のCD43陽性細胞が1%未満です。

9日目に単離されたIWP2条件下で得られた原始造血前駆細胞は、メチルセルロースアッセイで主に原始的な赤血球および骨髄性前駆細胞を生じさせます。CHIR99021処理に由来するCD34陽性CD43陰性集団は、内皮前駆細胞ならびにCD34陽性、CD43陰性、CD73陰性、CD184陰性血液産生内皮を含む不均一な集団であり、FACSによって単離されると、最初に内皮様細胞の単層を形成し、次いで内皮から造血への移行を経て、丸い、屈折性、 非接着性造血細胞。これらの造血細胞は、CD34およびCD45の発現についてフローサイトメトリーによって評価できます。

EHTアッセイから単離された造血前駆細胞は、メチルセルロースアッセイに使用でき、大きなバースト状の赤血球コロニー形成単位、小さな赤血球コロニー形成単位、および骨髄性前駆細胞を生じさせます。CHIR99021由来のCD34陽性、CD43陰性、CD73陰性、CD184陰性造血前駆細胞およびIWP2由来CD34陽性、CD43陰性造血前駆細胞からのTリンパ球アッセイ電位のこれらの代表的なフローサイトメトリー分析は、入力CD34陽性集団内の造血電位を示すCHIR由来前駆細胞におけるCD45陽性、CD56陰性、CD4陽性、CD8陽性集団の存在を示している。このビデオを見れば、ヒト多能性幹細胞を原始的または決定的な量の造血前駆細胞に分化する方法を十分に理解できるはずです。