内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

この手順の全体的な目標は、内部標準を備えたマイクロ流体qPCRを使用して、個々の細胞のmRNAレベルを定量することです。この方法は、細胞の細胞集団が特徴的に異なる方法で刺激に応答するかどうかなど、シングルセル生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、RNA-Seqよりも低コストでRNA FISHよりも多くの遺伝子の発現を単一細胞で測定できることです。

この手法のアイデアを最初に思いついたのは、マイクロ流体qPCRによって単一細胞の遺伝子発現を測定するためのプロトコルを検討していたときでした。私たちは、既存の方法を変更して、単一細胞中の異なる転写産物の絶対数をより正確に推定したいと考えていました。セルソーティング手順のデモンストレーションは、私の研究室で使用されているフローサイトメトリー施設のマネージャーであるWilliam Telfordです。

テキストプロトコルに従って目的の遺伝子からアンプリコンを生成し、精製した後、2.0ミリリットルの低結合マイクロ遠心チューブで各精製アンプリコンの18マイクロリットルを組み合わせ、その後、各アンプリコンの濃度がマイクロリットルあたり6分子の5倍10になるように、最大1,800マイクロリットルのDNA懸濁液バッファーを追加します。5e6標準を徹底的にボルテックスし、低結合PCRチューブで20マイクロリットルのアリコートに分割します。テキストプロトコルに従ってMCF7 p53-Venus細胞をプレーティングした後、ネオカルチノスタチンのミリリットルあたり400ナノグラムを細胞に加え、3時間、8.5時間、14時間または24時間治療します。

溶解バッファーを作成するには、この表に記載されている試薬を組み合わせます。92.4マイクロリットルのバッファーを別のチューブに移し、アンプリコン標準の溶解バッファーとして機能します。残りの溶解バッファーは細胞用になります。

テキストプロトコルに従って、細胞の溶解バッファーに大腸菌DNAを調製し、追加します。標準試料を調製するには、6本の低結合遠心分離チューブを標識します。90マイクロリットルのDNA懸濁液バッファーを5e5チューブに加えます。

大腸菌DNAのマイクロリットルあたり6.2ピコグラムを含む90マイクロリットルの緩衝液を他の5本のチューブのそれぞれに追加し、すべてのチューブを氷上に保ちます。5e6標準のアリコートをストレージから取り出した後、チューブを短時間ボルテックスし、次に回転させて液体がチューブの底にあることを確認し、次に低結合ピペットチップを使用して、10マイクロリットルの5e6標準を5e5チューブに追加します。渦を巻いて回転させ、チューブを氷に戻します。

次に、5e5チューブから5e4チューブに10マイクロリットルをピペットで移し、チューブを短時間ボルテックスして回転させ、チューブを氷に戻します。各チューブで段階希釈を繰り返し、すべてのチューブが標準希釈になるまで前のチューブから10マイクロリットルを受け取ります。溶解バッファーでPCRチューブを調製した後、12チャンネルピペットを使用して、PCRチューブの列から9マイクロリットルの細胞溶解バッファーをPCRプレートの最初の7列の各ウェルに分配します。

プレートの最後の列の各ウェルに7マイクロリットルの標準溶解バッファーを分配し、次に低結合ピペットチップを使用して、プレートマップに従って最下列の各ウェルに2マイクロリットルの標準液を追加します。大腸菌DNAのマイクロリットルあたり3.1ピコグラムの2マイクロリットルを10セルウェルと100セルウェルに追加し、次に大腸菌DNAのマイクロリットルあたり6.2ピコグラムの2マイクロリットルをセルウェルなしに追加します。蛍光活性化セルソーターをプログラミングして、プレートマップに従って96ウェルプレートに選別した後、マシンを照準し、空のPCRプレートをシールし、テストストリームを使用して空のプレートのシールに液滴とPBSを選別します。

液滴が正しい位置に着地しない場合は、シールの表面から液滴を拭き取り、機械メーカーの指示に従ってセルソーターを再校正し、ソーティングストリーム内の液滴が正しく堆積するまで繰り返します。トリプシン処理により細胞を回収し、2%FBSを含む0.5ミリリットルのPBSに再懸濁した後、フローサイトメトリーチューブに移します。細胞を選別するには、細胞懸濁液の入ったチューブをセルソーターに挿入し、溶解バッファーのプレート上のシールを開き、プレートマップに従って目的の細胞をプレートに慎重に選別します。

シングルセルが最大純度でソーティングされるようにするには、マシンをシングルセルモードで運転し、前方散乱および側方散乱に基づく標準的なフローサイトメトリーゲーティングを使用します。実行後、新しい滅菌サーマルシールを使用してプレートをシールし、400 g で摂氏 4 度で 1 分間遠心分離し、プレートをサーマルサイクラーに入れて、事前に準備した RT-STA プログラムを実行します。完成したRT-STAプレートを回転させた後、12チャンネルピペットを使用して、3.6マイクロリットルの希薄エキソヌクレアーゼIをプレートの各ウェルに分配します。

プレートを密封して短時間回転させ、プレートをサーマルサイクラーに入れてexo Iプログラムを実行します。各サンプルのハウスキーピング遺伝子発現を測定するには、選択したハウスキーピング遺伝子の1つからのプライマーを使用して、96反応用のDNA結合色素qPCRマスターミックスを900マイクロリットル調製します。96ウェルPCRプレートのすべてのウェルに9マイクロリットルのマスターミックスを分配し、サンプルプレートから1マイクロリットルのサンプルをPCRプレートの対応するウェルに加えます。

マスターミックスメーカーが提案するサーマルサイクリングプロトコルを使用するか、標準プロトコルに従って、リアルタイムPCRマシンでプレートを実行し、サンプルを分析し、テキストプロトコルに従ってサンプルミックスプレートマップを作成します。プレートサンプルミックスを標識し、8チャンネルピペットを使用して、3.3マイクロリットルのマスターミックスサンプルローディング試薬混合物を96ウェルPCRプレートの各ウェルに分配します。サンプルのPCRプレートごとに、プレートを10秒間ボルテックスし、500倍gで10秒間回転させます。

カバーを取り外し、各陽性の1細胞サンプルの2.7マイクロリットルを、プレートマップに示されている1つの細胞ウェルのサンプル混合プレート上の対応するウェルに移します。新しいマイクロ流体qPCRチップの底からステッカーを剥がし、キャップを付けたまま制御ライン液のシリンジを使用して、各アキュムレータスプリングを押し下げて緩め、各アキュムレータに100〜200マイクロリットルの制御ライン液を注入します。チップをローディングマシンに挿入し、プライムスクリプトを実行し、8チャンネルピペットを使用して、各アッセイミックスの4.5マイクロリットルをマイクロ流体qPCRチップの左側に移します。

井戸の底に気泡を作らないようにすることが重要です。これにより、読み込みの問題が発生します。これを防ぐには、ピペットの先端をウェルの側面に触れてから、最初のストップまでのみピペットで動かします。

各サンプルミックスの4.5マイクロリットルをマイクロ流体qPCRチップの右側に移し、チップをローディングマシンに挿入してロードミックススクリプトを実行します。ロードミックススクリプトが完了したら、チップ全体に線がないことを確認し、ロードの問題を示していることを確認し、テープを使用してチップからほこりの粒子を慎重に取り除き、チップをマイクロ流体リアルタイムPCRマシンに挿入してデータ収集スクリプトを実行します。最後に、テキストプロトコルに従ってデータを分析します。

この図は、qPCRで測定したハウスキーピング遺伝子の発現レベルを示しており、どのウェルが単一細胞を受け取ったかを決定します。細胞を受け取ったサンプルのCT値は低くなっています。細胞のないサンプルは、CT値がはるかに高くなります。

アンプリコン標準試料のウェルは、等間隔の増幅曲線を示す必要があります。また、無細胞、10セル、100セルのウェルの曲線にも明確な分離が必要です。実際の細胞を表すシードDNAサンプルは、複数の選別された96ウェルプレートからチェリーピックされ、1つのプレートに結合されてマイクロ流体qPCRの準備

このヒートマップは、マイクロ流体qPCRの結果をまとめたものです。各列の色のばらつきは、異なる細胞間での各遺伝子の発現のばらつきを示しています。他の行よりもはるかに暗い 2 つの行は、不良サンプルを表している可能性が最も高いです。

この手順を試みる際には、特に標準液と溶解バッファーを作成する際には、作業領域のRNaseとDNAをフリーに保つことが重要です。このプロトコルのPCR前の部分は、汚染に敏感です。このビデオを見れば、個々の細胞における複数の目的遺伝子の発現を定量化する方法について十分に理解できるはずです。

この手順に続いて、単一分子RNA FISHなどの他の方法を実行して、単一細胞におけるmRNA存在量の測定を検証することができます。