Name: ローカルフィールド蛍光顕微鏡：無傷の心の中に携帯電話の信号のイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学ぶローカルフィールド蛍光顕微鏡法により、無傷の心臓で細胞内カルシウムと膜電位を測定する手法です。心停止や虚血などの心血管疾患のメカニズム解明に有用です。

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私たちは、提示の仕事の重要な議論のための博士アリシアMattiazziに感謝します。この作品は、ALEにNIH（R01 HL-084487）からの助成金によってサポートされていました。

このプロトコルは、すべてのマウスの取り扱いは、UCマーセド施設内動物管理使用委員会（第2008から201）によって承認されました。インコを用いた実験は、科学研究のためのベネズエラ研究所（IVIC）の科学委員会によって確立された動物の使用のための一般的なポリシーに従って、1999年に実施しました。 1.ランゲンドルフセットアップの準備<ol><li> 140のNaCl、5.4のKCl、2のCaCl 2、1のMgCl 2、0.33 HPO 4、10グルコース、10 HEPES 2のNa：MMで、次の溶質濃度を含むタイロード溶液を調製します。 NaOHで7.4にタイロード溶液のpHを調整し、0.22μmのフィルターを通してソリューションをフィルタリングします。 </li><li> 60 mLの注射器と水平ランゲンドルフセットアップ11、 図4に示す12の全てのチューブにタイロード溶液をロードします。すべての気泡を排除することを確認します。 </li><li><stroNG&gt;図4に示すように沈めプラスチック「エアストーン」を使用して、100％のO 2と平衡タイロード液。 <ol><li> O 2タンクにプラスチックチューブを接続します。 </li><li> 60 mLシリンジ中のタイロード溶液に5 &quot;チューブを下げるためにプラスチック製のティーアダプタを追加します。 </li><li>タイロード溶液中に2意志バブルうちOので、5 &quot;チューブの端部にプラスチック製のエアストーンを取り付けます。 </li></ol></li><li>カニューレとして使用する針の周りの非吸収性縫合糸を配置します。針は、異なるソリューションでレトロ灌流を可能にするマニホールド（ 図4参照）に接続されています。最後に、心臓の大動脈は、針にカニューレされます。 </li></ol> 2.動物の準備と心解剖<ol><li>頚椎脱臼により安楽死の前に計量し、注入マウスをヘパリン（体重20グラムの例：マウス、20単位または200μLに注入する）15分。麻酔インコ応じトン頸椎脱臼を進め、あなたのIACUCプロトコルの動物使用ガイドoおよび。 注：8週齢のマウスまたは20グラムのインコを使用してください。 </li><li> 安楽死の後の胸腔から心臓を取り出します。マウスについて説明したように全く同じようにインコの心を抽出します。 <ol><li>エタノールでマウスの胸をきれいにしてください。 </li><li>解剖ハサミを使用して、下腹部に切開を行い、その後、首に向かって側面をカット。 </li><li>切断組織を引いて、それを突き止めます。 </li><li>振動板をカットします。心臓の損傷を防ぐために、振動板をカットするときは注意してください。 </li><li>肺と周囲の組織を削除します。 </li><li>それを圧迫することなく、心をすくうためにピンセットを使用してください。できるだけ長く大動脈をカットします。 </li></ol></li><li>約1 mLのタイロード溶液で小さな計量ボートに乗って心を運びます。 </li><li>非吸収性縫合糸を使用して、経由して水平ランゲンドルフ装置上に大動脈を結びます針。 2細かいピンセットの助けを借りて、心臓大動脈を結びます。タイロード溶液を含む60 mLの注射器と直列に位置バルブを開くことにより、レトロ灌流を開始します。 </li><li>心臓を10分間安定化させます。血液や染料をロードする前に心臓を取り囲む脂肪組織をきれいにするために、この時間を使用します。ピンセットで心の底部近くの脂肪組織を引き、小さな解剖ハサミを用いて切断。解剖顕微鏡の視野の下にこれを行うにしてください。 </li></ol> 3.細胞質ゾルのCa 2+測定：染料Rhod-2AMの準備<ol><li>染料の50μgのを含む染料メーカーが提供する特別なパッケージ化されたプラスチックバイアルにDMSO中の20％のプルロニック（非イオン性界面活性剤）の20μLを追加します。 </li><li>泡を避け、ピペッティングにより混和します。 </li><li>透明なガラスバイアルに特別にパッケージプラスチックバイアルから非イオン性界面活性剤と混合し、DMSOおよび色素を転送します。タイロードソリューの1 mLを加え透明なガラスバイアルにる。 </li><li>バス超音波処理器で15〜20分間超音波処理。 </li><li> 室温で30分間、蠕動ポンプを使用して染料を灌流。 <ol><li>染料チャンバ内で染料を置きます。 </li><li>マニホールドに接続された他の全てのチューブラインを圧縮する機械的クランプを使用してください。クランプは、マニホールドの上方に配置されています。これは、60 mLのシリンジに接続チューブ内に任意の逆流を防止します。 </li><li>染料を循環開始する灌流蠕動ポンプをオンにします。すぐに60 mLシリンジ、以下の3ウェイバルブを閉じます。 </li><li>位置心臓内に灌流された染料を再循環するために、心臓の隣に吸引蠕動ポンプに接続されている小さなチューブ。 </li></ol></li></ol> 4.イントラ-SRのCa 2+測定：染料マグ-Fluo4AMの準備<ol><li> Rhod-2AMと同様にマグFluo4AMを準備します。段階的な手順については、セクション3を参照してください。 </li><li> AFTE染料をロードR、レトロ灌流を開始するタイロード溶液を含む60 mLの注射器と直列に配置さ弁を開きます。マニホールドの上にクランプを削除してください。 </li><li>水平室にタイロード溶液を加え、37℃まで温めます。 </li><li>細胞質ゾル色素を除去するために45分間のタイロード液でレトロ灌流。 </li></ol> 5.膜電位測定：色素ジ8-ANEPPSの準備<ol><li>染料5mgを含有する染料バイアルに99％エタノールを5mLを加えます。 </li><li>リピーターピペットを用いて、500個々の1mLのプラスチックバイアルにアリコート10μLを。 </li><li> -20℃で高速真空や店舗で乾燥します。 </li><li>乾燥染料10μgのプラスチックバイアルにDMSO中の20％のプルロニックの20μLを追加します。 </li><li>泡を避け、ピペッティングにより混和します。 </li><li>プラスチックバイアルからメスシリンダー（10ミリリットル）にプルロニックおよび染料でDMSOを含むミックスを転送します。最終Voにタイロード液を追加5ミリリットルのLUME。 </li><li>バス超音波処理器で20〜25分間超音波処理。 </li><li>蠕動ポンプを用いて30分間心に灌流します。 3.5節で段階的な手順を参照してください。 </li></ol> 6。心外膜の信号を記録<ol><li>色素をロードした後、マニホールドの上にクランプを除去することにより、タイロード溶液で心をレトロ灌流。タイロード溶液を含む60 mLの注射器と直列に位置バルブを開きます。心を安定させるために10分間レトロ散らすタイロード溶液。 </li><li>タイロード溶液で水平室を記入し、37℃に浴温度をもたらすためにペルチェユニットの電源をオンにします。 </li><li> 心臓の表面に光ファイバを配置します。 <ol><li> 2 mLのピペット内部に光ファイバを配置し、マイクロマニピュレーターにピペットを取り付けます。 </li><li>少しLVの表面に対して光ファイバを押すようにマイクロマニピュレーターを使用してください。 </li></ol></li><li> 外部ょんのペース波動発生器によって制御される刺激で室温。 <ol><li>プログラム1ミリ秒の幅矩形パルスを提供するために、波発生器。 </li><li>外部で同期をとるための刺激を設定し、波発生器への外部入力に接続します。 </li><li>刺激の各出力に、最後に半田付け鍼灸針で線を接続します。 </li><li>約3mm離間心尖の両方で鍼を置きます。 </li><li>針が組織内に配置された後にのみ、感電を防止するために、刺激の出力をオンにします。 </li></ol></li><li>取得ソフトウェアでは、10 kHzに取得頻度を調整します。 </li></ol> 7 。心内膜信号を記録<ol><li>色素をロードした後、心臓を安定させるために6.1および6.2のステップを参照してください。 </li><li>光ファイバのサイズに関する鋭い23Gaポイントを使用して、中隔に近いLVに心臓の表面に小さな穴を作ります。 </li> &lt;LI&gt;マイクロマニピュレーターを用いて、心内膜に第一の光ファイバの位置決めを支援するために硝子体内手術強膜切開アダプタを置きます。 </li><li>外部から心臓のペース。 6.4ステップを参照してください。 </li><li>取得ソフトウェアでは、10 kHzに取得頻度を調整します。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

本稿では、心筋細胞のex vivoでの機能を評価するために、ローカルフィールドの蛍光技術を説明するのに集中しています。接続された環境でのこれらの細胞の研究だけではなく、より生理的であるだけでなく、臓器レベルの病理を評価するための非常に適切です。興奮収縮連関（ECC）を基礎となる細胞事象は、細胞内Ca 2+動態（Rhod 2細胞質ゾルのCa 2+、マグFLUO4 SRのCa 2+）を監視分子プローブを用いた全臓器レベルで評価することができ、電気的活動（ジ-8- ANEPPS）。ここでは、双方が励起し、光ファイバを用いた蛍光指示薬からの発光を収集する3 LFFMエピ蛍光技術を提示しています。これらは、使用する光源と光変調のタイプに基づいて異なります。 PLFFMは、光パルスレーザーを使用していますLEDFMもPLEDFMでパルス化することができますLEDを使用しながらCLFFMは、連続レーザ光を使用しています。これらのすべて一組として、図1に示されているが、3つ落射蛍光アレンジメントのいずれか一方のみで構成することができます...

心臓は心臓血管系の中心的な器官です。心臓の収縮は、細胞内の[Ca 2+] iの増加によって開始されます。細胞内Ca 2+放出における電気的興奮と変化の関係は、歴史的に、酵素的に解離した細胞1、2で研究されています。しかし、心臓の細胞は、電気的であり、代謝的及び機械的に結合された3、4。単離された場合、筋細胞だけでなく、物理的にカップリングしていないですが、異なる層から筋細胞を解離5中に混合されます。また、電圧クランプ条件下で単離された細胞の研究から浮上している巨大な利点、6、7、8電気シンシチウムALWAとして心の本質的な性質にもかかわらず、YS組織3に存在するものから細胞を解離する方法を機能的に異なるという問題を提起します。 本稿では、我々は、無傷の心臓における局所電場蛍光顕微鏡（LFFM）技術の使用により、心臓生理学の知識で得られた進歩について説明します。 LFFMは、細胞質ゾルのCa 2+、イントラ筋小胞体（SR）のCa 2+および膜電位などの複数の生理学的変数を測定するための蛍光指示薬を使用しています。これらの測定は、同時に心室圧9に関連して10、心電図9、電気的活動電位（APS）、イオン電流の記録とケージド化合物4、11のフラッシュ光分解を得ることができます。また、これらの測定値は、近い高い周波数で無傷の心臓をペーシングすることによって得ることができます生理率rと。いくつかの記事9、11、12、13、14は LFFM技術を使用して、我々のグループによって公開されているが、この技術に関連した技術的な複雑の推定は、心臓や他の臓器におけるex vivoの生理現象を研究する上での大規模な使用を妨げてきました。 LFFM技術（ 図1）は、組織と接触しているマルチモード光ファイバを使用して得られたエピ蛍光測定値に基づいています。任意の接触の蛍光イメージング技術と同様に、光学的分解能は、ファイバの直径と開口数（NA）に依存します。ファイバのNAが高い小径の測定の空間分解能を増加させます。 NASおよび繊維径は、0.22から0.66まで、50ミクロンからそれぞれ1mmとの範囲とすることができます。にNAのしわは、より大きな立体角から到来する光子を受け入れることによって信号対雑音比（S / N）に信号を改善します。落射蛍光装置として機能させるために、光ビームは、非球面レンズまたはレンズとファイバ一致NA落射蛍光対物レンズで光ファイバに集光されます。このマッチングは、励起用およびフルオロフォアによって放出された光子をバック収集するためのエネルギー伝達を最大化します。 組織内にロードされた外因性の蛍光標識を励起するために、異なる光源及び照明モードを利用することができます。パルス局所視野蛍光顕微鏡3、12（PLFFM）を使用して我々の先駆的な研究では、低コストのピコ秒レーザー（ 図1a、PLFFM）を用います。光源のこのタイプは、実質的に起因する色素を漂白することなく、照明領域の下のフルオロフォア分子の励磁大きな画分の大きな利点を有しています短パルス持続時間12へ。また、超短パルスの使用は、色素12の蛍光寿命の評価を可能にしました。蛍光寿命は、Ca 2+に結合した色素分子の割合を定量化するために使用することができる特性です。残念なことに、パルス間の振幅のパルスと変動の時間的なジッタは、色素に結合するリガンドによって生じる蛍光の変化が大きい場合に、この実験ストラテジーの適用を制限します。 連続波（CW）レーザは、通常LFFM（ 図1b、CLFFM）の主照明源として使用されます。レーザビームは、連続的に、組織を照明することができるか、ferroelectrically調節することができます。ビームの強誘電体の変調は、光のマイクロ秒のパルスの生成を可能にします。この変調は、外部ハードウェアによって制御することができます。この手順では、劇的トンを低減するだけでなく彼の光パルスの時間的ジッタだけでなく、異なる波長の光を混合することができます。光の混合は、異なるレーザからの多重線によって行われます。結果として、異なるスペクトル特性を有する複数の色素は、例えば、生理学的変数の種々の測定を実行するために励起することができるRhod-2細胞質ゾルの Ca 2+のための、MagFluo4イントラSR の Ca 2+、ジ-8-ANEPPS用用膜電位。 LFFM光源としてレーザは、存在する種々の利点があるが、他のタイプの光源は、発光ダイオード（LED）などを用いることができます。この場合、励起光源は、InGaNのLED（ 図1c、PLEDFM）から成っていました。伝導帯から電子が価電子帯の正孔と再結合するときのLEDにおいて、光子が自然に放出されます。固体レーザとの違いは、発光が他の光子によって刺激されないことです。これは、非コヒーレントなビームをもたらすとLEDの広いスペクトル放射。 ハイパワーLEDの異なる種類を使用することができます。 Fluo-4またはマグのFluo-4を使用して記録ディ-8-ANEPPSを使用して、APの記録のためにおよびCa 2+過渡現象のために、我々は485nmの（青）で、典型的なピーク発光および20nmの半分の幅を有するLEDを使用しました（ 図1D）。 Rhod-2で記録した Ca 2+過渡現象のために、LEDは540nmの（緑）、35 nmの（ 図1D）の半分の幅で、典型的なピーク発光を有していました。 LEDは、バンドの波長で発光するので、それらのスペクトル放射を絞り込むためのフィルタを必要とします。また、パルス光は、20マイクロ秒の持続時間で1.6キロヘルツのレートで生成することができます。 LEDは、高速パワーMOSFET電界効果トランジスタを用いてパルスしました。異なる指標との同時記録は時間多重LEDによって行うことができます。残念ながら、LEDによって放射される光は、レーザ光に比べて光ファイバに集中することはより困難です。このように、私たちの主な欠点LEDをることは、それらの放出プロファイルは、メイン軸からの角度変位（±15°）を持っており、補助光学部品は、それを修正するために使用しなければならないことです。 前述の光学的構成のすべてにおいて、励起光は、ダイクロイックミラーを用いて反射されます。ビームは、その後、組織に配置されているマルチモード光ファイバに非球面レンズと顕微鏡対物レンズによって集束されます。任意の落射蛍光装置のように、ダイクロイックミラーは、また、放射された光から励起を分離するのに役立ちます。放出された光スペクトルは、任意の反射された励起を除去するために、バリアフィルタを通って戻って移動します。最後に、放出された光は光検出器（ 図1）上に目的に集束されます。 光から電流への変換は、シリコンアバランシェフォトダイオードによって実行されます。これらのダイオードは、高速応答、低光の検出を可能にする高感度を持っています。ザアバランシェフォトダイオードによって生成される光電流は、2つの方法で増幅することができる：トランスインピーダンス増幅器は、帰還抵抗素子（ 図1eの）を有するまたは電圧（ 図1F）に電流を変換する積分器。第一のアプローチを使用して、出力電圧は、光電流と帰還抵抗に比例します。ピコ秒レーザパルスの抵抗検出の典型的な例は、 図2a、2b及び2cに示されています。パネル2aは、トランスインピーダンスアンプの出力を示し、パネル2bは、アスタリスク（*）で示された区間の時間展開を示しています。ピーク追跡アルゴリズムは、蛍光応答12のピーク（赤）とベース（緑）を検出するために実装されました。ベース蛍光の測定は、周囲LIGによって導入アバランシェフォトダイオードの暗電流および干渉の両方の情報を提供しますHTと電磁結合。ピークと塩基の表現は、 図2cに示されています。この図は、鼓動しているインコの心臓の心周期中の Ca 2+に結合した色素（Rhod-2）が発する蛍光を示しています。 第二の方法では、積分器の出力電圧は、電流と容量性フィードバック（ 図2D、2E、及び2F）の関数です。 図2Fは、2つの連続した統合サイクルを示していますなし外部照明およびパルスLEDから照射された光パルスと第二と第一。詳細な説明は 、 図2Gおよび2Hに示されています。このアプローチは、より面倒が、によりフィードバックコンデンサにおける熱雑音が存在しないため、より大きなS / Nを提供します。機器は、励起光の全ての制御および多重化を生成し、ヘッドステージの統合及び解像度を指示するタイミング段階を含みますらの期間。これは、通常、データのオンライン回帰を計算することによって、統合された出力信号のデジタル分化を行うデジタル信号処理回路を用いて行われます。抵抗性フィードバックを用いた場合には、任意のA / D取得ボードを使用することができます。 最後に、我々のLFFM技術は、非常に汎用性であり、複数の領域から記録するように適合させることができます。光路中にビームスプリッタを追加すると、私たちは2本の光ファイバに光を分割することができます。各光ファイバは、その後、外因性の蛍光プローブから、独立して、励起する組織と記録放出の異なる領域に配置することができます。この変更は、生理学的変数にどのように影響するかを解剖学的な地域差を評価するために私達を許可します。 図3は、2本の光ファイバを経電気または細胞内の[Ca 2+] iレベルのウィットを測定するために使用されるようにCW励起光を分割するために使用されるビームスプリッタを示します時間マイナー侵襲。経た信号は、1つの心内膜上のファイバと心室壁の心外膜層の上に他方を配置することによって記録することができます。したがって、LFFM技術は、異なる領域における細胞シグナルの経時変化を測定する能力を有しており、地域の変化は、病理学的状況で起こるかどうかをテストするために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Σ</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>Σ</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Σ</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Σ</td><td></td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム溶液</td><td>Σ</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム溶液</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S-8045</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu;mナイロンメンブレン</td><td>フィルターWhatman</td><td>7402-004</td><td></td></tr><tr><td>マニホールドMPP</td><td>ワー</td><td>ナー64-0216&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5精密グライドニードル</td><td>B-D</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>ブラック編組シルクストリング(非吸収性外科用縫合糸)</td><td>AllMech Tech</td><td>LOOK-SP105</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム注射1000USP / mL</td><td>AllMech Tech</td><td>NDC63323-540-11</td><td></td></tr><tr><td>DMSO D8779</td>シ<td>グマ</td><td>67-68-5</td><td></td></tr>ブレ<tr><td>ビスタチン</td><td>シグマ</td><td>856925-71-8</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 20% solution</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td></td></tr><tr><td>Materflex C/L 蠕動ポンプ</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-26</td><td></td></tr><tr><td>アイソスティム刺激装置</td><td>World Precision Instruments</td><td>A320RC</td><td></td></tr><tr><td>波形発生器</td><td>Teledyne Lecroy</td><td>WaveStation 2012</td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄機 FS20</td><td>Fisher Scientific</td><td>1533530</td><td></td></tr><tr><td>タイゴンチューブ ID:1/32インチ 外径:3/32インチ 壁 1/32インチ</td> <td>部品供給</td><td>TET-031A</td><td></td></tr><tr><td>タイゴンチューブ ID:3/32インチ 外径:5/32インチ 壁 1/32インチ</td> <td>部品供給</td><td>TET-094A</td><td></td></tr><tr><td>アダプター ルアーロック 3ウェイバルブ</td><td>コールパーマー</td><td>EW-31200-80</td><td></td></tr><tr><td>ティーアダプターとプラスチック継手</td><td>コールパーマー</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>プラスチッククランプ</td><td>WaterZoo</td><td>2465</td><td></td></tr><tr><td>ペルチェ</td><td>TE テクノロジー</td><td>TE-127-2.0-2.5</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2AM</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>R1245MP</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4AM</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>M14206</td><td></td></tr><tr><td>鍼灸針</td><td>LHASA</td><td>TC1.20x13</td><td></td></tr><tr><td>60 mL BDシリンジ、ルアーロック付き</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speed vacuum Eppendorf Vagufuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td></td></tr><tr><td>デジタル信号処理回路 DSP TMS 320</td><td>Texas Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Longpass Dichroic mirror 567 nm</td><td>ThorLabs</td><td>DMLP567L</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl 標準対物レンズ</td><td>Edmund Optics</td><td>Stock# 33-437</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ 20X NA 0.40 DIN アクロマティック有限国際標準対物レンズ</td><td>Edmund Optics</td><td>ストック# 33-438</td><td></td></tr><tr><td>ロングパス色ガラスフィルター 590 nm&nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>FGL590</td><td></td></tr><tr><td>グリーン Nd-YAG レーザー 532 nm、500 mW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td>、<td>レーザー Siskiyou</td><td>MX130R</td><td></td></tr><tr><td>マルチモード 光ファイバー 200 & マイクロ用。m NA 0.39</td><td>ThorLabs</td><td>FT200UMT</td><td></td></tr><tr><td>LED 青色</td><td>Lumileds</td><td>L135-B475003500000</td><td></td></tr><tr><td>LED 緑色</td><td>Lumileds</td><td>L135-G525003500000</td><td></td></tr><tr><td>キューブ ビームスプリッター、非偏光</td><td>ThorLabs</td><td>BS007</td><td></td></tr><tr><td>36" 長さ、ダブテール光学レール</td><td>Edmund Optics</td><td>54-402</td><td></td></tr><tr><td>2.5" 幅、ダブテールキャリア</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>54-404</td><td></td></tr><tr><td>0.75インチ トラベル、マイクロメータステージ</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>37-983</td><td></td></tr><tr><td>ダブテール光学レール 3インチ</td> <td>ThorLabs</td><td>RLA075/M</td><td></td></tr><tr><td>ダブテールレールキャリア 1インチ</td> <td>ThorLabs</td><td>RC1</td><td></td></tr><tr><td>アバランチフォトダイオード ヘリックス 902</td><td>Digi-Key</td><td>HELIX-902-200</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズホルダー XYトランスレータ&nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>ST1XY-S</td><td></td></tr><tr><td>アルミブレッドボード 6インチ x 6インチ</td> <td>ThorLabs</td><td>MB6</td><td></td></tr><tr><td>ネクサス otpical テーブル 4インチ x 6インチ</td> <td>ThorLabs</td><td>T46HK</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス製キャップネジ</td><td>ThorLabs</td><td>HW-KIT5/M</td><td></td></tr><tr><td>アクリル&nbsp; シート</td><td>ホームデポ/ロウズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シルガード シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td>シルガード184</td><td></td></tr><tr><td>エポキシゲル&nbsp;</td><td>ウォルマート/ホームデポ</td><td>2部構成 5分 clr 1oz</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 精密グライドニードル</td><td>B-D</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>23G 精密グライドニードル</td><td>B-D</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>取り付けベース、25 mm x 75 mm x 10 mm</td><td>ThorLabs</td><td>BA1/M</td><td></td></tr><tr><td>ワイヤーシェルフポスト 36インチ</td><td>アレラ</td><td>AALESW59PO36SR</td><td></td></tr><tr><td>ワイヤーシェルフ</td><td>アレラ</td><td>ALESW582424SR</td><td></td></tr><tr><td>ポストとアングルクランプ</td><td>ThorLabs</td><td>SWC/M-P5</td><td></td></tr><tr><td>染料チャンバー用ガラスシリンジ</td><td>ウィートン</td><td>W851020</td><td></td></tr><tr><td>ラバーストッパー</td><td>ホームサイエンスツール</td><td>CE-STOP01C</td><td></td></tr></tbody></table>

ローカルフィールド蛍光顕微鏡：無傷の心の中に携帯電話の信号のイメージング

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

心臓では、分子シグナリング研究は、通常、単離された筋細胞で行われています。しかしながら、このような虚血および不整脈などの多くの病的状態は、完全に全臓器レベルで理解することができます。ここでは、無傷の心の中の細胞の信号の測定を可能にするローカルフィールド蛍光顕微鏡（LFFM）の分光技術を提示します。技術は、蛍光シグナルを記録するランゲンドルフ灌流心臓および光ファイバの組み合わせに基づいています。 LFFMは正常および病的条件下で心を勉強する心血管生理学の分野で様々な用途があります。複数の心臓の変数は異なる蛍光指示薬を用いてモニターすることができます。これらは、細胞質ゾルの[Ca 2+]、イントラ筋小胞体の[Ca 2+]および膜電位が含まれます。外因性蛍光プローブが励起され、放出される蛍光はLFFM落射蛍光技術の三つの異なるアレンジで検出します本論文での。これらの技術の中で中心的な違いは、励起用の励起光が変調されている方法で使用される光源の種類です。連続波LFFM（CLFFM）は、励起用の連続レーザ光を使用しながら、パルスLFFM（PLFFM）は、レーザ光パルスを使用しています。最後に、発光ダイオード（LED）は、第3の光源として使用しました。この非コヒーレント構成は、パルス状のLED蛍光顕微鏡（PLEDFM）と呼ばれています。

心内膜および心外膜における APおよびCa 2+ 過渡現象 心室壁を横切って信号を比較するためには、光ファイバは、心外膜での心内膜及び他方に配置されています。心外膜からのものと心内膜から記録されたAPの形態を比較すると、貫機能を評価するための最良の方法です。心室壁は非常に不均質であり、したがって、APの形態は、これらの二つの領域で非常に異なっています。よく心内膜があまりI の心外膜17、18、19以上を有することが知られています。あまり私は心内膜<s...

心臓では、分子事象は器官の電気的および収縮機能を調整します。ここで紹介する地元の視野蛍光顕微鏡技術のセットは、無傷の心の中の細胞の変数の記録を可能にします。心機能を定義するメカニズムを識別することは心が病的な状況下でどのように機能するかを理解する上で重要です。

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

この局所電場蛍光顕微鏡イメージング技術の全体的な目的は、分子プローブを用いて、心臓全体レベルではアクセスが困難な心臓領域における細胞内カルシウム濃度または膜電位を測定することです。この手法は、心停止や虚血に関連する心血管系の重要な疑問を解明するのに役立ちます。本技術の主な利点は、細胞が電気的、機械的、および代謝的に結合したままの状態である無傷の臓器において、細胞レベルのイベントから心臓の特性を測定できることです。まず、水平型ランゲンドルフ装置を準備します。新しく調製したTyrode溶液を60 milliliterシリンジに充填し、装置に関連するすべてのチューブを取り付けます。充填後、すべての気泡を取り除きます。次に、水中に設置したプラスチック製エアストーンから純酸素ガスを供給し、充填液を平衡化させます。続いて、針に吸収性のない手術用縫合糸を巻き付けます。これは、装置に取り付けた際に心臓を逆灌流するためのカニューレとして使用します。次に、ヘパリンを投与し、動物を安楽死させた後に心臓を採取します。まず、胸部をエタノールで清浄します。デモンストレーションではマウスを使用していますが、同じ手順でインコなどの心臓採取も可能です。次に、解剖用ハサミを使用して、下腹部を切開し、そこから頸部に向かって側面に沿って切り上げます。その後、心臓を避けて慎重に横隔膜を切開します。切り開いた組織を後方に引き、ピンで固定します。次に、肺と周囲の組織を取り除き、心臓を露出させます。心臓が露出したら、ピンセットを用いて、心臓を圧迫しないように慎重に掻き出します。大動脈を切断して動物から切り離し、可能な限り多くの大動脈を心臓に付けたままにしておきます。次に、心臓を1 mLのTyrode溶液とともに小型の秤量皿に載せます。解剖顕微鏡下で、ピンセットとハサミを用いて、血液および心臓周囲の脂肪組織を迅速に取り除きます。非吸収性手術縫合糸と針を使用し、大動脈をLangendorff装置の水平コネクタに固定します。2本の微細ピンセットを使用して結紮を固定します。次に、バルブを開いてTyrode溶液を流し、後方還流を開始します。心臓が10分間安定するまで、周囲の組織を洗浄し、破片を吸引して水平チャンバー内を清潔に保ちます。染料を調製します。Rhod-2 AMの場合、メーカー提供の50 microgramの染料パッケージに、20% PluronicおよびDMSOを20 microliters加えます。気泡が入らないように注意しながら、ピペッティングにより混合します。次に、液状にした染料を透明なガラスバイアルに移し、Tyrode溶液を1 mL加えます。超音波処理を15～20分間行い、この混合液中で染料を完全に溶解させます。その後、ペリスタルティックポンプを用いて、調製した染料を室温で灌流させます。まず、染色液を染色チャンバーに充填します。次に、マニホールドに接続されているすべてのチューブラインをクランプし、逆流を防ぐためにクランプをマニホールドより上に配置します。続いて、ポンプの電源を入れ、直ちに60 mLシリンジの下にある三方コックを閉じます。ポンプの吸引端に取り付けられた細いチューブを心臓の横に配置し、灌流後の染色液を再循環させます。細ゲージの針を用いて心尖部を刺し、圧力を開放します。その後、染料で心臓を30分間灌流させます。この際、気泡が組織内に混入すると虚血や組織損傷の原因となるため、染料の液面を慎重に確認することが非常に重要です。色素を灌流させた後、心臓をTyrode溶液で逆灌流します。マニホールド上のクランプを取り除きます。バルブを開き、心臓を10分間安定させます。逆灌流の間、水平チャンバーにTyrode溶液を満たし、ペルチェユニットをオンにしてバス温度を37°Cに調整します。実験用の光ファイバーを準備するため、まず光ファイバーを2 mLピペットの中に入れます。その後、ピペットをマイクロマニピュレーターに取り付けます。マイクロマニピュレーターを使用して、光ファイバーを側脳室の表面に軽く押し当てます。次に、波形発生装置をプログラムし、パルス幅1 msの方形波を発生させます。そして、心刺激装置を外部同期設定にし、波形発生装置に接続します。2つの刺激装置の各出力端子に、先端に鍼をはんだ付けした電線を接続します。心尖部に、約3 mmの間隔をあけて2本の鍼を刺入します。偶発的な電気ショックを避けるため、鍼を配置した後にのみ刺激装置を起動させてください。次に、心外膜信号を記録するため、ソフトウェアのサンプリング周波数を10 kilohertzに調整します。心内膜信号を収集する場合は、同様の手順に従いますが、23ゲージの針を用いて中隔付近の側室に穴を開けます。その後、マイクロマニピュレーターを使用して、2本目の光ファイバーを心内膜内に配置します。壁貫通機能を解析するため、心内膜および心外膜から記録した活動電位の形態を比較した。CLFFM法を用い、di-8-ANEPPSで心臓を処理した後に蛍光記録を行った。活動電位は心内膜において、特に第1相で緩徐であった。活動電位の持続時間は、活動電位がある程度まで再分極するのに要する時間として定義した。持続時間を正規化し、ゼロ位相で重なるようにシフトさせることで、比較が可能となった。その結果、第1相において有意な差が認められた。次に、細胞内カルシウムをモニターするためにRhod-2 AMを使用しました。細胞内カルシウムの領域差を比較するため、カルシウム過渡応答のキネティクスを評価しました。比較の結果、過渡応答のピークに達するまでの時間は、心内膜において約2ミリ秒長くなっていました。全体として、心内膜からのカルシウム・トランジェンスは心外膜よりも有意に遅いキネティクスを示しました。この手法を習得すれば、心臓内でアクセスが困難な領域における細胞内カルシウム・トランジェンスおよび活動電位の記録に使用できます。セットアップにLangendorff装置を組み込んでいるため、心臓にさまざまな化学物質を灌流させ、心機能への影響を評価することが非常に容易になります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この記事では、電位差色素（ジ- 8 -...

ランゲンドルフ灌流ラット心臓の光学的マッピング

共焦点走査顕微鏡は、生きた動物における灌流心臓または骨格筋​​におけるミトコンドリアの単一のイベントを画像化するために適用される。スーパーオキシドが点滅し、膜電位の変動などの単一ミトコンドリアのプロセスのリアルタイム監視は、生理学的に関連するコンテキストでかつ病理学的摂動の間、ミトコンドリア機能の評価が可能。...

シングルミトコンドリアスーパーオキシド無傷ハートや点滅の共焦点イメージングインビボ

私たちは、無傷の胚および出生後の心臓の奥深くにある蛍光タンパク質標識細胞を体積的に画像化するプロトコルを記述します。組織透明化法とホールマウント染色を併用することで、胚性または出生後の心臓内の単一蛍光タンパク質標識細胞を鮮明かつ正確にイメージングすることができます。...

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ここでは、CD11c.DTRマウスの気管内ジフテリア毒素処理によって誘発される、無菌性劇症性心筋炎のネズミモデルにおける心臓のCD45 +白血球浸潤を視覚化するための薄片顕微鏡法を説明する。...

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

この研究は、マウスの心を研究するのに光クリアと組み合わせて両面イルミネーション ライト シート蛍光顕微鏡 (LSFM)...

マウス心臓の研究のための光シート蛍光顕微鏡

ここでは、心壁全体で吸光度分光法を行うために、心内光カテーテルを通して心臓に注入された心臓に使用する方法を紹介する。得られたデータは、組織の酸素張力に関する堅牢な情報だけでなく、基板利用と膜電位に関する堅牢な情報を、このユビキタスな調製における心臓性能測定と同時に提供します。...

浸透哺乳動物の心臓のトランスムラル吸光分光法を用いた細胞代謝モニタリングのための心臓内側発射光カテーテル

マウス筋細胞の単離の方法論と、同時デジタル細胞幾何学的測定と蛍光光光測定を用いたサルコメア短縮トレースと同時に電圧またはカルシウムの痕跡を得る方法を提示する。...

単離マウス心室筋細胞の光学イメージング

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ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

我々は、組織形質転換と染色の新たな進歩と軸走査型ライトシート顕微鏡の開発を組み合わせることにより、マウス心臓全体のメゾスコピック再構成法を報告する。...

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げっ歯類の心臓の構造を明らかにするためのライトシートイメージング

再灌流性急性心筋梗塞 (repAMI) における心臓損傷の 3 次元 (3D)...

ライトシート蛍光顕微鏡を用いた再灌流急性心筋梗塞における心臓損傷と免疫応答の同時3D解析

学ぶローカルフィールド蛍光顕微鏡法により、無傷の心臓で細胞内カルシウムと膜電位を測定する手法です。心停止や虚血などの心血管疾患のメカニズム解明に有用です。

ローカルフィールド蛍光顕微鏡：無傷の心の中に携帯電話の信号のイメージング

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