Name: 内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学ぶ単一細胞遺伝子発現プロファイリング法。内部標準を用いたマイクロ流体qPCRにより、哺乳類単一細胞のmRNAレベルを定量化し、刺激応答における細胞集団の異なる反応を解析します。FACSによる細胞分離と96遺伝子同時測定が可能です。

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私たちは、このプロトコルの開発中に細胞選別を行うの彼女の援助のためにCCR ETIBフローサイトメトリーコアでV.カプールに感謝したいと思います。また、このプロトコルの開発中に定量PCRを行う際の援助のためにM. RaffeldとCCR LP分子診断ユニットとJ.朱とNHLBI DNA配列決定およびゲノミクスコアに感謝します。この研究は、NIHの学内プログラムによってサポートされていました。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

我々は、培養で増殖させた接着性細胞の集団から個々の哺乳動物細胞を単離するため、各セル内の約96の遺伝子の発現をアッセイするための方法を提示しています。この方法がうまく機能するために良好な事前準備が重要です。プライマーは、単セル測定の品質を決定するように、特に興味のある転写物（1.2〜1.3ステップ）に特異的な設計およびテストプライマーペアは、時間がかかるが、重要なステップです。信頼性のあるプライマー対が得られたら、それらは、目的の転写物からcDNAを増幅するために使用されます。アンプリコンは、その後の規格（ステップ1.4）を作るために等モル量で組み合わされています。標準は絶対転写産物数を推定するために必要とされるので、このステップは重要です。規格は、一度作っ等分して、細胞選別および遺伝子発現測定値の後続のすべてのラウンドのために使用されるべきです。同様に、細胞がソートされた日に、それは特にimportanです溶解バッファーのプレートを作る際に慎重に（3.7および3.11ステップ）低結合ピペットチップやマイクロ遠心チューブを使用して標準を希釈するトン。 （ステップ4.2）セルソーターを目指して、別の重要なステップです。これは、細胞が正常に...

集団内の個々の細胞は均一な生理的刺激1、2、3、4に大幅に異なる応答を示すことができます。集団中の細胞の遺伝的変異は、応答のこの品種のための1つのメカニズムであるが、それでも細胞のクローン集団で、応答の変動性を向上させることができ、いくつかの非遺伝的要因もあります。例えば、個々のタンパク質および他の重要なシグナル伝達分子のレベルは、下流の遺伝子発現プロファイルの変化を生じる、セル単位で変化させることができます。さらに、遺伝子活性化は、バースト7,8,9あたりの転写物の比較的少数に限定することができる転写5,6の短時間のバーストで発生することができます。そのような遺伝子活性化における偶然性が大幅に生物学的応答の変動に寄与することができ、生理的刺激に応答して、微生物10におよび哺乳動物細胞1に2を選択的利点を提供することができます。変化の遺伝的および非遺伝的供給源の両方に、刺激に応答する任意の細胞の遺伝子発現プロファイルは、バルク応答の測定から得られた平均遺伝子発現プロファイルとは大きく異なっていてもよいです。個々の細胞は、刺激に応答して可変性を示す程度を決定することは、個々の細胞の単離のための技術は、目的の転写物の発現レベルを測定し、得られた発現データのコンピュータ分析を必要とします。 コストの広い範囲をカバーし、単一細胞における遺伝子発現をアッセイするためのいくつかのアプローチがあり、転写産物の数はプローブ、及び定量化の精度。例えば、単一細胞RNA-のSeqは、転写物のカバレッジと、個々の細胞の中で最も高度に発現される遺伝子のための別個の転写産物の数千を定量する能力の広い深さを提供しています。コストが減少し続けるが、しかし、このようなシーケンシングの深さに関連するコストは、法外することができます。逆に、in situハイブリダイゼーション（FISH smRNA） における単一分子RNAの蛍光は、目的の遺伝子につき合理的なコストであっても低発現遺伝子のための転写物の正確な定量を提供しています。しかしながら、標的遺伝子の少数は、このアプローチによって、所定の細胞においてアッセイすることができます。このプロトコールに記載定量的PCRベースのアッセイは、これらの技術の間の妥協点を提供します。これらのアッセイは、最大96個の細胞で一度に関心の96転写物まで定量化するために、マイクロ流体リアルタイムPCR装置を採用しています。前述の方法のそれぞれは、必要なハードウェアのコストを有しているが、任意の個々のqPCRアッセイのコストは比較的です低いです。このプロトコルは、（プロトコルADP 41、フリュー）マイクロ流体リアルタイムPCR装置の製造元が推奨する1から適応されます。 PCRベースのアプローチで各転写産物の絶対数の推定を可能にするために、我々は、複数の実験で使用できる準備標的遺伝子アンプリコンの内部統制を利用するプロトコルを拡大してきました。 この技術の一例として、MCF-7ヒト乳癌細胞において腫瘍抑制因子p53によって調節される遺伝子の発現の定量化は、11に記載されています。細胞は、DNA二本鎖切断を誘発する化学物質でチャレンジされています。以前の研究は、DNA二重鎖切断に対するp53応答は、p53レベル12の観点と異なる標的遺伝子11の活性化の両方で、個々の細胞における異質性を大いに発揮することが示されています。さらに、p53は100以上の発現を調節します細胞周期停止、アポトーシス及び老化13、14を含む多くの下流経路に関与する標的遺伝子を十分に特徴付け。各細胞におけるp53媒介性応答は、複雑かつ可変でもあるので、アプローチからシステムの利点の分析とは、約100の標的遺伝子は、以下に記載されるような個々の細胞、同時にプローブすることができます。 （例えば、単一細胞の単離および溶解のための代替方法として）わずかな変更を加えて、プロトコルは、容易に、哺乳動物の細胞型、転写、および細胞応答の広い範囲を研究するために適合させることができます。 適切な事前準備で、細胞選別および遺伝子発現測定のラウンドは、3日間にわたって、このプロトコルに従って行うことができます。 、事前に関心の転写産物を選択し、それらのtranscrからcDNAを増幅するプライマー対を識別し、検証：以下のタイミングが示唆されていますIPTSは、および標準とそれらのプライマーを用いてプライマーミックスを準備します。細胞治療の後、1日目に、収穫と逆転写および特定の標的増幅を行い、細胞を選別し、取り込まれなかったプライマーを除去するためにエキソヌクレアーゼでサンプルを扱います。 2日目、定量PCRを使用して選別した細胞上の品質管理を行います。最後に、3日目に、マイクロ流体定量PCRを使用して選別した細胞における遺伝子発現を測定します。 図1は、必要な手順をまとめたものです。

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plusミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>大容量cDNA逆転写キット RNase阻害剤</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT 高感度dsDNAアッセイキット</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーQ33120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml 低接着マイクロ遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>DNA 懸濁液バッファー</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0.2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR チューブ</td><td>Corning</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 ダイナミックアレイ DNA 結合色素 サンプル &アッセイローディング試薬キット</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 media</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定(米国)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤溶液</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>ネオカルジノスタチン</td><td>Σ</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect ワンステップ qRT-PCR キット</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal シーリングフィルム、滅菌済み</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BDBiosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0.05%</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 & micro;m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low</td><td>ROX Bio-Rad</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>IFC Controller HX (loading machine)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMarkまたはBioMark HD(マイクロ流体qPCR装置)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リアルタイムPCR解析ソフトウェア&nbsp;</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLABソフトウェア</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

内部標準でfacsおよび定量pcrを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

細胞のバルク集団からの遺伝子発現測定は、それらの集団内の個々の細胞のかなりのトランスクリプトーム変動を覆い隠すことができます。シングルセルの遺伝子発現測定は、遺伝子発現におけるノイズの役割を評価し、遺伝子ペアの発現における相関関係を特定し、刺激に対して異なる反応を示す細胞の亜集団を明らかにするのに役立ちます。ここでは、組織培養で増殖する集団から単離された単一の哺乳動物細胞における最大96個の遺伝子の発現を測定する手順について説明します。細胞は蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって溶解バッファーにソーティングされ、目的のmRNA種は逆転写および増幅されます。次に、マイクロ流体リアルタイムPCR装置を使用して遺伝子発現を測定し、一度に最大96のサンプルに対して最大96のqPCRアッセイを実行します。また、各転写産物の絶対数の推定を可能にするためのPCRアンプリコン標準品の作製と使用についても説明します。このアプローチでは、シングルセルでの遺伝子発現を測定する他の方法と比較して、RNA-Seqよりも低コストでRNA FISHよりも異なる転写産物を定量することができます。

プロトコルの一般的な概要は、細胞治療、FACSによる単一細胞の単離、単一細胞溶解物からのcDNAライブラリーの生成および前増幅、単一細胞cDNAライブラリーを確認するステップを含む、 図1に示されていますソートされたウェル、および定量PCRにより遺伝子発現を測定します。 単一細胞の単離および遺伝子発現分析の準備のために、最初に、目的の各標的遺伝子のために有効なオリゴヌクレオチドプライマー対を特定する必要があります。 図2は、プライマーの品質管理方法の2つの例を示しています。溶融曲線は、プライマーペアがテストされていると定量PCRを以下に生成されます。有効なプライマーは、単一のピーク（ 図2A、緑の曲線）との融解曲線になります。複数のピーク（ 図2A、青の曲線）または顕著な肩の曲線（Figur</stro...

私たちは、単一の哺乳類細胞を選別し、各細胞における最大96の標的遺伝子の発現を定量化する方法を説明しています。この方法には、絶対転写産物数の推定を可能にするための内部qPCR標準の使用が含まれます。

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

この手順の全体的な目的は、内部標準を用いたマイクロ流体qPCRにより、個々の細胞におけるmRNAレベルを定量化することです。この手法は、細胞集団が刺激に対して特徴的に異なる反応を示すかなど、単一細胞生物学の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、単一細胞において、RNA FISHよりも多くの遺伝子の発現を測定でき、かつRNA-Seqよりも低コストで実施できる点にあります。私たちは、マイクロ流体qPCRを用いて単一細胞内の遺伝子発現を測定するプロトコルを検討していた際に、最初はこの手法を考案しました。既存の手法を修正し、単一細胞における異なる転写産物の絶対数をより正確に推定したいと考えたためです。細胞ソーティングの手順については、私の研究室で利用しているフローサイトメトリー施設のマネージャーであるWilliam Telfordが実演します。テキストプロトコルに従って目的遺伝子の増幅産物を生成および精製した後、2.0 mL低吸着マイクロ遠心チューブに各精製増幅産物を18 µLずつ混合し、各増幅産物の濃度が5×10⁶ molecules/µLとなるよう、DNA懸濁バッファーを1,800 µLまで加えます。この5e6標準液を十分にボルテックスし、低吸着PCRチューブに20 µLずつ分注します。テキストプロトコルに従ってMCF7 p53-Venus細胞を播種した後、細胞に400 ng/mLのネオカルジノスタチンを添加し、3、8.5、14、または24時間処理します。ライシスバッファーを調製するには、この表に記載されている試薬を混合します。このバッファーのうち92.4 µLを別のチューブに移し、アンプリコン標準試料用のライシスバッファーとして使用します。残りのライシスバッファーは細胞用に使用します。テキストプロトコルに従い、E.coli DNAを調製し、細胞用溶解バッファーに添加します。標準試料を調製するために、6本の低吸着遠心チューブにラベルを貼ります。5e5チューブに90 µLのDNA懸濁バッファーを加えます。1 µLあたり6.2 pgのE.coli DNAを含むバッファーを、他の5本のチューブそれぞれに90 µLずつ加え、すべてのチューブを氷上に保持します。保存状態にある5e6標準液のアリコートを取り出し、チューブを短時間ボルテックスした後、スピンダウンして液体をチューブの底に集めます。次に、低吸着ピペットチップを使用して、5e6標準液10 µLを5e5チューブに加えます。ボルテックスおよびスピンダウンを行い、チューブを再び氷上に戻します。次に、5e5チューブから10 microlitersを5e4チューブにピペットで分注し、チューブを短時間ボルテックスして遠心分離した後、再び氷上に置きます。この連続希釈を、前のチューブから10 micr

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

単一細胞の発現プロファイリングは、個々の細胞の詳細な遺伝子発現解析が可能になります。我々は心筋細胞の単離のための方法を説明し、特定のターゲットの全トランスクリプトームのマイクロアレイや定量PCRのどちらかの結果のライセートを調製した。...

成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

単一網膜細胞およびそれらのcDNAのその後の増幅を単離するための方法が説明されています。単一細胞トランスクリプトーム組織内に存在する細胞の不均質性の程度を明らかにし、まれな細胞集団の新たなマーカー遺伝子を発見します。付随するプロトコルは、多くの異なる種類の細胞に合わせて調整することができます。...

単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞

私たちは、脳脊髄液（CSF）中のマイクロRNAをプロファイリングするリアルタイムPCRのプロトコルを記述します。 RNA抽出プロトコールを除いて、手順は他の体液、培養細胞、または組織試料から抽出したRNAに拡張することができる。...

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

単一細胞の遺伝子発現アッセイは、幹細胞の不均質性を理解するために必要とされる。...

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚から単一細胞を分離する方法、目的の細胞を濃縮する方法、マイクロ流体ベースの単一細胞マルチプレックスシステムでゼブラフィッシュ細胞を捕捉する方法、および単一細胞からの遺伝子発現を評価する方法を説明しています。...

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

このプロトコルは、クローンレベルでの遺伝子の大規模な配列の発現を評価する方法について説明します。単一細胞RT-qPCRをサンプルと数百の遺伝子のための強力な感度を有する信頼性の高い結果が得られます。...

レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現

一括遺伝子発現測定クラウド個々 のセル違い異種細胞集団で。ここでは、プロトコルについて述べる方法単一細胞遺伝子発現解析とインデックスの不均一性の線引きによって蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) を並べ替えを結合でき、immunophenotypically...

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

本手法はホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)RNAサンプルから得ることができる配列データの質と量を改善するステップを説明する。我々は、FFPE-RNAサンプルの品質をより正確に評価し、シーケンシングライブラリを準備し、FFPE-RNAサンプルからのデータを分析するための方法論を説明する。...

分解されたFFPE-RNAサンプルのシーケンシングと分析の最適化

この場合の単一分子RNA蛍光蛍光(smFISH)は、単一細胞レベルで特異的なRNAのレベルおよび局在を正確に定量する方法です。ここでは、特定のRNAの単一細胞定量化のためのウェットベンチ処理、イメージングおよび画像解析のための検証済みのラボプロトコルを報告します。...

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

学ぶ単一細胞遺伝子発現プロファイリング法。内部標準を用いたマイクロ流体qPCRにより、哺乳類単一細胞のmRNAレベルを定量化し、刺激応答における細胞集団の異なる反応を解析します。FACSによる細胞分離と96遺伝子同時測定が可能です。

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

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