Name: 「Acufection」と肌の研究への応用により、経済的なDNAデリバリーシステムの開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学ぶ経済的なプラスミドDNA発現法でマウス皮膚に免疫関連遺伝子を導入し、皮膚炎症における遺伝子機能を解明する。乾癬などの皮膚疾患治療開発に貢献する革新的アプローチです。

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この作品は、科学技術省からの助成金によってサポートされていました（MOST 103から2633-B-002から002; 104から2320-B-002から048）。私たちは、博士に感謝します。原稿を読み取るためのベティ呉謝とハワイ大学のスタンフォード大学博士とピーター・ホフマンのNTUでチェンクオ・リー、リー・ゼボーニ、農業バイオテクノロジーの技術支援のためのNTUでユンチェン、博士ウェン・チ・ウェイ技術的助言のための中央研究院の研究センター。

8の雌マウス - 生後12週は、この研究のために使用しました。 C57 / BL6野生型（WT）とIL-15欠損（IL15 - / - ）マウスは、それぞれ国立研究所動物センター（NLAC）、台湾とをTaconic農場から購入しました。 IL-15欠損（IL-15 - / - ）およびIL-15ドミナント（IL15 +/-及びIL15 + / +）は 1を示した：IL15 +/-ヘテロ接合体の断面から第二世代の3比。 IL-15の遺伝子型- / -マウスは、PCR分析により確認しました。マウスは、実験動物センター（LAC）、国立台湾大学医学部（NTU）大学の特定病原体フリー（SPF）施設で維持しました。麻酔薬の材料および方法を含むすべての動物の手順は、公衆衛生施設内動物管理使用委員会（IACUC）（動物議定20130225の承認の宣誓供述書）の国立台湾大学医学部の大学や専門学校で承認された動物のプロトコルに従って行いました。 &lt;Pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 1。鍼の調製注：鍼治療の針は、ハンドルとニードル端（ 図1A）からなる医療装置です。鍼治療の針の直径を0.2mm（36 G）から0.35ミリメートル（28 G）の範囲でした。私たちは肌を刺す時に潜在的な過剰な細胞の損傷を避けるために、針の最高のポイントを選択します。長さ13ミリメートル（0.5インチ）、25ミリメートル（1.0）、40ミリメートル（1.5）および50mM（2.0）を含む0.2 mmの針の4つの異なる長さが存在します。 13ミリメートルの長さ10針の束は、C57BL / 6マウスの皮膚に針を振動中最良の快適なグリップを提供しました。この方法は、大型動物の皮膚に適用されるか、大きな手で研究者によって行われた場合のパラメータを変更することができました。 <ol><li>無菌の、非発熱性パッケージから鍼を削除します。滅菌ドレープの上に針を置きます。 </li><li>私は一緒に10針をバインドするために、接着ラベルテープを使用しますNA束（ 図1B）。 注：10針が幾何学的に円筒形状を形成するように配置されています。便宜上、粘着テープを適用する前に、装置を安定化させるためにパラフィンフィルム片を使用します。すべてのニードルポイントが同一平面上にあることを確認します。代わりに、単一の針の束を使用することで、針と皮膚との接触面積を増やすことで、最大のDNAの注入を容易にします。 </li></ol>大量かつエンドトキシンフリープラスミドDNAの調製<ol><li>プラスミドDNAを化学的にコンピテント細菌細胞を形質転換します。 </li><li>選択し接種単一細菌コロニーを抗生物質を含むLB培地3mLにし、シェーカーで一晩37℃でインキュベートします。 </li><li>抗生物質を含むLB培地250mLに100と37℃で一晩振とう：1で細菌培養物を希釈することによって、培養をスケールアップ</li><li>高品質Reduceを用いてDNAを大量に調製しますY、製造者の指示に従って、エンドトキシンフリーのプラスミド調製キット。 注：Acufectionプロトコルは、高純度のプラスミドDNAを大量に必要とします。高品質の使用は、エンドトキシンフリーでカラム精製プラスミドDNAが推奨されます。 </li><li>滅菌水中にDNAを溶出します。 acufection直前まで-20°Cで小分けに保管してDNA。 注：一貫性のプラスミドDNAの発現を確実にするためにDNAの繰り返し凍結と融解を避けてください。 </li><li> acufection無菌PBS中1mg / mLのプラスミドDNAを希釈します。 </li></ol> Acufection 3.手順注：DNAの最適量および標的皮膚表面の領域は、異なる遺伝子に対して変化し、さらに最適化される必要があるかもしれません。穿刺力及び回数は、皮膚の厚さに応じて変えることができるまた、皮膚の角質層を緩め。これらの条件は慎重acufected ジーン・トランスクリーの発現レベルを評価した後に決定されなければなりません定量RT-PCRによってPTS。 <ol><li>マウスを秤量し、腹腔内注射によりトリブロモエタノール（グラム体重あたり400μgの）を管理します。 注：2,2,2-トリブロモエタノールは、一般的にマウスで使用された注射用麻酔剤です。溶液は、2-メチル-2-ブタノール2.5％を含有する蒸留水（200 mL）中の非医薬品グレードの2,2,2-トリブロモエタノール（2.5 g）を溶解することにより作製されます。 </li><li>麻酔下で乾燥するのを防ぐために、目に獣医眼科軟膏を使用してください。 注： - 2分麻酔効果は1に誘導されます。操作の前に麻酔の十分な深さを確保するために、つま先ピンチ反射を確認してください。 </li><li>背側脇腹の皮膚を剃ると毛幹にケラチンタンパク質を溶解するために脱毛クリームを適用します。 注：髪を除去するための脱毛クリームの使用は、皮膚へのDNAの注入を容易にするであろう。 </li><li>脱毛クリームを拭き取る水に浸した綿球を使用してください。 注：脱毛クリームは水溶性です。クリームウィルの完全な除去lは脂っこい表面を防止し、より良い穿刺の結果を確認してください。 </li><li>皮膚表面の消毒に70％エタノールに浸した滅菌綿棒を使用してください。 </li><li>予め測定ステンシルと脱毛皮膚にマーク対象領域（X 1、CM1センチ）。注：ターゲットサイトをマーキングすると、上下定義された領域内針バンドルを適用するのに役立ちます。これは、実験間変動を最小限にするために特定の表面領域にDNAの同量の送達を保証することが重要です。 </li><li>マークされた皮膚へのプラスミドDNA（10μgの）の10μLのドロップを置きます。 注：acufectionためのDNAの量は、異なる遺伝子および発現ベクターの種類に応じて変化します。使用されたDNAの量は慎重に関心の実験を行う前に滴定されるべきです。 10μL、小さな液滴であり、それは刺しながら転がり落ちずに剃り、脱毛肌によく座っています。マウスAと比較するために、10μLの空のベクターDNAで処置したマウスのコントロール群を含みます研究遺伝子とcufected。 </li><li>鍼治療の針束（ 図1B）を保持し、100倍または消失皮膚にPBS中のDNAからの水分まで上下運動でマークされた表面を刺します。注：皮膚表面の一部赤みが発生する可能性があります。出血深い切り傷を作ることは避けてください。 PBS中のDNAからの水分（10μL）を皮膚に消える場合、皮膚表面上の上下穿刺動作の数が動作可能に決定されます。それはacufection配信される遺伝子から最も一貫した結果を与えているので、私たちは30秒で100回を決めました。該当する場合、針は、最大6つの標的皮膚呵責（1センチメートルX 1センチメートル毎）に再利用することができます。 acufectionの間に70％エタノール及びPBSで針をすすぎます。彼らは鈍いか、交差汚染を避けるために、異なるプラスミドDNAのためのものであるときに新しい針に変更します。 </li><li>覚醒するまで、体温を維持するために、加熱パッド上acufectedマウスを置き。 </li><li>彼らが持っているとき、自分のケージにマウスを返します。十分な意識を取り戻しました。注：未acufectedマウスのケージから別のケージにacufectedマウスを保持し（ケージ当たり5匹の未満の動物）。 </li><li>場所に水のボトルを入れて、IVC（個別に換気ケージ）ラックにケージを返します。 </li></ol> 4.術後ケア<ol><li>処置後最初の48時間、密接に行動変化（情動不安、攪拌または摂食障害）または異常な外観（粗い被毛又は猫背姿勢）を含む任意の不快感のために、マウスを監視します。 </li></ol> IL-15ΔE7-acufectedスキンの5イミキモド（IMQ）トリートメント注：acufected遺伝子の転写発現とタンパク質の生産は、目的のプラスミドをトランスフェクションの3日後に覚せい剤の異なる種類で処理することが可能でacufected 3日目のマウスで検出可能です。私たちは、IMQクリームとIL-15ΔE7-acufectedマウスの皮膚を処理することによって、ここに示しています。 IMQがfを承認したイミダゾキノリンアミンでありますまたは外性器や周産期いぼ13を処理します。局所IMQ処理は、薄片状皮膚、表皮増殖および皮膚好中球浸潤12、14、15の発現を有するマウスにヒト乾癬様皮膚疾患を誘発することが示されています。 注：プラスミドベクターが含まれる完全長マウスIL-15 cDNAを、伸長因子1α（PEF）の調節下で、C末端にIL-2シグナルペプチドおよびFLAGタグと隣接し（PEF-IL- 15、バンフォードらによって記載されるように構築された5859塩基対）。 16。プラスミドは残基で33最初の16個のアミノ酸を削除するためのIL-15をテンプレートとして使用される - SOEによってIL-15ΔE7ためのIL-15遺伝子のエキソン7 48（PEF-IL-15ΔE7、5811塩基対）（合成オーバーラップ伸長）PCR法17によって。成功した細菌コロニーIL-15ΔE7で形質転換し、制限酵素消化によって確認し、DNA配列12、18により追跡しました。プロトコルのステップ2に記載したようにエンドトキシンフリープラスミドDNAの大量調製しました。 <ol><li>トリブロモエタノール（グラム体重あたり400μgの）の腹腔内注射によりacufectedマウスを麻酔し、麻酔下で乾燥を防ぐために、目に獣医眼科軟膏を適用します。手術手順の開始前に、麻酔の十分な深さを確保するためにつま先ピンチ反射を確認してください。注記さ：2 cm×2センチ皮膚がIMQために処理されるので、のpIL-15ΔE7プラスミドDNA（用量あたり10μLのPBS中10μg）の2つの用量を2つの標的部位（1センチメートルX 1センチメートル毎）にacufectedれます。 </li><li>マークは、皮膚（×2 cm 2のCM）acufected領域をカバーに隣接します。 </li><li>局所的にマークされた表面積にIMQクリームを適用するにはQ-チップアプリケーターを使用してください。注：ステップ5.1は第一の用量（60 /用量）のためにのみ行われます。次の連続投与は、非麻酔したマウスに適用されます。 </li><li>ハイビジョンビデオカメラで毎日IMQ処理した背部皮膚の変化を文書化します。注意：一人は別が記録している間にマウスを保持しています。静止画を撮影し、後で編集しています。 </li><li> IMQ処理後4日目または7日目に頸椎脱臼続いトリブロモエタノールの過剰摂取（グラム体重あたり800μgの）を注射することによってマウスを安楽死させます。皮膚を切除し、処理された（ - 4.5 4.1ステップ）。 </li></ol>マウス皮膚の6ホモジネート<ol><li>尾の付け根から水平カットを作るために、手術ハサミを使用してください。後肢のベースに左右対称に進み、前肢のベースに脇腹に沿って垂直に切断し続けます。 </li><li>慎重に、前方への後部から下部組織から皮膚の皮をむきます。背部皮膚をカットするはさみを使用してください。滅菌ペトリ皿の上に皮を置きます。 </li><li>ターゲットを切除する外科用メスを使用します皮膚、直ちに液体窒素で凍結。注：（X 1、CM1 cm）の無し又はIMQ処理（×2 cm 2のCM）とacufected皮膚の同じ大きさは、実験間の変動を最小限に抑えるために、各マウスのために固定されています。 </li><li>ハンドル付き予冷2区画乳鉢及び乳棒の中心で凍結皮膚組織を置きます。組織を粉砕するモルタルのリードハンマーを使用してください。 </li><li>迅速RNA抽出のため、またはタンパク質溶解物を得るための50のPBSμL及び1×プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むチューブに細胞溶解試薬の500μLを含む新しいチューブに粉砕組織を置きます。 </li></ol> 7.皮膚切片のH＆Eおよび免疫組織化学染色<ol><li>カセット内の皮膚組織を置き、一晩、4％パラホルムアルデヒドでそれを浸します。 </li><li>我々の場合にはLAC、NTUで病理学研究所で行われた埋め込みやセクションの組織、。注：セクションを5μmの厚さで切断されます。組織sectiを配置正に荷電したスライド上のアドオン。 </li><li> 15分間65℃でスライドを加熱します。 </li><li>染色ラックにスライドを置きます。二回、100％、95％、80％、再水和のための75％、60％および50％エタノール（5分毎）に順次浸漬して、続いて5分間のキシレン代替物を含む対応するタンクにラックを浸します。染色の前に、3分間スライドを水道水で浸します。 </li><li>ヘマトキシリンおよびエオシン染色を行います。注：H＆E染色はLAC、NTUで病理研究所で要求に応じて行きました。 </li><li>免疫組織化学染色のために、非特異的バックグラウンド染色を減少させるために5分間室温でブロック溶液でセクションをブロックします。注：ブロック溶液は市販の免疫染色技術を用いて開発されています。いいえ動物血清は、この製品に含まれていません。 </li><li>ブロック溶液をリンスするためにPBSでスライドを浸し。 </li><li> 1：10でPBSでブロック溶液を希釈し、2％ウシ胎児血清（FBS）（希釈溶液）を加えます。 </li><lI&gt;ピペット部上に適切に希釈した一次抗体と室温で60分間インキュベートします。注：抗体は、希釈溶液で希釈します。この染色用の抗体濃度は1で最適化されている：800および1：200のKi67（クローンSolA15）およびLy6G（クローン1A8）のために、それぞれ。これらの濃度は、バックグラウンド染色せずに明瞭な染色を示すことがわかっています。 <ol><li>二次抗体の非特異的結合を制御するために、一次抗体を省略し、同じ溶液で同じラン内の1つの連続切片を染色します。 </li></ol></li><li>洗浄は、5分ごとにTBS中で3回+ 0.1％のTween-20（TBST溶液）をスライドさせます。洗浄の間に変更するソリューション。 </li><li>各セクションに標識されたポリマーの一滴をピペットで40分間室温でインキュベート。注：標識されたポリマーは、商業的にFab」フラグメントに還元されるペルオキシダーゼ及び二次抗体とアミノ酸ポリマーを組み合わせることによって調製されます。試薬は、使用する準備ができていますマウスの組織切片の免疫組織化学染色。 </li><li>洗浄は5分ごとに、TBSTで3回スライド。洗浄の間に変更するソリューション。 </li><li>組織切片上にピペット3,3&#39;- diaminobenzindine四塩酸塩（DAB）溶液と褐色の沈殿物が明視野顕微鏡下で表示されるまで、室温で放置します。注：DABペルオキシダーゼの存在下で沈殿する時間は約30分です。 </li><li>ペルオキシダーゼ活性を停止するために、水にスライドを浸します。核染色のためのメチルグリーン溶液中でディップスライド。洗浄は、5分ごとにPBSで3回スライドします。 </li><li>永久封入剤（セクション当たり8μL）で覆われている染色切片上にカバースリップを置きます。 </li></ol>ステンド組織切片の8写真と分析<ol><li>明視野顕微鏡下でH＆E染色およびIHC組織切片を視覚化します。顕微鏡に取り付けられた電荷結合素子（CCD）カメラを用いて画像を捕捉します。 Qについてuantitative分析、イメージングソフトウェアを使用することができます<ol><li> 20Xの目的でscanscopeを使用して全体の染色切片をスキャンします。 </li><li>表皮の1mmのセグメント内の表皮の厚さを測定し、セグメント内のKi67免疫反応性細胞の数を数えます。 注：定量分析は、顕微鏡の自動化＆画像解析ソフトウェアを使用して行われます。表皮の厚さは、基底層および表皮の最外層との間の距離によって定義されます。 </li><li>直ちに局所IMQ処理された皮膚下の皮膚領域（230 X 270μm2の長方形）でLy6G免疫反応性細胞の数を数えます。 </li></ol></li></ol>

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著者は、開示することは一切金銭興味を持っていません。

acufectedプラスミドDNAの発現を確実にするために最も重要なステップは、均等に振動し、皮膚の角質層を緩めることです。皮膚を切断することなく穏やかに針を押しながら、力は、表面を押圧しにくい十分であるべきです。 1センチメートルX 1cmの面積に10μL溶液中のDNAの吸収を促進するために、針は30秒で約100回上下に振動するべきです。一つは、肌を刺すとacufected遺伝子の最高発現レベルを得るために必要とされる回数に注目することによってする必要が力を決定することができます。 プラスミドDNA量の変更は、それが異なる遺伝子を変化させることができるので、acufectionが必要とされてもよいした後、発現の十分なレベルに到達するために適用されます。滴定実験は、同様の実験の前に適用されるプラスミドDNAの最適量を決定するために実行されるべきです。定量的RT-PCR分析の結果は、Oを決定するのに役立ちますプラスミドDNAのptimal量および再現性のある結果を得るための最良の条件。 acufectionプロセスの正確なメ...

皮膚は、宿主防御の第一線です。ケラチノサイト（KCS）は、ヒトとマウスの皮膚における主要な細胞型です。環境刺激（ 例えば、日光、酸素、化学物質や病原性浸潤）に応答して、KCSは、活性化され、このようなIL-8、IL-6、IL-1α、IL-1β、TNF-αなどの炎症性サイトカインおよびケモカインの広い配列を生成していますαおよびGM-CSF 1。彼らは一緒に皮膚への免疫細胞の動員を誘発します。悪化皮膚炎症は、多くの場合、急性異所性接触性皮膚炎および慢性のT細胞媒介性炎症（ 例えば、アレルギー性接触性皮膚炎および乾癬）2を含む多数のヒト疾患に関連付けられています。 KC活性化を阻害することにより、皮膚の炎症誘発性の応答を調節することは、皮膚の炎症を治療するためのもっともらしいアプローチです。このプロトコルは、一過性免疫解像度を研究するために、表皮におけるサイトカイン遺伝子を発現するための新しいアプローチを説明します皮膚のような治療に必然ponse。 表皮は、皮膚の最表層を構成します。それは、皮膚のより深い層に侵入するような核酸および病原体などの外部物質を保持物理的障壁として働きます。いくつかの無針技術は、表皮のDNAの転送3、4のために確立されています。溶液中のDNAまたはカチオン性リポソームまたはアデノウイルスベクターに関連した直接そのような角質層の除去または試薬を脱毛での処理のような技術を用いて修飾された表皮に適用されています。角化上皮の除去は、DNAケラチノサイトおよび免疫応答5を誘発するランゲルハンス細胞と表皮バリアとの相互作用を横断を容易にします。大きな表面積は、DNAの転送のために利用可能であり、このアプローチは、針を必要としませんが、要件を含む欠点があります（ - 100μgの10）、ストリッピングによって皮膚に過酷な治療、及びDNA送達ブースター6なしで免疫された動物において免疫応答を誘導するのに矛盾した結果、DNAの大量のために。皮膚への裸のDNAの微粒子媒介性の細胞内送達は、免疫応答7,8を誘導するための非常に効率的で再現性のあることが示されています。手持ち遺伝子銃は、加圧されたヘリウム空気流9により径2μm直径プラスミドDNA被覆金粒子による皮膚の標的部位に衝突するために使用されています。プラスミドDNAは、おそらく皮膚にKCsand樹状細胞（DC）によって取り込まれ、タンパク質が局所的に発現されるか、またはDCを10によって流入領域リンパ節に輸送されます。遺伝子銃システムはシンプルで、限られた技術的な経験を必要とし、「DNA BULを準備し、提供するためのコストが、う」（ すなわち、金粉末、ヘリウムガス）および遺伝子銃用自体は、その一般的な適用を制限している。実験は異なる場所で行われる場合に加えて、ヘリウムガス供給システムの要件は、遺伝子銃の輸送の容易さを制限する。Microseeding単回注射、粒子ボンバードメント11よりも遺伝子導入の高い効率を達成することが実証されている。Microseedingは粒子ビーズ11を使用せずに皮膚にDNAを送達するために入れ墨銃を使用する。このアプローチを用いて皮膚上にマイクロニードルを発振する可能性があります直接細胞膜をこすり、したがって、同時に複数の細胞にDNAを移す。ただし、0.254ミリメートル直径の針を注射の多数に関連する疼痛が欠点です。 ここでは、in vivoでの DNA送達するための別のアプローチを提供します。 「acufection」 </strオング&gt;私たちはここで説明するプロトコルは、マウスの皮膚にプラスミドDNAを提供する経済的かつ効率的な方法を提供します。簡潔には、10本の鍼治療針（長さX 13ミリメートル、直径0.2 mm）を粘着テープによってバンドルに結合させました。目的の導入遺伝子を含むプラスミドDNAの10μgのPBS中の10μLの体積を剃毛、脱毛クリームで処理した脇腹皮膚上に置きました。皮膚の表面（1センチメートル×1 cm）を発振する鍼バンドルを使用して、角質層におけるケラチンを緩めし、表面に適用されるプラスミドDNAは、表皮に吸収させました。皮膚の損傷を監視し、最小限であることが判明しました。 acufected皮膚におけるトランスフェクトされた遺伝子の発現を、定量的リアルタイムPCR（定量RT-PCR）およびELISAの両方で確認しました。皮膚炎症に対するacufection送達IL-15ΔE7の免疫調節効果は、IMQ処理されたマウスモデル12を使用して実証されました。 acufectionは簡単で、あまりDEMAであると証明する一方でインビボにおける DNA送達のための方法をnding、異なる遺伝子及び皮膚を刺すための時間のDNAの最適量は注意深く再現性のある結果を得るために最適化されなければなりません。

<table><tbody><tr><td>Accu ハンディ ニードル</td><td>Accu</td><td>36Gx0.5</td><td>医療機器</td></tr><tr><td>NairTM ローション</td><td>チャーチドワイト</td><td>N/A</td><td>髪の毛を取り除くために使用</td></tr><tr><td>シャンドン キシリン代替品</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>6764506</td><td>脱パラフィン化</td></tr><tr><td>アベルチン (2,2,2-トリブロメタノール)</td> <td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T4,840-2</td><td>麻酔</td></tr><tr><td>2-メチル-2-ブタノール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>152463</td><td>アベリンの溶解のための溶剤</td></tr><tr><td>ディフコTM LB ブロス、ミラー</td><td>BD</td><td>244620</td><td>分子生物学のためのE. coliの増殖と維持</td></tr><tr><td>マウス IL-15/IL-15R 複合体 ELISA Ready-SET-Go キット</td><td>eBioscience</td><td>88-7215</td><td>IL-15 タンパク質の測定</td></tr><tr><td>抗マウス Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127601</td><td>免疫組織化学染色に使用される抗体</td></tr><tr><td>抗マウス Ki-67</td><td>eBioscience</td><td>14-5698-80</td><td>に使用される抗体免疫組織化学染色</td></tr><tr><td>Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)</td><td>ニチレイバイオサイエンス</td><td>414341F</td><td>マウスオンマウス染色のバックグラウンドシグナルをブロックする試薬</td></tr><tr><td>DAB ペルオキシダーゼ(HRP) 基質キット</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>免疫組織化学染色用ペルオキシドーゼ基質</td></tr><tr><td>Ultra Vブロック</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>TA-060-UB</td><td>非特異的バックグラウンド染色の低減</td></tr><tr><td>メチルグリーン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8884</td><td>核染色</td></tr><tr><td>Vecta MountTM</td><td>Vector Laboratories</td><td>M-5000</td><td>組織化学染色の永久保存</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td><td>ロシュ</td><td>04-693-116-001</td><td>細胞溶解物中のプロテアーゼ活性を阻害する</td></tr><tr><td>アルダラクリーム</td><td>3M Parmaceuticals</td><td>N/A</td><td>5% imiquimod クリーム</td></tr><tr><td>ベスマン 組織粉砕機</td><td>スペクトラムラボ</td><td>189475</td><td>皮膚組織を粉砕するために使用</td></tr><tr><td>ABI7900HT サイクラー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>N/A</td><td>定量的リアルタイムPCRアッセイ</td></tr><tr><td>ビデオカメラ</td><td>パナソニック</td><td>HDC-SD60</td><td>画像ドキュメンテーション</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>ツァイス</td><td>N/A</td><td>明視野顕微鏡</td></tr></tbody></table>

「acufection」と肌の研究への応用により、経済的なdnaデリバリーシステムの開発

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

皮膚の免疫応答の調節不全は、多くの人間の皮膚疾患と関連しています。皮膚組織への免疫関連遺伝子の直接転写は、ヒト疾患のマウスモデルにおける皮膚炎症の免疫調節を調査するための魅力的なアプローチです。ここでは、マウスの皮膚に裸のDNAを提供し、導入遺伝子の発現をもたらすコスト効率のプロトコルを提示します。この方法は、ACUパンク媒介DNAトランスフェクションを示す、「acufection」を造語しています。 acufectionを実行するために、マウスの皮膚は、最初のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中にDNAを注入した後、細胞にDNAおよびトランスフェクションの吸収を容易にするために、鍼治療針の束で軽く刺しました。プラスミドDNAは、おそらく、ケラチノサイト及び皮膚での樹状細胞（DC）によって取り込まれ、タンパク質に発現されます。針自体に機械的にプリックは、皮膚の損傷を引き起こしたり、ケラチノサイトの活性化を誘導しませんでした。表現トランスフェクトされた遺伝子の2日間acufection次転写および翻訳の両方のレベルで皮膚中で検出されたと7日まで維持。このacufection法の開発のための第一の目標は、IL-15の以前に未定義のアイソフォームを調査することでした。炎症を誘導するために、皮膚中で発現させ、続いてToll様受容体7（TLR7）アゴニスト、イミキモド（IMQ）で処理し、この方法は、部分的に欠失し、エクソン7（IL-15ΔE7）と選択的にスプライシングされたIL-15アイソフォームを用いました。皮膚におけるAcufection送達IL-15ΔE7はIMQ誘発性皮膚炎症においてケラチノサイト増殖、表皮の厚さと好中球動員を抑制しました。皮膚炎症の調節機構を同定することに関心の高まりとともに、ここで説明するプロトコルは、 インビボにおける DNA送達のための遺伝子銃システム又はmicroseedingに費用効果的かつ多目的な代替物を提供します。これは、潜在的に小説の機能の発見を可能にすることができます皮膚内または皮膚疾患の新しい治療法を調査するための遺伝子。

いくつかの赤みが鍼治療針を穿刺した後に最初の時間以内に明らかであったが、皮膚は2日目にクリアされ、7日目までの有害な皮膚反応は、（ 図2A）を穿刺した後に観察されませんでした。針の穿刺は、未処置皮膚（ 図2B）と比較してH＆E分析によって表皮orthokeratosisと最小の皮膚浸透の非常に低いレベルを誘導しました。表皮の厚さ（ 図2C）およびKi67 +細胞（ 図2D）の数は、鍼灸針穿刺皮膚は、表皮が顕著に組織破壊又は細胞増殖を引き起こさなかったことを実証し、ニードル刺しと未処理の皮膚との間で同等でした。ケモカインCXCLの発現レベルの低下を誘導した鍼治療針で穿刺注射針（直径1.067ミリメートル）12、と比較-1および炎症誘発性サイトカインIL-6の2日目、5日...

このプロトコルは、マウスの皮膚に裸のプラスミドDNAを発現するための費用対効果の高い代替法です。プロトコルの全体的な目標は、皮膚の炎症における特定の遺伝子の機能的役割を描写するために皮膚組織への免疫関連遺伝子を提供することです。

「Acufection」と肌の研究への応用により、経済的なDNAデリバリーシステムの開発

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

この手順の全体的な目的は、免疫関連遺伝子を皮膚組織に導入し、皮膚炎症における特定の遺伝子の機能的な役割を明らかにすることです。この手法は、皮膚における新規遺伝子の機能解明や、乾癬などの皮膚疾患に対する新たな治療法の開発に役立ちます。この手法の主な利点は、マウスの皮膚においてプラスミドDNAを発現させるための費用対効果の高い方法を提供できることです。プラスミドDNAを調製するには、あらかじめ形質転換および選別を行った細菌コロニーを、抗剤を添加したLB培地3 mLに接種します。この培養液をシェーカーを用い、37 °Cで一晩インキュベートします。一晩の培養後、抗生物質を添加した250 millilitersのLB培地で細菌培養液を希釈し、培養規模を拡大させる。37 degrees Celsiusで振盪しながら一晩培養する。高品質なエンドトキシンフリープラスミド調製キットを用いて、大量のDNAを調製する。得られたプラスミドDNAを滅菌PBSで希釈し、最終濃度を1 mg/mLにします。マウスを麻酔後、乾燥を防ぐために眼科用動物用軟膏を眼に塗布します。その後、動物の背中の皮膚を剃毛します。次に、除毛クリームを塗布して、残っている毛幹のケラチンタンパク質を溶解させます。除毛後、水に浸した綿でクリームを拭き取ります。70% ethanolに浸した滅菌綿棒を使用して皮膚表面を消毒し、あらかじめ用意したテンプレートを用いて標的となる皮膚領域をマークします。10 µgのプラスミドDNAを含むDNA溶液10 µLを、目的の皮膚領域に投与します。マウスにアキュフェクト（acufect）を行うには、鍼治療装置を皮膚に対して垂直に保持し、指定された表面を繰り返し穿刺します。穿刺回数は30秒間で100回、または皮膚に塗布した溶液が吸収されるまで行います。皮膚組織でプラスミドDNAを適切に発現させるには、皮膚を深く切りすぎないように注意し、DNA溶液が十分に吸収されるようにすることが重要です。処置の完了後、麻酔から回復するまでマウスの体温を維持するため、マウスをヒーティングパッドの上に置きます。マウスの意識が十分に回復したらケージに戻し、水と餌を与えます。処置後の最初の48時間は、行動の変化や外見の異常など、不快感を示す症状がないか、マウスを注意深く観察してください。あらかじめIL-15deltaE7を投与した2 cm × 2 cmの側腹部皮膚領域にマーキングを行います。次に、綿棒を用いて、指定した表面積にイミキモドクリームを局所的に塗布します。イミキモド処理した背部皮膚の日次変化をモニタリングするため、1人の研究者が記録を行い、もう1人の研究者がマウスをしっかりと固定して、処理領域を高精細ビデオカメラに映し出します。処置した皮膚に、銀色の鱗屑、プラーク、または紅斑などの変化がないか観察します。記載の手順でマウスを安楽死させた後、血清学的ハサミを用いて尾の付け根に水平に切開を加え、左右それぞれの後肢の付け根に向かって切開線を広げます。次に、側腹部と平行に、4本の肢の付け根に達するまで垂直に切開します。動物の尾側から頭側に向かって、下層組織から皮膚を慎重に剥離します。鋏を用いて背側皮膚を切り出し、得られた試料を滅菌済みのシャーレに移します。メスを用いて、目的の皮膚の適切な試料を切り出します。その後、直ちに液体窒素で凍結させます。皮膚組織を粉砕するため、あらかじめ冷却しておいたハンドルと乳棒を備えた2室式組織粉砕機の中心に凍結サンプルを置き、乳鉢にリードハンマーを用いて衝撃を加えます。粉砕した組織は、直ちにその後の解析に適した試薬が入った新しいチューブに移してください。テキストのプロトコルに従って準備したホルマリン固定パラフィン包埋皮膚切片のスライドを、65 °Cで15分間加熱し、染色手順を開始します。スライドをキシレンに2回、各5分間浸します。その後、エタノール勾配を用いてスライドを再水和させます。最後に、染色の前にスライドを水道水で3分間洗浄します。免疫組織化学染色の場合は、まず防水ペンで組織の周囲に円を描き、次に非特異的なバックグラウンド染色を除去するために、切片をブロッキング液でインキュベートします。ブロッキング後、スライドをPBSで洗浄します。次に、希釈した一次抗体を切片にピペッティングし、室温で60分間インキュベートします。スライドをTBSTで5分間ずつ3回洗浄します。その後、標識ポリマーを1滴切片に滴下し、スライドを室温で40分間インキュベートします。その後、スライドをTBSTで5分間、溶液を替えて3回洗浄します。次に、組織切片にDAB溶液を100 microliters添加し、室温で反応させます。顕微鏡下で茶色の生成物が観察されるまで待ちます。次に、スライドを水で洗浄し、ペルオキシダーゼ活性を停止させます。DNAに特異的に結合するMethyl Green溶液を用いて、切片を5秒間対比染色します。その後、PBSで5分間ずつ3回スライドを洗浄します。染色した切片に8 µLの永久封入剤を滴下し、カバーガラスで覆います。最後に、テキストプロトコルに従ってスライドの画像撮影を行います。ここでは、コントロールマウスと、写真撮影の1時間前、2日前、5日前、または7日前に感染させたマウスを示しています。ここに示すように、acufectionの手順による顕著な皮膚損傷は認められませんでした。さらに、acufectionは皮膚の厚さおよびKi67陽性細胞数のいずれにも影響を与えませんでした。これにより、本手順が組織破壊や表皮細胞の増殖を引き起こさないことがさらに確認されました。qRT-PCRを用いて測定したCXCL-1およびIL-6の発現。acufection下で観察されたケラチノサイトの活性化が最小限であることを裏付けている。一方で、qRT-PCRおよびELISAにより、IL-15遺伝子をacufectionしたマウスの皮膚において、IL-15の顕著な発現が示された。最終的に、acufectionを介した皮膚組織へのIL-15deltaE7遺伝子の導入は、イミキモド投与マウスにおける皮膚の剥離および好中球浸潤の発現を抑制します。この手順を習得すれば、適切に実施することで12分で完了させることが可能です。本手順を行う際は、acufectionごとに新しい針の束を用意すること、および高品質なプラスミドDNAバッチを準備することを忘れないでください。本手順に従い、新規遺伝子が抗ウイルス免疫応答の調節に果たす機能など、さらなる疑問を解消するために、ウイルス感染などの他の手法を実施することができます。本手法の開発により、免疫学分野の研究者が皮膚における免疫応答を探索するための道が開かれることになります。このビデオを視聴することで、コスト効率の良い方法でマウスの皮膚にプラスミドDNAの発現を誘導する方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶ経済的なプラスミドDNA発現法でマウス皮膚に免疫関連遺伝子を導入し、皮膚炎症における遺伝子機能を解明する。乾癬などの皮膚疾患治療開発に貢献する革新的アプローチです。

「Acufection」と肌の研究への応用により、経済的なDNAデリバリーシステムの開発

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