ゼブラフィッシュの開発の長期イメージングのための多彩な取り付け方法
2017年1月26日
ここでは、正常な発達を乱すことなく、生きたゼブラフィッシュの胚の後部体の発達を長期間のタイムラプスイメージングを可能にする汎用性の高いマウント方法を紹介します。
この方法の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの胚をライブイメージング用にマウントし、後部体領域の正常な成長を可能にすることです。この方法は、発生中のゼブラフィッシュの他の領域のイメージングに適合させることができます。この手法は、個々の細胞の挙動が全組織レベルでの形態形成にどのようにつながるかなど、発生生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。
この技術の主な利点は、胚を正しい向きに保ちながら、後部体の自由な瞬間を可能にすることです。まず、最終濃度1.5%の低融点アガロースを50ミリリットルのチューブ内のE3培地に加え、アガロースを電子レンジで加熱して溶解します。溶液をウォーターバスまたはベンチトップインキュベーターで摂氏42〜45度に平衡化させます。
テキストプロトコルに従ってガラス針を引っ張った後。一対の鉗子を使用して、針が曲がる点を過ぎて針を折って、胚の向きを整え、余分なアガロースを取り除くための清潔で鋭い針を作成します。E3培地で胚を適切な段階まで上げます。
次に、双眼解剖顕微鏡下で、一対の鋭い鉗子を使用して胚を解剖します。デコレーションされた胚をトリカイン作業溶液中で少なくとも5分間インキュベートします。.次に、ガラス製のパスツールピペットを使用して、最小限のE3で脱窩化した胚を摂氏45度のアガロースの50ミリリットルチューブに直接移します。
胚を約1ミリリットルのマウンティングアガロースと共に取り出し、約100マイクロリットルの胚を含む培地を35ミリメートルガラス底シャーレの底部にある10ミリメートルマイクロウェルの中心に移す。封入剤が固まっている間、尾を外側に向けて、胚をアガロースの円の端に移動します。毛細血管針を使用して、胚をできるだけ横方向に向け、後部の体の発達を画像化します。
次に、毛細血管を使用して、ゲルが完全に固まるまで胚を所望の横方向に維持します。アガロース液滴が固まったら、トリカイン作業溶液を使用してペトリ皿を浸します。次に、透過光ベースを備えた解剖顕微鏡で、ミラーの位置と入射光の角度を調整し、強いコントラストによりアガロースの切り傷がはっきりと見えるようにします。
カット1を実行するには、毛細血管針またはマイクロメスを使用して、卵黄に隣接し、卵黄に沿って中間に、形成心臓フィールドのすぐ後方で、アガロースを介してガラスまで完全にアガロースを上下に切断します。ここでは、卵黄袋の上でアガロースを切断する際に胚が損傷を受けないようにすることが重要です。次に、胚からガラスまで、最初の5つの体節に接する方向に、2番目と3番目のカットを行い、後体の背側展開を可能にします。
次に、カット1とカット3の交点から始めて、カット3の終わりに向かってゆっくりと斜めにカットを行い、ゆっくりと上に持ち上げて後体を囲むアガロースの正方形を取り除きます。一対の鋭い鉗子を使用して、アガロース片を持ち上げながら、ペトリ皿の壁を支えとして使用して、外れたアガロースのブロックを胚培地から取り除きます。サンプルを埋込する前に、E3で1%アガロースを使用して、100mmのプラスチック皿を5mmの高さまでコーティングし、固めます。
次に、1ミリリットルの低融点アガロースを皿の中央に一滴垂らし、それも固めるのを待ちます。このビデオで前述したように、胚を低融点アガロースに埋め込みます。ただし、今回は、50ミリリットルのアガロースチューブから胚を少量の溶液で取り出し、この小さな滴を皿の中央にある1ミリリットルの滴の上に置きます。
毛細血管針を使用して、胚を小さな滴の中心に配置し、ゲルがセットされるまで正しい向きを維持します。最後に、トリカイン作業溶液を使用して皿を浸水させ、余分なアガロースを取り除きます。ゼブラフィッシュの胚に光変換性蛍光タンパク質kikumeGRのmRNAコードを注入し、15体節ステージにマウントし、12時間のタイムラプスイマジンを行った例を動画アニメーションで紹介しています。
後部体は自由に動くことが許されており、通常の培養条件で絨毛膜から解放されて発育することが許されている胚に見られるのと同様の形態の変化を示します。このビデオでは、核を標識するヒストン2BRFPをコードするmRNAと、細胞膜を標識するCAAXGFPを16細胞段階で胚に注入しました。画像は、尾芽形成中の細胞の挙動を視覚化するために、10体節段階から25倍水浸対物レンズを備えた直立多光子顕微鏡で3時間撮影されました。
細胞は、尾の芽が正常に形成されるときに、活発な突起と方向運動を生成するのを見ることができます。一度習得すると、このテクニックは適切に行われれば20分で実行できます。この手順を実行するときは、アガロースゲルが硬化している間、胚が横方向の位置にあることを確認することが重要です。
そうしないと、イメージング中に関心領域が視野から急速に移動します。このビデオを見れば、後体伸長のライブイメージングのためにゼブラフィッシュの胚をマウントする方法を明確に理解できるはずです。
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概要
本記事では、ゼブラフィッシュ胚の長期タイムラプスイメージング、特に後方体部の発達に焦点を当てた汎用性の高いマウンティング法を紹介します。この手法により、形態形成中の細胞挙動の詳細な観察を可能にしつつ、正常な発育を維持させることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 発生生物学
- ライブイメージング技術
- ゼブラフィッシュ胚発生学
背景
- 形態形成の理解は、発生生物学において極めて重要です。
- ゼブラフィッシュは、脊椎動物の発生を研究するためのモデル生物です。
- ライブイメージング技術により、細胞ダイナミクスに関する知見を得ることができます。
- イメージング中に正常な発生を維持することは、大きな課題となります。
研究目的
- ライブイメージング用にゼブラフィッシュ胚を固定する方法を開発すること。
- 正常な発生を妨げることなく、後方体節領域の伸展を観察すること。
- 組織形態形成における個々の細胞挙動の研究を容易にすること。
使用した手法
- 低融点アガロース溶液の調製。
- イメージングのためのアガロースへのゼブラフィッシュ胚の固定。
- 観察中の胚の適切な向きの維持。
- 発生中のゼブラフィッシュの他の領域のイメージングへの本手法の適応。
主な結果
- この手法により、体の後方領域を自由に動かすことができます。
- イメージングの間、胚の正常な発生が維持されます。
- 重要な細胞挙動をリアルタイムで観察することが可能です。
- この技術は、さまざまな発生研究に適応させることができます。
結論
- この固定方法は、ゼブラフィッシュ胚の長期イメージングに有効です。
- これにより、発生過程に関する貴重な知見が得られます。
- 本手法は、発生生物学の研究を促進させることができます。
よくある質問
産業界における重要性
バイオ医薬品の研究開発において、脊椎動物の発生過程を信頼性の高いライブイメージングで捉えることは、生理学的に関連のある系で形態形成メカニズムの観察を可能にし、ターゲットのバリデーションやフェノタイプスクリーニングを支援します。このゼブラフィッシュのマウント法は、組織の伸長や細胞ダイナミクスに対する化合物の影響を評価するための再現性のあるプラットフォームを提供し、初期創薬におけるメカニズム解明によるリスク低減に寄与します。さまざまな顕微鏡セットアップに適応可能なため、前臨床モデル評価におけるワークフローの柔軟性と部門間連携が向上します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的活用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 後方の身体伸長を形態形成経路解析のための疾患関連システムとして可視化することで、治療仮説の検証を可能にします。
- 運用的価値： 発達を阻害することなく組織の伸長を縦断的に観察することで、機能的ターゲットのバリデーションを支援します。
- 予測的価値： 脊椎動物の発達における細胞突起および方向性運動を表現型のアウトカムに関連付けることで、リード化合物の特定を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備： 定量的なライブイメージングに向けてゼブラフィッシュ胚を標準化して調製し、化合物曝露中の方向性を一定に保ち、摂動を最小限に抑えます。
- 再現性： アガロース埋没プロトコルにより、正立型、倒立型、およびライトシート顕微鏡プラットフォーム全体で信頼性の高いサンプル調製が可能です。
- 拡張性： 複数の胚を並行してタイムラプスイメージングするための調製を可能にし、発生表現型の中スループットスクリーニングをサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：ヒトの発達障害に適用可能な、保存された形態形成プロセスの研究のための脊椎動物モデルシステムを提供します。
- トランスレーショナルな連続性：イメージング中に正常な発生を維持することで、細胞挙動の発見的な観察と前臨床検証を橋渡しします。
- リスク調整後の意思決定：個体レベルでの表現型変化を作用機序と結びつけることにより、ターゲット調節に対する予測的な信頼性を生み出します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、標的仮説の検証からリード最適化に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれ、脊椎動物の発達に関するメカニズム研究に最適なイメージング用モデルを提供します。
- 発見生物学：後方体節伸長において、細胞挙動がいかに組織レベルの形態形成を駆動するかを可視化することで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：組織の伸長および細胞移動に関する定量的リードアウトを伴うアッセイ準備済みサンプルを提供し、化合物の効果比較を容易にします。
- 解析：発生過程における細胞 protrusions（突起）、方向性遊走、および形態変化の追跡に適したタイムラプスデータセットを生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：観察中の正常な胚発生を維持することで、初期発見イメージングから前臨床への継続性を繋ぎます。
- エンタープライズ再利用：複数の発生段階および領域に適用可能な再利用可能なマウンティング機能を確立し、冗長なプロトコル開発を削減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：脊椎動物の形態形成におけるメカニズムの曖昧さを排除することで、ターゲットバリデーションの予測信頼性を向上させます。
- 運用的価値：アガロース包埋および方向決定の手順を定義することで、異なる顕微鏡プラットフォーム間での標準化と再現性を確保します。
- 戦略的価値：個体レベルのコンテキストにおいて、発生毒性やパスウェイ調節を早期に検出することを可能にし、go/no-go判定の精度を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：組織伸長プロセスに影響を与えるリード化合物の選別（トリアージ）に必要な定量的表現型データを提供し、リスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- ゼブラフィッシュの胚学および、胚の取り扱いとアガロース操作のための微小外科的手法に関する専門知識が必要です。
- 温度制御水槽、マイクロウェル、およびガラス底ディッシュに対応した顕微鏡システムの利用が前提となります。
- ゲルの特性を一定にするため、チーム間でアガロース濃度（1.5%）および平衡温度（42–45°C）を標準化させる必要があります。
- 他のモデルシステムに適応させる場合は、発生の自由度を維持するために、埋込密度と方向性の制約を最適化する必要があるかもしれません。
- 実用上の制限として、胚1個あたり20分のセットアップ時間が必要なこと、および関心領域のドリフトを防ぐためにゲル凝固時に慎重に方向を調整する必要があることが挙げられます。
