走査型透過電子トモグラフィーにより太い生物学的サンプルの調製と観察

この手順の全体的な目標は、収束ビーム走査型透過型電子トモグラフィーを使用して、厚い生体試料の被写界深度回復を伴う3次元再構成を取得することです。この手法は、厚い生体試料の電子線トモグラフィーに関する構造生物学の分野における重要な疑問に答えることができます。この手法の主な利点は、画像を収束ビットモードで取得でき、データ処理をトモグラフィー専用のほとんどのソフトウェアで実行できることです。

細胞培養サンプルの調製を開始するには、サンプルを5000 x gで5分間遠心分離します。これらの遠心分離パラメータは、サンプル調製全体を通して使用します。上清を捨て、4%パラホルムアルデヒドと2%グルテルアルデヒドが豊富なPBS1ミリリットルに細胞を再懸濁します。

懸濁液を室温で30分間インキュベートします。混合物を遠心分離し、上清を捨て、ペレットを1ミリリットルのPBSで3回洗浄します。同じインキュベーション条件と洗浄手順を使用して、ペレットを1%四酸化オスミウムが豊富な1ミリリットルのPBSと、2%酢酸ウラニルが豊富な1ミリリットルのPBSでインキュベートします。

次に、サンプルを摂氏4度に冷却します。ますます濃縮されたエタノール溶液中で連続的にインキュベートすることにより、ペレットを脱水します。インキュベーション、遠心分離、洗浄を通じてサンプル温度を摂氏4度に保ちます。

脱水したペレットを1ミリリットルの純粋なエタノールに再懸濁し、摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、サンプルを室温まで温め、サンプルを遠心分離します。ペレットを、ますます濃縮されたエポキシ樹脂溶液で室温でインキュベートします。

最終洗浄後、ペレットを1ミリリットルの純エポキシ樹脂に再懸濁し、室温で一晩インキュベートします。サンプルを遠心分離機にかけ、上清を取り除き、ペレットを200マイクロリットルのエポキシ樹脂と硬化剤に再懸濁します。懸濁液をカプセルに移します。

プラスチックカプセルを摂氏60度で48時間インキュベートし、樹脂を重合します。インキュベーターからカプセルを取り出し、樹脂の重合を確認します。埋め込まれたサンプルの上にエポキシ樹脂と硬化剤の層を追加し、同じ条件下でカプセルを再度インキュベートします。

レジンに埋め込まれたサンプルを逆さまにして試料ホルダーに取り付けます。サンプルをウルトラミクロトームのトリミングブロックにしっかりと固定します。プラスチックカプセルをレジンのサンプルから切り離します。

露出した樹脂をピラミッド状に成形します。次に、カプセルと検体ホルダーをウルトラミクロトームの可動アームに移します。トリミングナイフを取り付け、顕微鏡でガイドして、ピラミッドの形状を洗練します。

トリミングナイフを組織学ナイフと交換します。顕微鏡下で、ピラミッドがナイフの刃に対して垂直になるようにカプセルのピッチ角を調整します。切断速度を設定し、サンプルを切片にします。

サンプルを切片化した後、選択した切片を濾紙で処理された銅グリッドに移します。サンプルを乾燥させてから、サンプルを電子顕微鏡にロードします。スルーフォーカルチルトシリーズを設計するには、まず電子ビームの被写界深度とサンプルの最大見かけの厚さを計算します。

これらの値に基づいて、焦点間隔を選択し、サンプル全体を最大見かけの厚さでイメージングするために必要な焦点ステップ数を決定します。次に、低倍率で、サンプル内の関心領域を特定します。サンプルを回転させたときにROIが動いて見えないように、ユーセントリック高さを調整します。

ROI がチルト範囲全体で表示されたままであることを確認します。自動画像収集のために、焦点傾斜シリーズパラメータを通し、画像を取得します。画像シリーズを画像処理プログラムにインポートし、収集した画像をピラミッド型の階層で同じ傾斜角度で位置合わせします。

整列した画像を積み重ねて、各傾斜角度での位置合わせを見つけます。スタックを参照して、フォーカスされた領域のみが画像から画像に移動することを確認し、必要に応じて画像を再調整します。サンプル全体でアライメントが確認されたら、高設定でピントの合った情報をマージして、傾斜角度ごとに 1 つの画像を持つシリーズを生成します。

局所的な最小値または基準マーカーに基づいて傾斜系列の整列を検出します。3-D 再構成を実行し、結果の画像を調べます。再構築がぼやけたり変形したりする場合は、元の画像シリーズを再調整します。

この方法を用いて、T. bruceiのサンプルを画像化し、分析しました。0度の傾斜角度で、べん毛ポケットのいくつかの細部が見えます。

70 度の傾斜角が高いと、スルー フォーカル シリーズで収集された各画像の一部のみがピントが合います。この位置はシリーズ全体で変化します。ピントが合っているセクションをマージすると、より大きなピント ゾーンを持つ 1 つの画像が生成されます。

この効果は、スルーフォーカルチルトシリーズの高周波領域が強調表示されると、さらに顕著になります。高周波情報は結合された画像の大部分にまたがっており、スルーフォーカルチルトシリーズが適切に処理されていることを示しています。一度習得すると、画像処理部分は、選択したアライメントと再構成のパラメータにもよりますが、約3〜4時間で完了します。

この手順を試行する際には、最終的な再構成の品質が以前のアライメントテストの品質に大きく依存することを覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、焦点チルトシリーズの収集方法と画像処理の実行方法について十分に理解しているはずです。