ゼブラフィッシュにおける高血糖症の急性および慢性モデル：高血糖が神経新生および放射性標識分子の生体内分布に及ぼす影響を評価する方法

本手順の全体的な目的は、高血糖条件下における脳のリモデリングを評価し、ゼブラフィッシュにおける放射性標識分子を追跡することである。高血糖は、血中のグルコース濃度が過剰であることによって特徴づけられる。慢性的な高血糖は糖尿病などの疾患に起因する場合があり、さまざまな血管機能不全を引き起こし、それがさらに心筋梗塞、脳卒中、あるいは糖尿病性足潰瘍などの臨床的合併症を誘発する可能性がある。

また、ストレスによる急性の高血糖は、虚血性脳卒中における出血性合併症を促進させる可能性があります。ゼブラフィッシュは、ヒトの疾患およびそれが中枢神経系に及ぼす影響を理解するための興味深いモデルです。特に、成魚の脳は哺乳類と比較して強力な神経新生能と優れた脳修復メカニズムを有しているため、ゼブラフィッシュは、急性および高血糖条件下でのストレス後における脳のリモデリングを調査するための優れたモデルとなります。

また、放射標識分子や潜在的な治療剤の生体内分布を調査することも可能です。すべての実験は、研究における動物の使用に関するフランスおよび欧州共同体のガイドラインに従って実施され、地域の動物実験倫理委員会の承認を得ています。魚網を用いて、魚を静かに捕獲します。

魚を、最終濃度0.02%に希釈したトリカイン麻酔液の少量の溶液に入れます。魚の動きが止まるまで待ちます。カットピペットを用いて魚を取り出し、水分を最大限に除去するため、吸水性のあるティッシュペーパーの上にそっと置きます。

注射用のd-glucoseシリンジを準備するため、魚の体重を測定し、体重1kgあたり2.5gとなるように50µL分を調製します。例えば、体重0.6gの魚には、3% d-glucose PBS溶液を50µL投与します。魚を仰向けにし、片手で固定します。

もう一方の手で、シリンジの針を腹腔内に挿入し、d-glucose PBS溶液をゆっくりと注入します。針を抜き、魚を飼育水に戻します。魚が完全に回復するまで観察してください。

通常、1 1/2時間後に血糖値を測定します。慢性高血糖を模倣するため、最終濃度111 millimolarのd-glucoseを2リットルのタンクで調製します。このため、40 gramsのd-glucoseを量り取り、空のタンクに入れます。

タンクに2 Lの魚用飼育水を満たし、最大7匹の魚を入れます。細菌やその他の微生物の増殖を避けるため、グルコース溶液を2日ごとに交換してください。d-glucoseを用いて14日間処理することで、慢性高血糖状態を誘導します。

魚をタモネットで捕獲し、氷の上に置きます。迅速な安楽死させるため、魚を氷で覆います。魚を取り出して拭き上げ、血液検体を希釈させる原因となる水滴を除去します。

解剖用ピンセットで眼球を除去し、眼窩に血液が充満するまで待ちます。血糖測定器にテストストリップをセットし、そのストリップを眼窩に挿入します。血糖値を確認し、記録します。

急性高血糖を誘導するために、d-glucoseを腹腔内投与すると、図に示すように、投与から1 1/2時間後に血糖値が有意に上昇します。慢性高血糖を誘導するために、魚をd-glucose溶液に浸漬させると、図に示すように、14日間の処置後に血糖値が有意に上昇します。処置の最後に、解剖用ハサミで頭部と胴体を分離し、免疫組織化学実験のために、PBSで希釈した4% パラホルムアルデヒドに頭部を浸漬させます。

4°Cで一晩インキュベートします。あるいは、脳を直接摘出して凍結し、mRNA抽出などの他の実験に使用することも可能です。翌日、固定した頭部をPBSで洗浄し、解剖顕微鏡下でニードルを用いて保持します。

残りの眼球を摘出し、ピンセットで頭蓋骨の上部を慎重に開きます。その後、脳を注意深く取り出し、1x PBSに浸します。固定済みの脳は、エタノール濃度を段階的に上げて脱水し、続いてトルエンで30分間の浸漬を2回行います。

次に、脳を包埋カセットに入れ、蓋を慎重に閉じます。カセットを58〜60 °Cに溶かしたパラフィンに入れます。脳のパラフィン包埋を行う際は、ウォーミング・インクルージョン・フォープス（加温包埋鉗子）の電源を入れてください。

カセットを清潔なパラフィンバスに入れます。パラフィン処理が終了したら、カセットを取り出します。モールドに液状パラフィンを注ぎます。

カセットを開け、溶融パラフィンが入ったモールドに脳を配置します。ウォーミングインクルージョン鉗子を用いて脳の向きを調整します。モールドを溶融パラフィンで満たし、包埋機の冷却部で硬化させます。

技術的な理由から、脳は前後軸に従って配置する必要があります。パラフィンブロックを脱型した後、トリミングし、横断切片を作成できる適切な方向で、溶かしたパラフィンを用いてカセットに固定します。パラフィンブロックをミクロトームのアームに装着し、脳サンプルのレベルに達するまで50 µmの厚さで切片を作成します。

次に、パラフィンブロックをトリミングして台形に整え、切片の厚さを7 µmに調整します。細い絵筆でパラフィンリボンを回収し、黒い紙の上に載せます。パラフィンリボンを3〜4切片ごとに切り分けます。

スライドをウォーミングプレートに置き、蒸留水で覆います。切片をスライド上の水面にそっと配置し、40 °Cまで温めます。パラフィンリボンが十分に広がったら、吸水性のティッシュで水分を取り除きます。

図に示すように、最後の数滴を機械的に取り除きます。プロトコルに記載されている免疫組織化学の手順を行う前に、スライドを少なくとも2時間乾燥させてください。免疫組織化学の後、高血糖が脳細胞の増殖に及ぼす影響を調べるため、エピ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いてスライドを解析します。

脳細胞の定量は、少なくとも3枚の連続切片、または関心領域に対して行われます。ここでは、PCNA陽性細胞に相当する増殖細胞が緑色に表示されています。見ての通り、慢性高血糖は、腹側終脳、背側終脳、および外側および後方陥凹周辺の尾側視床下部において、PCNA抗体で緑色に標識された増殖細胞数の減少を誘導します。

あるいは、高血糖が損傷誘発性神経新生に及ぼす影響を調べるために、慢性的な高血糖処置の間に終脳の刺創損傷を行うことができます。このため、7日間の処置を行った魚を麻酔し、解剖顕微鏡下に置きます。30ゲージの注射針を頭蓋骨を通して垂直に押し込み、右終脳半球の中心に刺入します。

この手順の後、魚を規定の時間、水槽に戻します。本実験では、魚をd-glucose水中で7日間生存させた後、安楽死させました。終脳への刺創は、病変から7日後、損傷した半球において増殖を強力に亢進させます。

我々のデータは、慢性的な高血糖が終脳の刺傷後の細胞増殖を減少させることで、脳の治癒過程を著しく低下させることを示しています。ゼブラフィッシュは、放射標識分子の生体内分布の研究にも利用可能です。そこで本研究では、ゼブラフィッシュ個体におけるグルコース代謝を検討することにしました。

まず魚を麻酔し、麻酔剤に浸した組織の上に置きます。次に、魚を放射線防護窓の背後に配置します。50 µLのフルオロデオキシグルコースを含むシリンジを準備します。

魚を仰向けに固定し、20 MBqのFDG 50 µLを腹腔内注射します。その後、魚を麻酔剤を染み込ませた別の組織の上に置きます。緩やかに包み、PETスキャナーのアーム上に配置します。

腕をPETスキャナーに挿入し、撮像手順を行います。ここでは、FDGが注入部位だけでなく、魚の頭部（特に脳）や脊髄全体においても検出されることがわかります。本研究では、ゼブラフィッシュにおいて急性および慢性の高血糖状態を確立するための2つの異なる方法を提示し、高血糖が正常時および損傷誘発時の脳細胞増殖を阻害することを示します。

結論として、ゼブラフィッシュは中枢神経系における高血糖の有害な影響を調査するための適切なモデルとして利用可能です。また、PETスキャンを用いることで、放射標識分子の体内分布を評価することも可能です。