Name: 内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学ぶ単一細胞遺伝子発現プロファイリング法。内部標準を用いたマイクロ流体qPCRにより、哺乳類単一細胞のmRNAレベルを定量化し、刺激応答における細胞集団の異なる反応を解析します。FACSによる細胞分離と96遺伝子同時測定が可能です。

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私たちは、このプロトコルの開発中に細胞選別を行うの彼女の援助のためにCCR ETIBフローサイトメトリーコアでV.カプールに感謝したいと思います。また、このプロトコルの開発中に定量PCRを行う際の援助のためにM. RaffeldとCCR LP分子診断ユニットとJ.朱とNHLBI DNA配列決定およびゲノミクスコアに感謝します。この研究は、NIHの学内プログラムによってサポートされていました。

<ol><li>Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+Robustness+in+T+Cell+Activation+from+Regulated+Heterogeneity+in+Protein+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels.</a> Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).</li>
<li>Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+origins+of+cell-to-cell+variability+in+TRAIL-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis.</a> Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).</li>
<li>Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillations+and+variability+in+the+p53+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oscillations and variability in the p53 system.</a> Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Transcriptional+Bursting+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li>
<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+Synthesis+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309+(2006).</li>
<li>Senecal, A., Munsky, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+Factors+Modulate+c-Fos+Transcriptional+Bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li>
<li>Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+control+of+expression+mean+and+variance+by+epigenetic+features+at+different+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci.</a> Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+(2015).</li>
<li>Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+burst+frequency+and+burst+size+are+equally+modulated+across+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).</li>
<li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li>
<li>Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Pulses+Diversify+Target+Gene+Expression+Dynamics+in+an+mRNA+Half-Life-Dependent+Manner+and+Delineate+Co-regulated+Target+Gene+Subnetworks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks.</a> Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).</li>
<li>Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+p53-Mdm2+feedback+loop+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells.</a> Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).</li>
<li>Levine, A. J., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+30+years+of+p53%3A+growing+ever+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The first 30 years of p53: growing ever more complex.</a> Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).</li>
<li>Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+human+p53-regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of human p53-regulated genes.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 134(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/pcr-technologies-guide.pdf">PCR Technologies: A Technical Guide</a>. , Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).</li>
<li>Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+initiation%3A+a+mechanism+for+triggering+p53+pulses+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage.</a> Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Flow+Cytometry%3A+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry: Principles and Applications</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Real-time+PCR%22">Real-time PCR</a>. , Taylor & Francis. (2006).</li>
<li>Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+co-expression+measures%3A+mutual+information%2C+correlation%2C+and+model+based+indices%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 328(2012).</li>
<li>Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARACNE%3A+An+Algorithm+for+the+Reconstruction+of+Gene+Regulatory+Networks+in+a+Mammalian+Cellular+Context%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context.</a> BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).</li>
<li>Haff, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+quantitative+PCR+using+nested+primers%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">Improved quantitative PCR using nested primers.</a> PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).</li>
<li>Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biol. 17, 77(2016).</li>
<li>Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Single-cell+Gene+Transcription+by+RNA+Fluorescent++In+Situ+Hybridization+%28FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. (68), e4073(2012).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li>
<li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

我々は、培養で増殖させた接着性細胞の集団から個々の哺乳動物細胞を単離するため、各セル内の約96の遺伝子の発現をアッセイするための方法を提示しています。この方法がうまく機能するために良好な事前準備が重要です。プライマーは、単セル測定の品質を決定するように、特に興味のある転写物（1.2〜1.3ステップ）に特異的な設計およびテストプライマーペアは、時間がかかるが、重要なステップです。信頼性のあるプライマー対が得られたら、それらは、目的の転写物からcDNAを増幅するために使用されます。アンプリコンは、その後の規格（ステップ1.4）を作るために等モル量で組み合わされています。標準は絶対転写産物数を推定するために必要とされるので、このステップは重要です。規格は、一度作っ等分して、細胞選別および遺伝子発現測定値の後続のすべてのラウンドのために使用されるべきです。同様に、細胞がソートされた日に、それは特にimportanです溶解バッファーのプレートを作る際に慎重に（3.7および3.11ステップ）低結合ピペットチップやマイクロ遠心チューブを使用して標準を希釈するトン。 （ステップ4.2）セルソーターを目指して、別の重要なステップです。これは、細胞が正常に...

集団内の個々の細胞は均一な生理的刺激1、2、3、4に大幅に異なる応答を示すことができます。集団中の細胞の遺伝的変異は、応答のこの品種のための1つのメカニズムであるが、それでも細胞のクローン集団で、応答の変動性を向上させることができ、いくつかの非遺伝的要因もあります。例えば、個々のタンパク質および他の重要なシグナル伝達分子のレベルは、下流の遺伝子発現プロファイルの変化を生じる、セル単位で変化させることができます。さらに、遺伝子活性化は、バースト7,8,9あたりの転写物の比較的少数に限定することができる転写5,6の短時間のバーストで発生することができます。そのような遺伝子活性化における偶然性が大幅に生物学的応答の変動に寄与することができ、生理的刺激に応答して、微生物10におよび哺乳動物細胞1に2を選択的利点を提供することができます。変化の遺伝的および非遺伝的供給源の両方に、刺激に応答する任意の細胞の遺伝子発現プロファイルは、バルク応答の測定から得られた平均遺伝子発現プロファイルとは大きく異なっていてもよいです。個々の細胞は、刺激に応答して可変性を示す程度を決定することは、個々の細胞の単離のための技術は、目的の転写物の発現レベルを測定し、得られた発現データのコンピュータ分析を必要とします。 コストの広い範囲をカバーし、単一細胞における遺伝子発現をアッセイするためのいくつかのアプローチがあり、転写産物の数はプローブ、及び定量化の精度。例えば、単一細胞RNA-のSeqは、転写物のカバレッジと、個々の細胞の中で最も高度に発現される遺伝子のための別個の転写産物の数千を定量する能力の広い深さを提供しています。コストが減少し続けるが、しかし、このようなシーケンシングの深さに関連するコストは、法外することができます。逆に、in situハイブリダイゼーション（FISH smRNA） における単一分子RNAの蛍光は、目的の遺伝子につき合理的なコストであっても低発現遺伝子のための転写物の正確な定量を提供しています。しかしながら、標的遺伝子の少数は、このアプローチによって、所定の細胞においてアッセイすることができます。このプロトコールに記載定量的PCRベースのアッセイは、これらの技術の間の妥協点を提供します。これらのアッセイは、最大96個の細胞で一度に関心の96転写物まで定量化するために、マイクロ流体リアルタイムPCR装置を採用しています。前述の方法のそれぞれは、必要なハードウェアのコストを有しているが、任意の個々のqPCRアッセイのコストは比較的です低いです。このプロトコルは、（プロトコルADP 41、フリュー）マイクロ流体リアルタイムPCR装置の製造元が推奨する1から適応されます。 PCRベースのアプローチで各転写産物の絶対数の推定を可能にするために、我々は、複数の実験で使用できる準備標的遺伝子アンプリコンの内部統制を利用するプロトコルを拡大してきました。 この技術の一例として、MCF-7ヒト乳癌細胞において腫瘍抑制因子p53によって調節される遺伝子の発現の定量化は、11に記載されています。細胞は、DNA二本鎖切断を誘発する化学物質でチャレンジされています。以前の研究は、DNA二重鎖切断に対するp53応答は、p53レベル12の観点と異なる標的遺伝子11の活性化の両方で、個々の細胞における異質性を大いに発揮することが示されています。さらに、p53は100以上の発現を調節します細胞周期停止、アポトーシス及び老化13、14を含む多くの下流経路に関与する標的遺伝子を十分に特徴付け。各細胞におけるp53媒介性応答は、複雑かつ可変でもあるので、アプローチからシステムの利点の分析とは、約100の標的遺伝子は、以下に記載されるような個々の細胞、同時にプローブすることができます。 （例えば、単一細胞の単離および溶解のための代替方法として）わずかな変更を加えて、プロトコルは、容易に、哺乳動物の細胞型、転写、および細胞応答の広い範囲を研究するために適合させることができます。 適切な事前準備で、細胞選別および遺伝子発現測定のラウンドは、3日間にわたって、このプロトコルに従って行うことができます。 、事前に関心の転写産物を選択し、それらのtranscrからcDNAを増幅するプライマー対を識別し、検証：以下のタイミングが示唆されていますIPTSは、および標準とそれらのプライマーを用いてプライマーミックスを準備します。細胞治療の後、1日目に、収穫と逆転写および特定の標的増幅を行い、細胞を選別し、取り込まれなかったプライマーを除去するためにエキソヌクレアーゼでサンプルを扱います。 2日目、定量PCRを使用して選別した細胞上の品質管理を行います。最後に、3日目に、マイクロ流体定量PCRを使用して選別した細胞における遺伝子発現を測定します。 図1は、必要な手順をまとめたものです。

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plusミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>大容量cDNA逆転写キット RNase阻害剤</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT 高感度dsDNAアッセイキット</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーQ33120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml 低接着マイクロ遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>DNA 懸濁液バッファー</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0.2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR チューブ</td><td>Corning</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 ダイナミックアレイ DNA 結合色素 サンプル &アッセイローディング試薬キット</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 media</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定(米国)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤溶液</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>ネオカルジノスタチン</td><td>Σ</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect ワンステップ qRT-PCR キット</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal シーリングフィルム、滅菌済み</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BDBiosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0.05%</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 & micro;m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low</td><td>ROX Bio-Rad</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>IFC Controller HX (loading machine)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMarkまたはBioMark HD(マイクロ流体qPCR装置)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リアルタイムPCR解析ソフトウェア&nbsp;</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLABソフトウェア</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

内部標準でfacsおよび定量pcrを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

細胞のバルク集団からの遺伝子発現測定は、それらの集団内の個々の細胞のかなりのトランスクリプトーム変動を覆い隠すことができます。シングルセルの遺伝子発現測定は、遺伝子発現におけるノイズの役割を評価し、遺伝子ペアの発現における相関関係を特定し、刺激に対して異なる反応を示す細胞の亜集団を明らかにするのに役立ちます。ここでは、組織培養で増殖する集団から単離された単一の哺乳動物細胞における最大96個の遺伝子の発現を測定する手順について説明します。細胞は蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって溶解バッファーにソーティングされ、目的のmRNA種は逆転写および増幅されます。次に、マイクロ流体リアルタイムPCR装置を使用して遺伝子発現を測定し、一度に最大96のサンプルに対して最大96のqPCRアッセイを実行します。また、各転写産物の絶対数の推定を可能にするためのPCRアンプリコン標準品の作製と使用についても説明します。このアプローチでは、シングルセルでの遺伝子発現を測定する他の方法と比較して、RNA-Seqよりも低コストでRNA FISHよりも異なる転写産物を定量することができます。

プロトコルの一般的な概要は、細胞治療、FACSによる単一細胞の単離、単一細胞溶解物からのcDNAライブラリーの生成および前増幅、単一細胞cDNAライブラリーを確認するステップを含む、 図1に示されていますソートされたウェル、および定量PCRにより遺伝子発現を測定します。 単一細胞の単離および遺伝子発現分析の準備のために、最初に、目的の各標的遺伝子のために有効なオリゴヌクレオチドプライマー対を特定する必要があります。 図2は、プライマーの品質管理方法の2つの例を示しています。溶融曲線は、プライマーペアがテストされていると定量PCRを以下に生成されます。有効なプライマーは、単一のピーク（ 図2A、緑の曲線）との融解曲線になります。複数のピーク（ 図2A、青の曲線）または顕著な肩の曲線（Figur</stro...

私たちは、単一の哺乳類細胞を選別し、各細胞における最大96の標的遺伝子の発現を定量化する方法を説明しています。この方法には、絶対転写産物数の推定を可能にするための内部qPCR標準の使用が含まれます。

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

この手順の全体的な目的は、内部標準を用いたマイクロ流体qPCRにより、個々の細胞におけるmRNAレベルを定量化することです。この手法は、細胞集団が刺激に対して特徴的に異なる反応を示すかなど、単一細胞生物学の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、単一細胞において、RNA FISHよりも多くの遺伝子の発現を測定でき、かつRNA-Seqよりも低コストで実施できる点にあります。私たちは、マイクロ流体qPCRを用いて単一細胞内の遺伝子発現を測定するプロトコルを検討していた際に、最初はこの手法を考案しました。既存の手法を修正し、単一細胞における異なる転写産物の絶対数をより正確に推定したいと考えたためです。細胞ソーティングの手順については、私の研究室で利用しているフローサイトメトリー施設のマネージャーであるWilliam Telfordが実演します。テキストプロトコルに従って目的遺伝子の増幅産物を生成および精製した後、2.0 mL低吸着マイクロ遠心チューブに各精製増幅産物を18 µLずつ混合し、各増幅産物の濃度が5×10⁶ molecules/µLとなるよう、DNA懸濁バッファーを1,800 µLまで加えます。この5e6標準液を十分にボルテックスし、低吸着PCRチューブに20 µLずつ分注します。テキストプロトコルに従ってMCF7 p53-Venus細胞を播種した後、細胞に400 ng/mLのネオカルジノスタチンを添加し、3、8.5、14、または24時間処理します。ライシスバッファーを調製するには、この表に記載されている試薬を混合します。このバッファーのうち92.4 µLを別のチューブに移し、アンプリコン標準試料用のライシスバッファーとして使用します。残りのライシスバッファーは細胞用に使用します。テキストプロトコルに従い、E.coli DNAを調製し、細胞用溶解バッファーに添加します。標準試料を調製するために、6本の低吸着遠心チューブにラベルを貼ります。5e5チューブに90 µLのDNA懸濁バッファーを加えます。1 µLあたり6.2 pgのE.coli DNAを含むバッファーを、他の5本のチューブそれぞれに90 µLずつ加え、すべてのチューブを氷上に保持します。保存状態にある5e6標準液のアリコートを取り出し、チューブを短時間ボルテックスした後、スピンダウンして液体をチューブの底に集めます。次に、低吸着ピペットチップを使用して、5e6標準液10 µLを5e5チューブに加えます。ボルテックスおよびスピンダウンを行い、チューブを再び氷上に戻します。次に、5e5チューブから10 microlitersを5e4チューブにピペットで分注し、チューブを短時間ボルテックスして遠心分離した後、再び氷上に置きます。この連続希釈を、前のチューブから10 microlitersを分注する手順で、すべてのチューブに標準試料の希釈液が入るまで繰り返します。溶解バッファーを入れたPCRチューブを準備した後、12チャンネルピペットを用いて、PCRチューブの列から細胞溶解バッファー9 microlitersをPCRプレートの最初の7行の各ウェルに分注します。プレートの最下段の各ウェルに、標準溶出バッファーを 7 µL ずつ分注します。次に、低吸着ピペットチップを使用して、プレートマップに従い最下段の各ウェルに標準試料を 2 µL ずつ加えます。10 cell ウェルと 100 cell ウェルに 3.1 pg/µL の E.coli DNA を 2 µL ずつ加え、no cell ウェルに 6.2 pg/µL の E.coli DNA を 2 µL 加えます。プレートマップに従って 96 ウェルプレートにソートするようにフローサイトメトリー（FACS）をプログラミングした後、装置の光軸調整を行うため、空の PCR プレートをシールし、テストストリームを使用して液滴と PBS を空プレートのシール上へソートさせます。液滴が正しい位置に到達しない場合は、シールの表面から液滴を拭き取り、装置メーカーの指示に従ってセルソーターを再校正し、ソートストリーム内の液滴が正しく配置されるまで繰り返します。トリプシン処理により細胞を回収し、2% FBS含有PBS 0.5 millilitersで再懸濁させた後、フローサイトメトリー用チューブに移します。細胞をソートするには、細胞懸濁液の入ったチューブをセルソーターに挿入し、溶解バッファープレートのシールを開け、プレートマップに従って目的の細胞を注意深くプレートにソートします。単一細胞を最大限の純度でソートするために、装置をシングルセルモードで運転し、前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）に基づく標準的なフローサイトメトリー・ゲーティングを使用します。ラン終了後、新しい滅菌サーマルシールを用いてプレートを密封し、4°Cで400 ×gにて1分間遠心分離します。その後、プレートをサーマルサイクラーにセットし、あらかじめ作成したRT-STAプログラムを実行します。RT-STA完了後のプレートをスピンした後、12チャンネルピペットを使用して、希釈したexonuclease Iを各ウェルに3.6 µLずつ分注します。プレートを封印して短時間遠心し、サーマルサイクラーにセットしてexo Iプログラムを実行します。各サンプルのハウスキーピング遺伝子の発現量を測定するために、選択したハウスキーピング遺伝子のいずれかのプライマーを用いて、96反応分、900 µLのDNA結合色素qPCRマスターミックスを調製します。96ウェルPCRプレートの各ウェルにマスターミックスを9 µLずつ分注し、その後、サンプルプレートから各ウェルに対応するサンプルの1 µLをPCRプレートに加えます。マスターミックス製造元の推奨するサーマルサイクリングプロトコル、または標準プロトコルに従ってリアルタイムPCR機でプレートをランし、サンプルを分析して、テキストプロトコルに基づいたサンプルミックスプレートマップを作成します。プレートに「sample mixes」とラベルを貼り、8チャンネルピペットを使用して、マスターミックスサンプルローディング試薬混合液 3.3 µLを96ウェルPCRプレートの各ウェルに分注します。各サンプルのPCRプレートについて、プレートを10秒間ボルテックスし、500 ×gで10秒間遠心分離します。カバーを取り外し、プレートマップで示された1細胞用ウェルに対応するサンプルミックスプレートの各ウェルに、各陽性1細胞サンプルを2.7 µLずつ分注します。新しいマイクロフルイディックqPCRチップの底面のステッカーを剥がし、キャップを付けたままのコントロールライン液が入ったシリンジを用いて、各アキュムレーターのスプリングを押し下げて緩め、各アキュムレーターに100〜200 µLのコントロールライン液を注入します。チップをローディングマシンに挿入してプライミングスクリプトを実行し、その後、8チャンネルピペットを使用して、各アッセイミックスを4.5 µLずつマイクロフルイディックqPCRチップの左側に分注します。ウェルの底に気泡が生じないようにすることが極めて重要です。気泡があると、サンプルの分注に問題が生じます。これを防ぐために、ピペットチップをウェルの壁面に当て、1段目のストッパーまでのみ分注してください。各サンプルミックスを4.5 µLずつマイクロ流体qPCRチップの右側に移し、チップをローディングマシンに挿入して、load mixスクリプトを実行します。load mixスクリプトが完了したら、チップに線が入っていないことを確認してください。線がある場合はローディングの問題を示しています。その後、テープを使用してチップから埃を慎重に取り除き、チップをマイクロ流体リアルタイムPCRマシンに挿入して、データ収集スクリプトを実行します。最後に、テキストプロトコルに従ってデータを解析します。この図は、単一細胞が導入されたウェルを特定するためにqPCRで測定したハウスキーピング遺伝子の発現レベルを示しています。細胞が含まれているサンプルはCT値が低く、細胞が含まれていないサンプルはCT値が大幅に高くなります。アンプリコン標準のウェルでは、等間隔に配置された増幅曲線が示されるはずです。また、「細胞なし」、「10細胞」、および「100細胞」のウェルの曲線間には、明確な差が認められる必要があります。実際の細胞を代表するシードDNAサンプルは、ソート済みの複数の96ウェルプレートから厳選して抽出され、マイクロ流路qPCRの準備のために単一のプレートにまとめられます。このヒートマップは、マイクロ流体qPCRの結果をまとめたものです。各列の色調の変化は、個々の細胞間における各遺伝子の発現の変動性を示しています。他の行よりも著しく色が濃い2つの行は、不適切なサンプルである可能性が高いと考えられます。この手順を行う際は、特に標準試料および溶解バッファーを調製する際に、作業エリアをRNaseフリーおよびDNAフリーに保つことが重要です。本プロトコルのPCR前段階はコンタミネーションに敏感です。このビデオを視聴することで、個々の細胞における複数の標的遺伝子の発現量を定量する方法について、十分に理解できるはずです。この手順に続き、単一分子RNA FISHなどの他の手法を用いて、単一細胞におけるmRNA量の測定結果を検証することができます。

single-cell-gene-expression-profiling-using-facs-qpcr-with-internal

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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