Name: 表面上のヒトノロウイルスの検出のためのスワブサンプリング方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学ぶマクロフォームスワブサンプリング法による環境表面のノロウイルス検出と定量手法。広範囲な表面からのウイルス回収率向上と、感染症流行調査への応用価値を解説します。

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フィールド1.スワブサンプリング<ol><li>手袋のきれいなペアを着用してください。 </li><li>測定テープや定規を用いて表面に触れることなくサンプリング領域のサイズを測定します。できるだけ正確に面積を推定し、報告書（補足表1）を記入してみてください。 </li><li>可能な漏れやラベルサンプル輸送バッグや綿棒キット用綿棒キットを確認してください。 </li><li>水平方向に1ストローク、垂直方向に1ストローク、および斜め方向の1ストロークを次のようにサンプリングエリア全体に綿棒を移動します。 700センチメートル2よりも大きな表面積を綿棒ないでください。 </li><li>チューブに各綿棒を置き、しっかりとキャップを締めます。 </li></ol>研究室への綿棒の2貯蔵および輸送<ol><li>最大48時間、4℃で綿棒を保管してください。長期間保管が必要な場合は、-20℃でスワブを格納する（または-70°C）。 </li><li> すなわち、（0-4℃でチューブを保ちます。 、コレクションの24〜48時間以内に研究室や船への輸送の間に断熱容器に）コールドパックを使用します。 </li></ol> 3.ウイルス濃度、ウイルスRNA抽出および精製注：特に明記しない限り、すべての遠心分離工程は、室温で5分間、5000×gでテーブルトップ遠心機を使用しています。ユニバーサル核酸抽出（UNEX）緩衝液を用いて作業する場合、余分な注意が必要です。ゴーグルまたはフェイスシールドを着用してください。 <ol><li> 1 15 mLチューブと各サンプルに対して1つのRNA Midiカラムにラベルを付けます。各実験における負の抽出制御が含まれます。 </li><li> 10スワブのための溶解液を調製し、PBSTの25ミリリットル（PBS pH7.2の0.02％のTween-80を含む）でUNEXバッファの25ミリリットルを混ぜます。 </li><li>溶解液の50 mLに大腸菌ファージMS2懸濁液（10 6 PFU /μL）の50μLを追加します。 </li><li> 15 mLチューブに綿棒を置き、5ミリリットル溶解液を追加します。混合し、室温で10分間インキュベートします。 </li><li>10秒のための各チューブ、ボルテックスに5ミリリットルの100％エタノールを追加します。 </li><li>慎重に余分な液体を除去した後、綿棒を破棄するために、チューブの側面に軽く押す（これはUNEXのバッファが含まれている）15 mLチューブから綿棒を削除します。残りのボリュームは9-10 mLの間であるべきです。 </li></ol> 4. Midiカラムウイルス核酸の抽出<ol><li>慎重ミディカラム、遠心分離器の上にステップ3.6から4.5 mLのUNEX /エタノール混合物を転送し、ろ液を捨てます。 </li><li>同じ混合物から別の4.5 mLを同じ列、遠心分離機にロードし、ろ液を捨てます。 </li><li>最初の洗浄のための、ミディカラムに70％エタノールの3.5ミリリットルを追加し、遠心分離し、ろ液を捨てます。 </li><li>第二の洗浄のために、ミディカラムに70％エタノールの別の3.5ミリリットルを追加します。ろ液を遠心分離し、廃棄します。 </li><li>ドライスピンのために、（マイナスのウイルスRNAの回収率に影響を与える可能性がある）エタノールのすべての痕跡を除去するために、ミディカラムを遠心してください。 </li><li>新しい15ミリリットルの遠心分離管にMidiカラムを配置します。 Midiカラムに250μlの溶出バッファーを追加します。最高のウイルスRNAの回収率を得るために、遠心分離前に1分間待ちます。 </li><li> -70℃で抽出された核酸を保存するか、手順5に即座に進みます。 </li></ol> RNAクリーンとコンセントレータキットを使用したウイルス核酸の5濃度<ol><li>上記のステップ4.7で溶出したRNAと10秒間渦の250μLに結合バッファーRNAの500μLを追加します。 </li><li> 750μLを10秒間100％エタノールと渦を追加します。 </li><li>各サンプルのスピンカラムにラベルを付けます。スピンカラムに750μLのサンプルをロードします。 </li><li> 1分間12,000×gでスピンカラムを遠心します。フロースルーを捨てます。 </li><li> 1分間12,000×gでスピンカラムと遠心上に残りの750μLをロードします。 </li><li>予備洗浄のために、1分間12,000×gで各スピンカラムや遠心に400μLRNAプレップバッファを追加します。フロースルーを捨てます。 </li><li>最初の洗浄のために、1分間12,000×gで各スピンカラムや遠心に800μLのRNA洗浄バッファーを追加します。フロースルーを捨てます。 </li><li>第二の洗浄のために、1分間12,000×gで列や遠心分離機を回転するように400μLRNA洗浄バッファーを追加します。フロースルーを捨てます。 </li><li>ドライスピンのために、2分間12,000×gで、洗浄緩衝液のすべての痕跡を除去するために、スピンカラムを遠心してください。 </li><li>注意深く新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブにスピンカラムを移します。 </li><li>スピンカラムに25μlの溶出緩衝液を加え、室温で1分間インキュベートします。これは、カラムからのウイルスRNAの回収率を増加させます。 </li><li> 1分間万×gでスピンカラムを遠心分離することにより、RNAを収集します。 </li><li>どちらか-70℃でRT-qPCRを（ステップ6）、またはストアRNAに直接進みます。 </li></ol> 6. Genogroup IのMutiplex RT-qPCRの検出、およびIIノロウイルス、およびコリファージMS 2（補足表2） <ol><li>クリーンな作業面、pipettES、および汚染の可能性を低減するためのRNase汚染除去溶液で遠心分離機。 </li><li>氷の上でRT-qPCRの試薬を解凍します。 （別の領域/客室内に）氷上で解凍RNA。 </li><li>反応の数を決定し、それらの少なくとも10％以上を追加（10の反応が必要な場合など 、11のためのマスターミックスを作ります）。 </li><li> 5秒間の25倍RT-qPCRの酵素を除き、渦個々のマスターミックスコンポーネント、。慎重に指でチューブをフリックすることにより酵素を混ぜます。 </li><li> 5秒間簡単に言えば遠心マスターミックスコンポーネント。 </li><li>キットの説明書に従って、ノロウイルスGIとGIIのリアルタイムRT-PCR検出のためのマスターミックスを調製し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブ（補足表3）でノロウイルス特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを追加します。 </li><li>上下に5〜10回ピペッティングすることによりマスターミックスをミックス（ボルテックスは推奨されません）。リアルタイムPCR 96ウェルプレートの各ウェル内のマスターミックスのアリコートを22μL。 </li><li>渦サンプルRNA5秒間、および簡単な（5秒）遠心分離によって収集します。 </li><li> RT-qPCRのプレート（ 表2からテンプレートに従ってください）に試料RNAとGIとGII陽性対照の3μLを追加します。無テンプレート対照（NTC）をウェルにヌクレアーゼ-Freewaterのの3μLを追加します。 </li><li>光学接着フィルム付きリアルタイムプレートをシール。 </li><li>注意深くウェル中に存在し得る気泡又は液滴を除去するために1分間、1300×gでリアルタイムプレートを遠心。 </li><li> 10分間1）RTステップ：リアルタイムPCR装置とセットアップ以下の熱サイクル条件を設定します。 Taqポリメラーゼの45℃（2）活性化、10分間。 95℃、（3）95℃で15秒の45サイクル、および60℃で60秒で。 </li></ol>スワブ試料中のノロウイルスの7.定量<ol><li> RT-qPCRの結果（ 補足表3）を検証するために、正と負の対照の結果を確認します。 </li><li>各標準曲線は満たしているかどうかを判断許容可能な値は、補足表2に与えられ、式1を使用して標準曲線の全体的な標準偏差を計算します。 （式1）％効率= 100×10（平均CT値-切片）/傾き 。 </li><li> PCRサーマルサイクラーソフトウェアは各標準曲線の傾きを計算していない場合は、（Excel など 、SPSS、またはSAS）統計ソフトウェアを使用して回帰により傾きとR 2の値を決定します。また、私は次式の標準曲線について％の効率を計算します</li><li> 補足表4で指定された基準を満たす標準曲線に基づいて、すべてのテストサンプル用のサーマルサイクラーソフトウェアによって計算されたRNAコピー数を記録します。基準を満たすか、偽陽性コントロールを持っていない標準曲線tの帽子を持つ任意のサンプルを再実行します。大腸菌ファージMS2のCt値をチェックし、PCR阻害を監視するための内部対照として加えました。 </li><li> RNAコピーpの合計数を決定RT-qPCRの反応に使用されるRNA（3μL5）の総RNA溶出液の量（25〜50μL）の比で段階7.2で計算されたRNAコピー数を乗算することにより、ERのサンプル。代替的に、分析対象物の表面積（cm 2）を、総RNAのコピー数を割ることによってRNA濃度を算出します。 </li></ol>ヘミネストされた従来のPCR増幅によるリアルタイムRT-PCR陽性サンプルの8ジェノタイピング<ol><li> RT-PCRアッセイの各プライマーセットのためにマスターミックスの最初のラウンドを準備します（ 補足表2、および5）。 </li><li>マスターミックスの20μLにノロウイルス陽性のRNAの5μLを追加します。 </li><li>以下の条件でRT-PCRを実行する：（1）RTが95℃で、Taqポリメラーゼの42℃（2）活性化、15分で30分間工程、及び（3）95℃で30秒の40サイクル、50℃で30秒、および72℃で60秒。 40サイクル後、72℃でさらに10分間インキュベートします。 </li><li>RT-PCRアッセイの各プライマーセット（ 補足表2および5）のための母校ミックスの第二ラウンドを準備します。 </li><li> 23μLマスターミックスを追加し、（理想的には、第一ラウンドの製品は、RNaseフリー水で1/10に希釈してください）を各チューブに（最初のラウンドから）2μL第一ラウンドのRT-PCRの製品を追加。 </li><li>繰り返し手順8.3。 </li><li> 100ミリリットル1×トリス - 酢酸EDTA（40 mMトリス、20mMの酢酸、およびpH 8.3で1 mMのEDTA）中の2％アガロースゲルを準備します。 60〜70℃に冷却した後、混合物を調製したゲルの100ミリリットルあたりの核酸染色の10μLを追加し、電子レンジで混合物を加熱することにより、アガロース溶解した後、ゲルを注ぎ、コームを挿入します。ゲルは、少なくとも30分間沈降してみましょう。 </li><li> 6×ローディング色素の3μLで各RT-PCR産物の15μlのを混ぜます。負荷の各サンプル15μL、1時間、100Vでアガロースゲルを電気泳動します。 </li><li>ゲルANから適切なサイズの物品税の対象RT-PCR断片（GIとGIIのための341 bpのための330 bp）の商業ゲル抽出キットを用いてRNAを精製dは。精製したPCR産物は、現在サンガー配列決定のために使用することができます。 </li></ol>

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著者には相反する利益はありません。このレポートの調査結果と結論は著者のものであり、必ずしも米国疾病予防管理センターの公式見解を表すものではありません。

ノロウイルスは18と10 3ウイルス粒子20との間に50％のヒト感染用量を持っています。したがって、表面のも低レベルの汚染は、公衆衛生上のリスクをもたらすことができます。 1）異なるスワブ材料、2）貯蔵条件スワブ輸送の間、3）ウイルスRNAの濃度、及び4）大腸菌ファージMS2内部抽出コントロールとして：スワブサンプリングプロトコルのいくつかの側面を含めて評価しました。 最近まで、綿、ポリエステル、ナイロンなど）ワイプ帯電防止から作られたスワブの唯一の性能が評価されたフィールドの使用13、14、15、21、22のために提案されています。これらのうち、綿棒は、ノロウイルスおよび肝炎食品調理面と媒...

<html>人間のノロウイルスは、世界的流行と散発的な急性胃腸炎の主要な原因1、2、3です。ウイルスは非常に伝染性であり、送信は、人との対話にまたは間接的に汚染された食物、水や環境表面との接触を介して直接人を介して行われます。ノロウイルスは、長時間流すことができ、環境表面上のウイルスの生存期間の延長は1、2、3に記載されています。ピークの排出時には、ウイルス粒子の数十億は糞便1g当たり放出される、および嘔吐はまた、感染4を引き起こすウイルス粒子の十分な数が含まれている5、6、7、8、EF &quot;&gt; 9、10。また、無生物表面と人間の皮膚との間のウイルスの移動が容易に発生する可能性があります2、11、12。したがって、環境汚染のモニタリングがアウトブレイク調査を支援し、クリーンアップの有効性を評価する際にすることができ、消毒手順。 いくつかの環境サンプリングプロトコルは、ロタウイルスの検出のために記載されており、大腸菌ファージMS2、ネコカリシウイルス（FCV）、及びバクテリオファージP22 13、14、15、16。しかし、高速乾燥（&lt;1時間）と小さい表面領域（25×100 cm 2）を含む、これらの研究に記載の検証条件は、適切にフィールドの設定を表していない場合があります。また、エンバイロの低い汚染レベルを期待nmental表面は、非常に少数のウイルス粒子を検出することができるプロトコルを必要とします。 私たちは、ノロウイルスの検出とタイピングのためのマクロフォームベースの表面サンプリング法を開発しました。この方法は、いくつかのノロウイルス集団発生時に検証されています。プロトコルは、1）（2）どのように最善の研究室に収集・輸送中のサンプルの完全性を維持するために、およびノロウイルスの3）実験室での試験とタイピング環境表面からスワブサンプルを収集する方法。

<table><tbody><tr><td>キットの一般名</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong><Macrofoamスワブ</td><td>Premoistened EnviroMaxスワブキット&nbsp;</td><td>ピューリタン</td><td>2588060PFUW</td></tr><tr><td>RNA 溶解バッファー&nbsp;</td><td>CDC UNEX buffer</td><td>Microbiologics</td><td>カタログ番号 MR0501</td></tr><tr><td>RNA 抽出 スピンカラム</td><td>midi カラム</td><td>Omega Biotek</td><td>カタログ番号 R6664-02</td></tr><tr><td>RNA 精製スピンカラム</td><td>Zymol RNA クリーン&コンセントレータキット&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>カタログ番号 R1016</td></tr><tr><td>リアルタイム RT-PCR キット</td><td>AgPath キット ワンステップ RT-PCR キット</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>カタログ番号</td></tr> <tr><td>4387391従来の RT-PCR キット</td><td>Qiagen ワンステップ RT-PCR キット</td><td>Qiagen キット</td><td>Cat No</td></tr> <tr><td>210212Gel extraction kit</strong</td><td>>Qiagen QIAquick gel extraction kit</td><td></td><td>CatNo 28704 or 28706</td></tr><tr><td></td><td>Coliphage MS2</td><td>ATCC</td><td>Cat No 15597-B1</td></tr><tr><td></td><td>RNAランオフ転写産物</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>リアルタイムPCRプラットフォーム</td><td>Applied Biosystems</td><td>Model ABI 7500</td></tr><tr><td></td><td>Optical 96-well reaction plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat No 4316813</td></tr><tr><td></td><td><a href="http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp;showAddButton=true&製品ID=4306311&; _bcs_=H4sIAAAAAAAAAAI1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9%2BUkO6scMYGEmWnqX3%0A5Mec8e0p%2BGbUKWZMlFkNYTIa4h%2F55PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyT%0As9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPEd0exacF 6LkD5h%2BNTr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUy%0AjD6Yf%2FKU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPY%0AvUrQ%2BTAjAt88w4zlm8Ly%2FYRha2yiyeUSUJM35ajHt%2BZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwx%0AD9Q0vydo9rrs4te675%2FTKhvpd74AhB0C9yUCAAA%3D&returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%3A80%2Forder%2Fcatalog%2Fen%2FUS%2Fadirect%2Flt%3Fcmd%3DcatDisplayStyle%26catKey%3D101%26filterType%3D1%26OP%3Dfilter%26filter%3Dft_1101%252Ff_2005260*">MicroAmp透明粘着フィルム&nbsp;</a></td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat No 4306311</td></tr></tbody></table>

表面上のヒトノロウイルスの検出のためのスワブサンプリング方法

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

人間のノロウイルスは、世界的流行と散発的な胃腸炎の主要な原因です。ほとんどの感染はいずれかの環境表面や食品を介して間接的に個人対個人の経路を介して直接広がったりしているため、汚染された媒介物と無生物表面は、ノロウイルスの集団感染時のウイルスの拡散のための重要な媒体です。 私たちは、硬質表面からのヒトノロウイルスの検出およびタイピングのためのマクロフォームスワブを使用してプロトコルを開発し、評価しました。繊維が先端に付いた綿棒や帯電防止ワイプと比較すると、マクロフォームスワブは、最大700 cm 2の便座表面からのウイルス回収（範囲1.2から33.6パーセント）を許可します。プロトコルは、スピンカラムを用いてウイルスRNAのスワブからウイルスを抽出し、さらに濃縮するためのステップを含みます。ノロウイルス胃腸炎がされていたクルーズ船や介護施設での表面から収集された217スワブサンプルの合計で、127（58.5パーセント）RT-qPCRによりGIIのノロウイルス検査で陽性と報告しました。これらの29（22.8％）のうち、正常遺伝子型を決定することができました。結論として、私たちが開発したプロトコルを使用して、環境面でのノロウイルスの検出は、臨床試料が入手できないときに大流行中の環境汚染のレベルだけでなく、ウイルスの検出を判断する際に役立つかもしれ。それはまた、改善戦略の有効性の監視を容易にすることができます。

図1は、スワブサンプリングプロトコルを示すフローチャートです。このプロトコルは、4つの主要なステップで構成されています。 1）サンプル収集、2）サンプルの保管および輸送、3）ウイルスRNA精製および濃縮し、4）RT-qPCRのアッセイおよび遺伝子型決定。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55205/55205fig1.jpg" /> 図1：ノロウイルスの環境表面サンプリングのための最終的なプロトコルのフロー・チャート <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55205/55205fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <p class="jove_content" fo:...

環境硬質表面上のノロウイルスの検出と定量のために、マクロフォームベースのサンプリング方法が開発され、評価されました。

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

本研究で提案するマクロフォームを用いた表面サンプリング法の全体的な目的は、アウトブレイクの原因特定、ウイルスの環境汚染ダイナミクスの総合的な評価、およびノロウイルスに対する除染戦略の有効性を検証することです。本プロトコルでは、環境表面からスワブサンプルを採取する方法、それらスワブの保存および輸送方法、ならびに採取したスワブからノロウイルスを検出および型判定するために推奨されるラボプロトコルについて詳述します。本ノロウイルス用環境スワブプロトコルの明確な改善点として、最適なスワブ素材を特定し、硬い表面からどの程度のノロウイルスを回収できるかを決定したこと、および本プロトコルがより広い表面領域のサンプリングに効果的に活用できることが挙げられます。このビデオでは、私のスタッフサイエンティストであるGeun Woo ParkとPreeti Chhabraが、ノロウイルスの検出および型判定のためのスワブ採取プロトコルを実演します。スワブ採取を開始するには、サンプリングエリアに移動し、水平方向に1回、垂直方向に1回、そして対角線方向に1回、スワブを動かします。各スワブを別々のチューブに入れ、キャップをしっかりと締めてください。ステンレス鋼、便座の表面、およびドアノブの表面からサンプルを採取します。次に、各サンプル用に15 mLチューブ1本とRNA Midiカラム1本にラベルを貼ります。各実験に陰性抽出コントロールを含めてください。汎用核酸抽出（UNEX）バッファーの廃棄物を回収するための空ボトルを用意します。スワブ10本分の溶解液を調製するには、25 millilitersのUNEXバッファーと25 millilitersのPBSTを混合します。50 millilitersの溶解液に、50 microlitersのコリファージMS2懸濁液を加えます。綿棒を15 mLチューブに入れ、溶解液を5 mL加えます。綿棒を用いて溶液を混ぜ合わせ、室温でインキュベートします。各チューブに100% ethanolを5 mL加え、チューブを10秒間ボルテックスします。15 mLチューブからスワブを慎重に取り出し、チューブの壁面に軽く押し当てて余分な液体を除去した後、スワブを廃棄します。UNEXエタノール混合液 4.5 mLをMidiカラムに慎重に移し、カラムを遠心分離します。遠心分離後、ろ液を廃棄します。同じ混合液をさらに4.5 milliliters分、同じカラムにロードし、カラムを遠心分離します。ろ液は廃棄してください。最初の洗浄として、Midiカラムに70% ethanolを3.5 milliliters加え、カラムを遠心分離します。遠心分離後、ろ液を捨てます。2回目の洗浄では、さらに3.5 millilitersの70%ethanolをMidi columnに加えます。遠心分離を行い、ろ液を捨てます。ドライスピンでは、Midiカラムを遠心分離し、エタノールの残渣を完全に除去します。Midiカラムを新しい15 mL遠心チューブに入れます。Midiカラムに250 µLの溶出バッファーを加え、1分間待機してから遠心分離することで、ウイルスRNAの回収率を最大化します。500 µLのRNA結合バッファーを250 µLのRNAに加え、混合物を10秒間ボルテックスします。750 µLの100% ethanolを加え、さらに10秒間ボルテックスします。次に、サンプルごとにスピンカラムにラベルを貼ります。750 µLのサンプルをスピンカラムにロードし、遠心分離を行います。ろ液は廃棄します。残りの750 µLをスピンカラムにロードし、カラムを遠心分離します。事前洗浄として、各スピンカラムに400 µLのRNA prep bufferを加え、カラムを遠心分離します。ろ液は廃棄してください。1回目の洗浄として、各スピンカラムに800 µLのRNA wash bufferを加え、カラムを遠心分離します。フロースルーを廃棄します。2回目の洗浄では、各スピンカラムに400 µLのRNA洗浄バッファーを加え、遠心分離を行います。フロースルーを廃棄します。ドライスピンでは、スピンカラムを遠心分離し、洗浄バッファーを完全に除去します。スピンカラムを、清潔な1.5-milliliterマイクロ遠心チューブに慎重に移します。スピンカラムに25 microlitersのエリューションバッファーを加え、室温で1分間インキュベートして、カラムからのウイルスRNAの回収率を高めます。スピンカラムを10,000 ×gで1分間遠心分離し、RNAを回収します。そのままリアルタイムPCRに進みます。マルチプレックス リアルタイム RTPCR を行う前に、作業台、ピペット、および遠心分離機をRNase除去溶液で清浄してください。リアルタイムPCR試薬を氷上で解凍します。サンプルRNAは別の場所で氷上解凍します。反応数を決定し、ピペッティングによる損失を考慮して、マスターミックス用の試薬を少なくとも10%多めに調製します。次に、個々のマスターミックス構成成分を5秒間ボルテックスします。チューブを軽く叩く（フリッキング）ことで、酵素を慎重に混合します。マスターミックス構成成分を5秒間、短時間遠心分離します。次に、キットの説明書に従ってノロウイルスG1およびG2検出用のRTPCRマスターミックスを調製し、ノロウイルス特異的オリゴヌクレオチドプライマーとプローブを1.5 mLマイクロ遠心チューブに加えます。続いて、ピペッティングで7回上下に混ぜてマスターミックスを混合します。リアルタイムPCRプレートの各ウェルに、マスターミックスを22 µLずつ分注します。サンプルRNAを5秒間ボルテックスし、5秒間の遠心分離によって内容物を回収します。リアルタイムPCRプレートに、3 µLのサンプルRNAポジティブコントロール、および10倍段階希釈したG1およびG2 RNA転写物を加えます。ヌクレアーゼフリー水を3 µL、テンプレートコントロール（NTC）ウェルに加えます。プレートを光学用粘着フィルムで密閉します。ウェル内に気泡や液滴がある場合があるため、プレートを1,300 ×gで1分間慎重に遠心分離します。その後、リアルタイムPCRの設定を行い、サーモサイクリング条件を入力します。G1およびG2の両方の転写産物の標準曲線を作成します。それぞれの標準曲線を用いて、Ct値をRNAコピー数に変換します。全RNA溶出液の量とリアルタイムPCRアッセイに使用した全RNA量の比を乗じ、サンプルあたりの全RNAコピー数を算出します。ヘミネステッド法による従来型のRT-PCRを用いてノロウイルス陽性検体のジェノタイピングを行うには、まず1回目RT-PCR用のマスターミックスを調製し、あらかじめラベルを貼ったPCRチューブに20 µLずつ分注します。各チューブに5 µLのRNAを加えます。1回目のRT-PCRが完了した後、新しいチューブに23 µLずつ分注して、ヘミネステッド法による2回目のPCR用のマスターミックスを調製します。最後に、各チューブに1回目のPCR産物を2 µL加えます。このマクロフォームベースのスワブサンプリング法は、ノロウイルス胃腸炎の疑い例が報告されたクルーズ船から採取した検体を用いてフィールドテストされました。ノロウイルス陽性であった17個のスワブ検体のうち4個でジェノタイピングが可能であり、すべての検体で同一のG2配列が確認されました。ウイルス量の測定により、便座などの激しく汚染された表面の評価が可能となりました。サイクルしきい値（Ct値）と、これらのサンプルのシーケンシング能力との関係をリアルタイムRTPCRによって決定しました。合計217個のスワブ検体のうち、127個がG2ノロウイルス陽性でした。Ct値が24から27の間および28から31の間のスワブ検体では、それぞれ100%および72.2%の割合でジェノタイピングが行われました。対照的に、Ct値が32から36および37から40のスワブ検体でシーケンシングに成功したのは、わずか22%および1.6%でした。本プロトコルにより、ノロウイルス流行時における環境汚染レベルの判定、臨床検体が入手不可能な場合の流行原因の特定、および清掃作業の有効性の判定が可能であることが実証されました。最も正確な結果を得るためには、異なるサンプル間での結果のばらつきを最小限に抑えるため、本プロトコルに正確に従うことが非常に重要です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

オープンリーディングフレーム1（ORF1）ORF2接合領域に特異的なプライマーとTaqManプローブを利用して子どもの便からノロウイルス分離株の検出および遺伝子型の識別のためのワンステップRT-PCRアッセイ、ノロウイルスゲノムの中で最も保存領域です。説明します。非商業的、費用対効果の高いRNA抽出法が詳述されている。...

のTaqManワンステップRT-PCR法によるキッズスツールからノロウイルスの検出とGenogrouping

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ヒトノロウイルスVLPの腸内細菌への結合を定量するアッセイ

EPA Method 1615は、環境水や飲料水中のエンテロウイルスとノロウイルスを濃縮するために、電気陽性フィルターを使用します。この原稿では、メソッド 1615...

エンテロウイルスと文化およびRT-QPCRによる水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。ウイルスサンプルのI.コレクション

ここでは、バッファロー・グリーンモンキー腎臓細胞株を使用して培養可能なウイルス全体を測定する手順を紹介します。この手順は、環境水および飲料水中の感染性ウイルスの発生を測定するための標準化されたツールを提供します。...

エンテロウイルスと文化とRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615計測。 II。総培養可能なウイルスアッセイ

ここでは、逆転写定量PCRを使用して、環境水と飲料水中のエンテロウイルスとノロウイルスを定量化する手順を紹介します。EPA メソッド 1615 のこの標準化された手順による地下水からの平均ウイルス回収率は、ポリオウイルスで 20%、マウスノロウイルスで 30%...

エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

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代替体外ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法

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フローサイトメトリーを用いた経月細菌に結合するヒトノロウイルスウイルス様粒子の定量化

市民科学プロジェクトは、SARS-CoV-2の環境サンプルを収集するためにサンディエゴの住民を募集するように設計されました。多言語 Web ベースのプラットフォームは、使いやすいモバイル デバイス...

都市環境のスワッピング - 環境貯留層からのSARS-CoV-2のサンプリングと検出のためのパイプライン

このプロトコルは、急速な細胞全体の検出に続いてトマトや他の生鮮食品の表面のサンプリングのための簡単​​な粘着テープベースのアプローチを、説明して...

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場で</emの迅速検出のための>ハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

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運動誘発性リンパ球のアポトーシスの決定のための指先穿刺の採血方法

学ぶマクロフォームスワブサンプリング法による環境表面のノロウイルス検出と定量手法。広範囲な表面からのウイルス回収率向上と、感染症流行調査への応用価値を解説します。

表面上のヒトノロウイルスの検出のためのスワブサンプリング方法

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