ゼブラフィッシュにおける高血糖症の急性および慢性モデル：高血糖が神経新生および放射性標識分子の生体内分布に及ぼす影響を評価する方法

次の手順の全体的な目標は、高血糖状態での脳のリモデリングを評価し、ゼブラフィッシュの放射線標識分子を追跡することです。高血糖症は、血糖値が過剰に摂取されることを特徴としています。慢性高血糖症は、糖尿病の状態が原因である可能性があり、さまざまな血管機能障害を引き起こし、心筋梗塞、脳卒中、糖尿病性足潰瘍などの臨床的合併症を引き起こす可能性があります。

また、ストレスによる急性高血糖は、虚血性脳卒中における出血性合併症を促進する可能性があります。ゼブラフィッシュは、ヒトの病気とその中枢神経系への影響を理解するための興味深いモデルです。成魚の脳は、哺乳類と比較して、強い神経原性能力と脳修復メカニズムの優れた能力を示すことを考えると、ゼブラフィッシュは急性および高血糖条件下でのストレス後の脳リモデリングを調査するための優れたモデルであることから、特に真実です。

また、放射性標識分子の生体内分布や潜在的な治療薬の調査も可能になります。すべての実験は、研究における動物の使用に関するフランスおよびヨーロッパのコミュニティガイドラインに従って実施され、動物実験に関する地元の倫理委員会によって承認されました。魚網で優しく魚を捕まえます。

魚を少量のトリカイン麻酔薬に入れ、水中の最終濃度0.02%に希釈します。.魚の動きが止まるまで待ちます。カットピペットを使用して魚を取り除き、吸収性のあるティッシュペーパーにそっと置いて、最大限に水分を取り除きます。

体重1キロあたり2.5グラムの50マイクロリットルの注射器を注射用のd-グルコースの注射器を準備するために魚の重さを量ります。たとえば、0.6グラムの魚は、50マイクロリットルの3%d-グルコースPBS溶液を受け取ります。魚を背中に乗せ、片手で手入れします。

一方、シリンジの針を腹腔内に挿入し、d-グルコースPBS溶液をゆっくりと注入します。針を取り外し、魚を魚の水に戻します。魚が完全に回復するまで魚を確認してください。

彼らの血糖値は通常、1時間半後に測定されます。慢性的な高血糖を模倣するために、最終濃度が111ミリモルのd-グルコースの2リットルタンクを準備します。このためには、40グラムのd-グルコースを量り、空のタンクに入れます。

タンクに2リットルの魚の水を入れ、最大7匹の魚を入れます。細菌や他の微生物の増殖を避けるために、2日ごとにブドウ糖溶液を交換してください。慢性高血糖は、d-グルコースによる14日間の治療によって得られます。

魚網で魚を捕まえ、氷の上に置きます。迅速な安楽死のために魚を氷で覆います。血液サンプルを希釈する可能性のある水滴を取り除くために、魚を取り、拭きます。

解剖鉗子で眼球を摘出し、眼腔が血液で満たされるまで待ちます。血糖値計にテストストリップを置き、ストリップを目の空洞に挿入します。血糖値の値をメモします。

急性高血糖症の場合、d-グルコースの腹腔内注射は、注射の1時間半後に示されているように、血糖値の有意な上昇を誘発する。慢性高血糖症の場合、魚をd-グルコース溶液に浸すと、14日間の治療後に示されるように、血糖値が有意に上昇します。手順の最後に、解剖ハサミで体を頭から分離し、免疫組織化学実験のためにPBSで希釈したパラホルムアルデヒドの4%に頭を入れます。

摂氏4度で一晩インキュベートします。あるいは、脳を直接抽出し、mRNA抽出などの他の実験のために凍結することもできます。翌日、固定ヘッドをPBSですすぎ、解剖顕微鏡下で針で維持します。

残った目を切除し、頭蓋骨の上部を鉗子で優しく開きます。次に、脳を慎重に抽出し、1x PBSに入れます。固定された脳は、一連のエタノール濃度の増加と、それに続くトルエンの30分間の入浴を2回行うことで、段階的に脱水されます。

次に、脳を埋め込みカセットに入れ、蓋を慎重に閉じます。カセットを溶かしたパラフィンに58〜60°Cで入れます。脳のパラフィン包埋中に、加温包入鉗子をオンにします。

カセットを清潔なパラフィンバスに入れます。パラフィン浴が終わったら、カセットを取り出します。流動パラフィンを型に流し込みます。

カセットを開けて、型の中で溶かしたパラフィンの中に脳を入れます。温めるインクルージョン鉗子で脳を向き合わせます。溶かしたパラフィンを型に充填し、埋め込み機の冷却部分で硬化させます。

技術的な理由から、脳は前後軸に従って配置する必要があります。パラフィンブロックを型から外した後、切り抜き、パラフィンを溶かしたカセットに正しい向きで固定し、横切片化を可能にします。パラフィンブロックをミクロトームのアームに挿入し、脳サンプルレベルに達するまで50マイクロメートル切片を切断します。

次に、パラフィンブロックをトリミングしてブランコを取得し、切片の厚さを7マイクロメートルに調整します。パラフィンリボンを細い絵筆で集め、黒い紙の上に置きます。パラフィンリボンを3〜4セクションごとにカットします。

温め皿の上に滑り台を置き、蒸留水で覆います。水面の部分をスライドにそっと置き、摂氏40度まで温めます。パラフィンリボンが十分に広がったら、吸収性組織で水分を取り除きます。

図のように、最後の一滴は機械的に取り除かれます。スライドを少なくとも2時間乾燥させてから、プロトコルに記載されている免疫組織化学手順を実行します。免疫組織化学の後、スライドを落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で分析し、高血糖が脳細胞の増殖に及ぼす影響を研究します。

脳細胞の定量化は、少なくとも3つの連続したセクション、または関心のある領域で行われます。ここでは、PCNA陽性細胞に対応する増殖細胞が緑色で現れます。ご覧のとおり、慢性高血糖症は、腹側終脳、背側終脳、尾側視床下部の外側および後部のくぼみの周りで、PCNA抗体で緑色で標識された増殖細胞の数の減少を誘発します。

あるいは、損傷誘発性神経新生に対する高血糖の影響を研究するために、終脳の刺し傷傷を慢性高血糖治療中に実施することができる。このためには、7日間処理した魚に麻酔をかけ、それを解剖顕微鏡の下に置きます。30ゲージの注射器を頭蓋骨を垂直に押し込み、右大脳半球の中央に押し込みます。

この手順の後、魚は必要な時間そのタンクに戻されるべきです。ここでは、魚は犠牲にされる前に、d-グルコース水で7日間生き残ることを許されました。終脳の刺し傷損傷は、病変後7日で損傷した半球の増殖を強力にアップレギュレートします。

私たちのデータは、慢性高血糖が終脳の刺し傷後の細胞増殖を減少させることにより、脳治癒プロセスの大幅な減少を誘発することを示しています。ゼブラフィッシュは、放射性標識分子の生体内分布の研究にも使用できます。ここでは、ゼブラフィッシュの体内の糖代謝について調べることにしました。

魚は最初に麻酔をかけ、麻酔薬を染み込ませた組織の上に置く必要があります。その後、魚はラジオ保護窓の後ろに置かれます。50マイクロリットルのフルオロデオキシグルコースを含有する注射器を調製する。

魚を仰向けにして、20メガベクレルで50マイクロリットルのFDGを腹腔内に注射します。次に、魚を麻酔薬に浸した別のティッシュに置きます。それは優しく包み込まれ、PETスキャンイメージャーのアームに配置されます。

アームをPETスキャンに挿入し、イメージング手順を実行します。ここでは、FDGが注射部位だけでなく、魚の頭、特に脳内、および脊髄全体でも検出されることに注意してください。この研究では、ゼブラフィッシュの急性および慢性の高血糖を確立するための2つの異なる方法を提供し、高血糖が正常および損傷誘発条件下で脳細胞の増殖を損なうことを示しています。

結論として、ゼブラフィッシュは、中枢神経系における高血糖の有害な影響を調査するための関連モデルとして使用できます。また、PETスキャンによる放射性標識分子の生体内分布の評価も可能です。