ローカルフィールド蛍光顕微鏡：無傷の心の中に携帯電話の信号のイメージング
2017年3月8日
心臓では、分子事象は器官の電気的および収縮機能を調整します。ここで紹介する地元の視野蛍光顕微鏡技術のセットは、無傷の心の中の細胞の変数の記録を可能にします。心機能を定義するメカニズムを識別することは心が病的な状況下でどのように機能するかを理解する上で重要です。
この局所フィールド蛍光顕微鏡イメージング技術の全体的な目標は、分子プローブを使用して、細胞内カルシウムレベル、または心臓全体のレベルでアクセスするのが難しい心臓領域からの膜電位を測定することです。この方法は、心停止と虚血に関連する主要な心血管の質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞が電気的、機械的、代謝的に結合し続ける無傷の臓器の細胞イベントから心臓の特性が測定されることです。
まず、水平ランゲンドルフ装置を準備します。調製したばかりのTyrode溶液を60ミリリットルのシリンジにロードし、セットアップの関連するすべてのチューブを追加します。充填したら、すべての気泡を取り除きます。
次に、装填した溶液を、水中のプラスチックエアストーンから供給される純粋な酸素ガスで平衡化します。次に、針の周りに非吸収性の外科用縫合糸を配置します。これは、装置に取り付けられたときに心臓を後退灌流するためのカニューレとして機能します。
次に、ヘパリンを注射して動物を安楽死させた後に心臓を採取します。まず、エタノールで胸をきれいにします。デモンストレーションはマウスを使用していますが、インコの心臓の収穫にも同じ手順が機能します。
次に、解剖ハサミを使って下腹部を切開し、首に向かって側面を切り上げます。次に、心臓を避けて横隔膜を慎重に切り開きます。次に、カットしたティッシュを引き戻して固定します。
次に、肺と周囲の組織を切除して心臓を露出させます。露出したら、ピンセットを使用して、心臓を圧迫せずにすくい取ります。大動脈を切って動物から切り離し、できるだけ多くの大動脈を心臓に付着させたままにします。
次に、心臓を1ミリリットルのチロード溶液を入れた小さな計量ボートに入れます。解剖顕微鏡で、ピンセットとはさみを使用して、血液と心臓を取り巻く脂肪組織をすばやく取り除きます。非吸収性の外科用縫合糸と針を使用して、大動脈をランゲンドルフ装置の水平接続部に取り付けます。
2本の細いピンセットで結び目を固定します。次に、バルブを開いてTyrode溶液を放出することにより、再灌流を開始します。周囲の組織をきれいにし、破片を吸引して、心臓が10分間安定している間、水平チャンバーを清潔に保ちます。
染料を新鮮にします。Rhod-2 AMの場合、メーカーの50マイクログラムの染料パッケージに20マイクロリットルの20%プルロン酸とDMSOを追加します。気泡を避けてピペッティングで混合します。
次に、液化した染料を透明なガラスバイアルに移し、1ミリリットルのチロード溶液を加えます。この混合物に染料を15〜20分間の超音波処理を使用して完全に溶解します。次に、調製した色素をペリスタルティックポンプを使用して室温で灌流します。
まず、染料チャンバーに染料を装填し、次に、マニホールドに接続されているすべてのチューブラインをクランプし、逆流を防ぐためにクランプをマニホールドの上に保ちます。次に、ポンプのスイッチを入れ、すぐに60ミリリットルの注射器の下にある三方弁を閉じます。ポンプの吸引端に取り付けられた小さなチューブを心臓の隣に配置して、灌流後に色素を再循環させます。
小さなゲージの針を取り、頂点につまんで圧力を和らげます。その後、心臓に染料を30分間灌流させます。この間、虚血や組織の損傷の原因となる気泡が組織に侵入しないように、染料のレベルを評価することが非常に重要です。
染料を灌流した後、タイロード溶液で心臓を後灌流します。クランプを取り外しますamp マニホールドの上の。バルブを開き、心臓が10分間安定するのを待ちます。
再灌流中に、水平チャンバーにチロード溶液を充填し、ペルチェユニットの電源を入れて、浴の温度を摂氏37度にします。実験用の光ファイバーライトを準備するには、まず光ファイバーを2ミリリットルのピペットの中に入れます。次に、ピペットをマイクロマニピュレーターに取り付けます。
マイクロマニピュレーターを使用して、光ファイバーを側脳室の表面にわずかに押し付けます。次に、幅が1ミリ秒の方形パルスを提供するように波発生器をプログラムします。また、心臓刺激装置を外部同期してウェーブジェネレーターに接続するように設定します。
2つの刺激装置出力のそれぞれに、端にはんだ付けされた鍼でワイヤーを取り付けます。2本の鍼を心臓の頂点に約3ミリメートル離して取り付けます。針が配置されたら、刺激装置を始動して、偶発的な衝撃を避けます。
ここで、心外膜信号を記録するには、ソフトウェアで取得周波数を10キロヘルツに調整します。心内膜信号を収集するには、同じ手順に従いますが、23ゲージの針を使用して、中隔近くの側脳室に穴を開けます。次に、マイクロマニピュレーターを使用して、2番目の光ファイバーを心内膜に配置します。
経壁機能にアクセスするために、心内膜と心外膜から記録された活動電位の形態を比較しました。蛍光記録は、CLFFM技術を使用して心臓をdi-8-ANEPPSで治療した後に行われました。活動電位は心内膜で、特にフェーズ1で遅くなりました。
活動電位の持続時間は、活動電位がある程度再分極するのにかかる時間として説明されました。デュレーションが正規化され、ゼロフェーズでオーバーラップするようにシフトされた場合、それらを比較できます。確かに、フェーズ1では大きな違いがありました。
次に、Rhod-2 AMを使用して細胞内カルシウムをモニターしました。細胞内カルシウムの地域差を比較するために、カルシウム過渡の動態を評価しました。それに比べて、トランシエンスのピークまでの時間は、心内膜で約2ミリ秒長かった。
全体として、心内膜からのカルシウム過渡性は、心外膜よりも有意に遅い動態を示しました。この技術を習得すると、心臓でアクセスが困難な領域の細胞内カルシウムの過渡性と活動電位を記録するために使用できます。セットアップのランゲンドルフ部分は、心臓にさまざまな化学物質を灌流し、心臓の特性への影響を評価することを非常に実用的にします。
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概要
本記事では、心臓における細胞内カルシウム濃度および膜電位を測定するための局所電界蛍光顕微鏡技術を紹介します。この手法により、心停止や虚血などの病態を理解する上で極めて重要な、完全な臓器状態での心機能の解析が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 心血管生理学
- 蛍光顕微鏡法
- 細胞イメージング技術
背景
- 心疾患に対処するためには、心機能を理解することが不可欠です。
- 従来の手法では、心臓のすべての領域に効果的にアクセスできない場合があります。
- 局所視野蛍光顕微鏡法は、心筋細胞を研究するための新たなアプローチを提供します。
- この技術は、心臓における細胞間結合の完全性を維持します。
研究目的
- 心臓における細胞内カルシウム濃度および膜電位を測定する。
- 病理学的条件下における心機能のメカニズムを探索する。
- 心停止や虚血などの心血管イベントに関する知見を提供する。
使用した方法
- 水平型ラングンドルフ装置の準備。
- シリンジへのタイロード溶液の充填。
- 装置内からの気泡の除去。
- 測定への分子プローブの利用。
主な結果
- 無傷の心臓における細胞変数の測定に成功。
- アクセスが困難な領域に対する本手法の有効性を実証。
- 心細胞の電気的および機械的特性に関する知見の獲得。
- 心臓疾患の理解における潜在的な応用可能性。
結論
- 局所場蛍光顕微鏡法は、心臓研究において非常に有用な手法です。
- この手法により、健康時および疾患時における心機能への理解が深まります。
- 今後の研究において、この技術を活用することで心血管健康に関するより深い知見が得られる可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
局所場蛍光顕微鏡法を用いることで、心臓の細胞間結合を維持したまま、無傷の心臓における細胞内カルシウム濃度および膜電位の測定が可能となり、虚血や不整脈の理解に不可欠な細胞間相互作用を保持できます。このアプローチは、電気的および機械的に結合した組織から生理学的に関連のあるデータを提供することで標的の妥当性確認をサポートし、前臨床モデルにおける予測信頼性を向上させます。また、本手法は心血管疾患研究において、分子シグナルを臓器全体の機能に結びつけることで、メカニズム解析によるリスク低減を促進します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 生理学的結合状態にある心筋組織において、カルシウム過渡応答および活動電位を測定することにより、治療仮説を検証します。
- 運用の価値： 単離細胞モデルでは組織レベルのダイナミクスを捉えられない、疾患関連システムにおける機能的なターゲット検証を可能にします。
- 予測的価値： 心内膜および心外膜領域において細胞内カルシウムキネティクスを正常化させる化合物を特定することで、ポートフォリオの選別（トリアージ）を支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：灌流心においてベースラインの蛍光信号を確立し、ダウンストリームスクリーニングに向けた検証済み生物学的システムを準備します。
- 定量的出力：化合物の効果を評価するため、カルシウムトランジェントキネティクスおよび活動電位持続時間の再現性のある測定値を生成します。
- プラットフォームの再利用：ラゲンドルフ灌流により、げっ歯類モデル間でのスケールアップをサポートし、心血管スクリーニングカスケードにおける一貫した信号取得を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：無心臓においてカルシウムハンドリングと再分極の領域的な差をモニタリングすることで、虚血および不整脈のメカニズムをモデル化します。
- トランスレーショナルな連続性：薬理学的介入中の電気的および代謝的共役を維持することにより、基礎研究と前臨床検証を橋渡しします。
- リスク調整後の意思決定：疾患組織と治療組織における活動電位の形態およびカルシウム一過性の定量可能な変化を通じて、進展基準に関する情報を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期のターゲット検証から前臨床評価に至るまでの心血管疾患研究のワークフローに組み込むことができ、生理学的なコンテキストを伴うシグナリングデータを提供することで、リード化合物の同定を支援します。
- 探索生物学：無傷の組織におけるコンパートメント特異的なカルシウム（細胞質 vs 筋小胞体）および膜電位を測定することで、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：心臓の電気生理学およびカルシウムハンドリングに対する化合物の影響を評価するための、安定した蛍光読み取りが可能なアッセイ準備済みサンプルを提供します。
- 分析：カルシウム一過性応答のピーク到達時間、活動電位持続時間、および相特異的な再分極指標など、群間比較のための定量的な従属変数を提供します。
- トランスレーショナル研究：分子レベルの測定値を臓器全体の機能に結びつけ、心機能不全の前臨床モデルにおけるバイオマーカーの整合性を可能にします。
- エンタープライズ再利用：標準化されたLangendorff法に基づく蛍光検出を通じて、複数の治療領域にわたる心血管系への影響を評価するための再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：心血管疾患モデルにおいて、細胞内シグナルと無傷の臓器生理学を相関させることで、メカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値：Langendorffシステムにおける染料の負荷、灌流、および光ファイバーの配置を標準化し、再現性を確保します。
- 戦略的価値：コストのかかる後期段階での失敗の前に、早期の電気生理学的およびカルシウムハンドリング上の問題点を特定することで、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：疾患心と救済心における標準化された活動電位およびカルシウム過渡応答キネティクスに基づき、化合物のリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 心臓の解剖、ランゲンドルフ灌流、および蛍光染料（Rhod-2 AM、di-8-ANEPPSなど）の調製に関する専門知識が必要です。
- ファイバー光学顕微鏡のセットアップ、刺激用の波形発生器、および高周波データ収集システム（10 kHz）に依存します。
- 信号の整合性を確保するため、生理学、イメージング、および薬理学の各チーム間での機能横断的な標準化が必要です。
- 壁貫通勾配を測定する場合、異なる種（マウス、オカメインコ）や心室領域（心外膜、心内膜）に応じた適応上の考慮事項が含まれます。
- 染料の負荷効率および灌流中のモーションアーティファクトによる制限があり、虚血や信号の劣化を防ぐためにこれらを制御する必要があります。
