小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ
2017年3月10日
私たちは、現在の研究では、トランスジェニックマウス由来のリンパ球を用いた新規蛍光ベースのアッセイを提示します。このアッセイは、阻害またはリンパ球活性化を促進するいずれかの能力を付与する小分子のハイスループットスクリーニング（HTS）に適しています。
この蛍光ベースのリンパ球アッセイの全体的な目標は、新しい低分子免疫調節剤を同定することです。この方法は、リンパ球の活性化と阻害のメカニズムに関する免疫学の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この表現型機能とアッセイの主な利点は、創薬に適応できることです。
その手順を実演するのは、私たちの研究室の大学院生であるAhmed Foudaです。無菌の作業フードの下で、生後6〜8週齢の雌Nurr77 GFPマウスの毛皮を70%エタノールで消毒し、動物を右側に置きます。次に、左上腹部の皮膚と筋肉を切開し、脾臓を見つけて除去し、組織を氷上の脾細胞培地に入れます。
すべての脾臓を採取したら、5ミリリットルの予熱した脾臓細胞培地が入った10cm四方の細胞培養皿に組織を移し、滅菌シリンジプランジャーを使用して、溶液が濁るまで組織をつぶします。脾細胞培地で広範囲にマッシングした後、細胞懸濁液を70ミクロンの細胞ストレーナーで50ミリリットルのチューブにろ過して破片を取り除き、得られた単一細胞懸濁液を遠心分離します。ペレットを2〜3ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に再懸濁し、20〜30秒後に5ミリリットルのRPMIまたは別の適切な緩衝液で反応をすすます。
次に、別の遠心分離で細胞を回収し、ペレットをtwpミリリットルの脾臓細胞培地に再懸濁して細胞計数します。T細胞を単離するには、細胞を再度遠心分離し、ペレットを無血清RPMI培地に10〜7細胞/mLの濃度で1回再懸濁します。細胞を5ミリリットルのポリスチレンチューブに移し、後で純度評価に使用するために100マイクロリットルの脾細胞のアリコートを取っておきます。
次に、正常なラット血清1ミリリットルあたり50マイクロリットルを細胞に加え、続いて1ミリリットルあたり50マイクロリットルのT細胞単離抗体カクテルを穏やかに混合して添加します。10分後、細胞をストレプトアビジン標識磁気ビーズと2分半インキュベートします。次に、無血清培地を細胞に加えて最終容量を2.5ミリリットルにし、チューブを細胞分離磁石に3分間置きます。
インキュベーションの終わりに、チューブを磁石に保持し、上清を新しいポリスチレンチューブに一気に注ぎます。その後、T細胞をカウントできます。T細胞を丸底96ウェルプレートに10倍から5番目の細胞の2.5倍の濃度で播種し、ウェルあたり200マイクロリットルの新鮮な脾細胞培
地をウェルあたり含みます。組換えインターロイキン7およびCD3/CD28磁気ビーズを適切なウェルに添加し、プレートを細胞培養インキュベーターに置きます。12時間後、各ウェル内の細胞懸濁液を穏やかに粉砕して、ビーズ細胞凝集体を分解します。次に、各ウェルからの細胞懸濁液を個々の5ミリリットルポリスチレンチューブに移します。
すべての細胞が収集されたら、細胞の各チューブを一度に5分間分離磁石に入れ、チューブがまだ磁石内にあるときに上清をデカントし、各インキュベーションの終わりに新しいポリスチレンチューブにデカントします。次に、遠心分離によって細胞を回収し、ペレットを新鮮な脾細胞培地に10〜6細胞/ミリリットルの濃度の2倍で再懸濁します。低分子ハイスループットスクリーニングでは、384ウェルプレートでウェルあたり40マイクロリットルの細胞をプレート化し、細胞培養インキュベーターで目的の処理期間、選択した薬剤またはビヒクルで適切なウェルを処理します。
GFP分析の30分前に、適切な濃度のHoechst溶液で細胞を染色し、穏やかなピペッティングで染色を十分に分散させます。すべてのウェルが染色されたら、プレートを遠心分離してウェルの底に細胞を回収し、細胞を室温で15分間休ませます。製造元の指示に従ってプレートをロードします。
次に、対物レンズを40倍以上に設定します。UVランプにカメラ番号4を設定し、次にレーザー488にカメラ番号1を設定します。プレートをハイコンテントスクリーニングシステムにロードします。
次に、自動共焦点ハイコンテントスクリーニングシステムを、ウェルあたり6〜10個のフィールドを読み取るように設定し、フィールドごとに2回の連続読み取り、488ナノメートルおよびUV光で行います。CD3陽性T細胞は、特定のマウス脾臓の約30%を占め、10%の基礎GFP発現を示しています。CD3/CD28 T細胞受容体ビーズの刺激後、GFP発現の割合が5〜6倍に増加することが観察されます。
同様に、CD19陽性B細胞は、全脾細胞の50〜55%を占め、非活性化T細胞と同様の基礎GFP発現を示します。興味深いことに、抗マウスIgG、IgM、および組換えCD40Lを用いたB細胞受容体刺激は、GFP発現のわずかな増加しか引き起こしません。今示したように磁気ビーズを単離した後も、単離されたCD3陽性T細胞は依然として10%の基礎GFP発現を示します。
しかし、CD3/CD28ビーズ刺激は、GFP応答の有意なアップレギュレーションを誘導します。同様に、B細胞磁気ビーズ単離後、精製された活性化B細胞は、脾細胞中の活性化B細胞と比較してGFPの発現が高くなります。この代表的な実験では、4398化合物の一次ハイスループットスクリーニングにより、T細胞活性化のいくつかの活性化因子と阻害剤が明らかになりました。
しかし、刺激されたT細胞の観察されたGFP発現は、刺激されなかったT細胞で測定されたGFP発現の20倍でした。GFP阻害化合物を容易に検出できる行動範囲のウィンドウの生成を可能にします。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば36〜48時間で完了できます。
この手順を試行するときは、各ステップの後にセルを数えることを忘れないでください。この手順に続いて、ELISAやウェスタンブロッティングなどの他の方法を実行して、他の追加の質問に答えることができます。この技術は、げっ歯類の創薬免疫調節への道を開くでしょう。
このビデオを見れば、Nurr77 GFPマウスプレートに由来するT細胞またはB細胞を単離し、活性化する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
この研究は、トランスジェニックマウス由来のリンパ球を利用した新しい蛍光ベースの検定法を提示し、リンパ球活性化を調整できる小分子の高スループットスクリーニングを目的としています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 免疫学
- 創薬
- 細胞生物学
背景
- この検定法は小分子免疫調節物質の同定に焦点を当てています。
- リンパ球活性化メカニズムに関する重要な質問に対応しています。
- この方法は創薬応用に適応可能です。
- 手順の実演は大学院生によって行われます。
研究目的
- 免疫調節物質の高いスループットスクリーニング方法を開発すること。
- リンパ球活性化と阻害の理解を深めること。
- 将来の創薬努力のためのプラットフォームを提供すること。
使用した方法
- 蛍光ベースの検定法の開発。
- Nurr77 GFPトランスジェニックマウスからのリンパ球の分離。
- 小分子の高いスループットスクリーニング。
- リンパ球活性化のin vitro分析。
主な結果
- リンパ球機能を調整する小分子の同定に成功しました。
- この検定法の創薬への適応可能性を実証しました。
- リンパ球活性化メカニズムに関する洞察を提供しました。
- 将来の免疫学研究のための信頼性の高い方法を確立しました。
結論
- この蛍光ベースの検定法は免疫学研究のための有望なツールです。
- 新しい免疫調節薬の発見を促進することができます。
- この研究はリンパ球生物学のより深い理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-throughput phenotypic screening of lymphocyte activation using a fluorescence-based assay enables rapid identification of immunomodulatory small molecules without a predefined target hypothesis. This platform supports early-stage drug discovery in immunology and transplantation by providing quantitative, scalable readouts of T and B cell responses. The assay's adaptability and throughput position it as a critical tool for portfolio triage and mechanistic de-risking in immunomodulator pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immunomodulatory hypotheses in primary lymphocytes using functional readouts.
- Supports biological de-risking by quantifying activation and inhibition across diverse compound libraries.
- Facilitates predictive confidence in target-agnostic screening for novel immune modulators.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative GFP-based outputs for high-throughput compound evaluation.
- Ensures reproducibility and scalability through automated confocal imaging and multi-well formats.
- Prepares validated cellular systems for downstream mechanistic or secondary assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant immune pathways by modeling T and B cell activation in vitro.
- Provides continuity from phenotypic screening to in vivo validation of immunomodulatory hits.
- Enables risk-adjusted advancement of candidates based on functional immune modulation profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence-based lymphocyte assay integrates at the early discovery and lead identification stages, bridging phenotypic screening with mechanistic follow-up and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-free screening and pathway clarification in immune cell activation.
- Screening: Offers robust, quantitative readouts for high-throughput evaluation of thousands of compounds.
- Analytics: Provides GFP intensity measurements to compare activation states and identify modulators.
- Translational Research: Facilitates selection of candidates for further in vitro and in vivo immunological studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various immune cell types and compound libraries for broad portfolio application.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immunomodulator discovery.
- Operational Value: Standardizes and accelerates screening workflows with scalable, reproducible outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early functional triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunomodulatory candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary lymphocyte isolation and high-content fluorescence imaging.
- Needs access to automated confocal screening platforms and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell preparation and assay conditions.
- Adaptable to different immune cell subtypes and compound libraries with protocol optimization.
- Dependent on robust cell viability and activation controls for reliable data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Generation of Splenocyte Cell Suspension from Nur77GFP Mouse Spleens
2:07
T Cell Isolation from the Splenocyte Cell Suspension
3:26
T-cell Activation and the Induction of GFP Expression
4:42
High Throughput Screening of Small Molecule
6:05
Results: T and B Cell Receptors Activation Flowcytometry Results and a Representative T Cell HTS of Smal Molecules
7:56
Conclusion
