小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

この蛍光ベースのリンパ球アッセイの全般的な目的は、新たな低分子免疫調節剤を同定することです。本手法は、リンパ球の活性化および抑制のメカニズムに関する免疫学分野の重要な疑問への回答に役立ちます。この表現型機能アッセイの主な利点は、創薬に応用可能であることです。

本手順のデモンストレーションは、当研究室の大学院生であるAhmed Foudaが行います。無菌ワークフード内で、6〜8週齢の雌のNurr77 GFPマウスの被毛を70%ethanolで消毒し、動物を右側を下にして寝かせます。次に、左上腹部の皮膚と筋肉を切開し、脾臓を特定して摘出後、組織を氷上の脾細胞用培地に入れます。

すべての脾臓を回収した後、組織を5 mLの予熱済み脾細胞培地 containing が入った10 cm四方の細胞培養ディッシュに移し、滅菌済みのシリンジプランジャーを使用して、溶液が濁るまで組織をすり潰します。脾細胞培地中で十分にすり潰した後、細胞懸濁液を70 µmのセルストレーナーでろ過して50 mLチューブに回収し、デブリを除去して、得られた単一細胞懸濁液を遠心分離します。ペレットを2〜3 mLの赤血球溶解バッファーで再懸濁し、20〜30秒後に5 mLのRPMIまたは他の適切なバッファーで反応を停止させます。

その後、再度遠心分離して細胞を回収し、細胞数計測のためにペレットを2 mLの脾細胞培地で再懸濁します。T細胞を単離するために、細胞を再び遠心分離し、ペレットを1 × 10⁷ cells/mLの濃度になるように無血清RPMI培地で再懸濁します。細胞を5 mLポリスチレンチューブに移し、後の純度評価に使用するため、100 µLの脾細胞分注液を取り分けておきます。

次に、細胞に正常ラット血清を1 mLあたり50 µL加え、続いてT細胞分離抗体カクテルを1 mLあたり50 µL加えて穏やかに混合します。10分後、ストレプトアビジン結合磁気ビーズとともに細胞を2分30秒間インキュベートします。その後、最終容量が2.5 mLになるように無血清培地を細胞に加え、チューブを細胞分離用マグネットに3分間設置します。

インキュベーション終了後、チューブをマグネットに保持したまま、上清を一度の動作で新しいポリスチレンチューブに注ぎます。これでT細胞のカウントが可能です。T細胞を、1ウェルあたり200 µLの新鮮な脾細胞培地を含むラウンドボトム96ウェルプレートに、2.5 × 10⁵ cells/wellの濃度で播種します。

適切なウェルにリコンビナントインターロイキン7およびCD3/CD28磁気ビーズを添加し、プレートを細胞培養インキュベーターに設置する。12時間後、各ウェルの細胞懸濁液を穏やかにピペッティングし、ビーズと細胞の凝集体を分散させる。その後、各ウェルの細胞懸濁液を個別の5 mLポリスチレンチューブに移す。

すべての細胞を回収した後、各細胞チューブを分離マグネットに5分間ずつ設置し、チューブをマグネットに入れたままの状態での各インキュベーション終了時に、上清を新しいポリスチレンチューブにデカンテーションします。次に、遠心分離によって細胞を回収し、ペレットを2 × 10⁶ cells/mLの濃度になるように新鮮な脾細胞用培地で再懸濁します。低分子化合物のハイスループットスクリーニングでは、384ウェルプレートの各ウェルに40 µLの細胞を分注し、細胞培養インキュベーター内で、目的の処理期間にわたって適切なウェルに選択した薬剤またはビークルを投与します。

GFP分析の30分前に、適切な濃度のHoechst溶液で細胞を染色し、緩やかなピペッティングで染料を均一に行き渡らせます。すべてのウェルの染色が完了したら、プレートを遠心分離して細胞をウェルの底に集め、室温で15分間静置します。その後、メーカーの指示に従ってプレートをロードしてください。

次に、対物レンズを40X以上に設定します。カメラ4をUVランプに、カメラ1をレーザー488に設定します。ハイコンテンツスクリーニングシステムにプレートをロードします。

次に、自動共焦点ハイスループットスクリーニングシステムの設定を行い、1ウェルあたり6〜10視野を読み取り、各視野について488 nmとUV光で2回連続して測定します。マウス脾臓のCD3陽性T細胞は約30%を占め、10%の基礎的なGFP発現を示します。CD3/CD28 T細胞受容体ビーズによる刺激後、GFP発現率に5〜6倍の増加が認められます。

同様に、CD19陽性B細胞は全脾細胞の50～55%を占め、基底状態のGFP発現は非活性化T細胞と同程度でした。興味深いことに、抗マウスIgG、IgMおよびリコンビナントCD40Lを用いたB細胞受容体刺激では、GFP発現のごくわずかな上昇しか認められませんでした。前述の磁気ビーズによる分離後、単離されたCD3陽性T細胞においても、依然として10%の基底GFP発現が認められました。

一方で、CD3/CD28ビーズ刺激は、GFP応答の有意なアップレギュレーションを誘導します。同様に、B細胞を磁気ビーズで単離した後、精製された活性化B細胞は、脾細胞中の活性化B細胞と比較して高いGFP発現を示します。この代表的な実験において、4398個の化合物を対象とした一次ハイスループットスクリーニングにより、T細胞活性化の複数の活性化剤および阻害剤が明らかになりました。

しかし、刺激したT細胞で観察されたGFP発現は、非刺激のT細胞で測定された値よりも20倍高く、これによりGFP抑制化合物を容易に検出できる作用領域（ウィンドウ）を生成することが可能になります。この手法に習熟すれば、適切に実施することで36時間から48時間で完了させることができます。

この手順を行う際は、各ステップの後に細胞数をカウントすることが重要です。本手順に続き、ELISAやウェスタンブロッティングなどの他の手法を実施することで、さらなる疑問を解消することが可能です。この技術は、げっ歯類における免疫調節の創薬に向けた道を開くものとなります。

このビデオを視聴することで、Nurr77 GFPマウスから由来するT細胞またはB細胞を分離し、活性化する方法について十分に理解することができます。