軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟

この磁気細胞凝集および動的成熟法の全体的な目標は、間葉系間質細胞またはMSCのin vitro軟骨形成を改善することです。細胞の凝縮による軟骨形成ではなく、幹細胞の磁気凝集は、軟骨再生プロセスの初期の重要なステップです。幹細胞を足場に閉じ込めた後、足場を細胞バイオリアクターに移して、細胞の動的成熟を評価することができます。

重要なダイナミクス法は、筋肉、心臓、血管修復などの他の生体システムにも適用できます。しかし、ご覧のとおり、軟骨の再生に非常に適しています。磁気細胞播種と動的細胞成熟を実際のバイオリアクターで視覚的に示し、この2つの手法はテキスト指導だけでは習得が難しいため、非常に重要です。

骨材形成用のマイクロマグネットデバイスを構築するには、まず、厚さ6mmのアルミニウムプレートの3cmの穴に直径750μmの磁気チップを挿入し、そのプレートを永久ネオジム磁石の上に置きます。足場播種装置を製作するには、まず硬質ポリスチレンを2.4平方センチメートル角に切断し、1.6平方センチメートルの表面に直径3mm、長さ6mmの磁石を等間隔で挿入します。次に、デバイスを永久ネオジム磁石の上に置きます。

ヒトMSCを標識するには、まず、幹細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で90%コンフルエントになるまで、完全なMSC増殖培地で培養します。吸引し、グルタミンを含まない血清3 RPMI培地で細胞をすすぎ、150平方センチメートルの培養フラスコあたり10ミリリットルの酸化鉄ナノ粒子溶液を添加して、細胞培養インキュベーターで30分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、グルタミンを含まない血清3 RPMI培地で細胞を5分間すすぎ、原形質膜にまだ付着しているナノ粒子を内在化します。

次に、各フラスコのRPMIを25ミリリットルの完全MSC増殖培地と交換し、細胞を細胞培養インキュベーターに一晩戻します。翌朝、フラスコあたり8ミリリットルの05%トリプシン-EDTAで磁気セルを取り外してください。そして、遠心分離によって解離した細胞を収集します。

計数のためにペレットを懸濁させ、各磁気デバイスの上にガラス底の35mm細胞培養シャーレを置きます。凝集体を磁気的に形成するために、各ペトリ皿に3ミリリットルの軟骨形成培地を加え、凝集体ごとに5番目の標識細胞に10の2.5倍を8マイクロリットル以下に穏やかに沈着させます。細胞の沈着が遅すぎず、速すぎないことが重要です。

また、磁気から近すぎず、遠すぎず。すべての凝集体を配置したら、スフェロイドを乱さずに20〜30分間形成します。次に、凝集体を細胞培養インキュベーターに移します。

同日、1.5ミリリットルの軟骨原性培地を用いて、15ミリリットルの円錐管内の10〜5番目の標識幹細胞を2.5倍遠心分離することにより凝集体を形成する。足場を磁気的に播種するには、ペトリ皿ごとに1つの乾燥プルラン/デキストラン多糖多孔質足場を配置し、TGFβ3を含まない軟骨原性培地の350マイクロリットルで6番目の標識細胞に10倍2倍希釈します。細胞を慎重に足場にピペットで移し、構造を摂氏37度でインキュベートして、細胞が完全に浸透できるようにします。

5分後、3ミリリットルの軟骨形成培地をペトリ皿に静かに加え、足場を細胞培養インキュベーターに4日間戻して、細胞が足場の細孔を通って移動するのを待ちます。同日、実証されているように、2×10〜6番目の標識幹細胞で別の組の足場を播種し、磁石なしで細胞をインキュベートして、ポジティブコントロールとして均一に播種された足場を得る。5日目に足場への軟骨形成のために、すべての足場から磁気デバイスを取り外し、静的な足場を25日目まで細胞培養インキュベーターに戻し、週に2回培地を交換します。

動的細胞培養のためには、5日目にも、メーカーの指示に従ってシリコーンチューブを適切な長さにカットし、チューブ、500ミリリットルの培養チャンバー、双方向ローテーター、ケージを滅菌微生物安全ステーションに入れます。メーカーの指示に従って、チューブを培養チャンバー内の双方向ローテーターに接続します。次に、滅菌ヘラを使用して、2つの細胞化した足場を各ケージに慎重に移します。

すべての足場が移されたら、ケージを蓋の針に通して挿入し、回転中にケージが動かないようにします。そして、培養室を軟骨原性培地で満たします。チャンバーを準備するときは、ツールや足場の汚染を避けるために、滅菌消毒技術を使用してください。

次に、ケージをチャンバーに挿入し、チャンバーを閉じて蠕動ポンプをオンにし、チューブに軟骨形成性媒体を充填し、気泡を排除します。充填されたチャンバーをバイオリアクターのモーター内に配置して固定し、アームとチャンバーの回転を制御するコンピューターの電源を入れます。次に、アームとチャンバーの両方に毎分5回転の回転速度を適用し、蠕動ポンプを毎分10回転の流量に調整して、細胞化された足場を連続的に供給します。

8日目に足場のない3D骨材コンストラクトを生成するには、軟骨形成培地で接触する2つの骨材を8デュブレットに配置することにより、融合を開始します。次に、11日目に2つのデュプレットをマージして4つのクワッドレットを形成し、15日目に4つのクワッドを融合して最終的な構造を形成します。磁気融合によって形成された組織は、遠心分離によって得られたペレットと比較して、コラーゲンIIの発現が有意に増加していることを示しています。

凝集体発現の増加傾向に伴って。細胞化された静的な足場では、磁力なしで播種された足場と比較して、磁気播種を使用すると凝集体およびコラーゲンIIの発現の増加が観察されます。興味深いことに、コラーゲンIIの発現は、磁気シーディングと動的分化が組み合わされた場合にはるかに高くなります。

トルイジンブルーを用いた組織学的解析により、16個の凝集体の連続的な磁気融合により、グルコサミン糖鎖が豊富に沈着していることが明らかになった。さらに、磁気播種された足場では、足場をバイオリアクターで分化させると、静的に培養した場合よりもグルコサミンの糖鎖含量が高くなります。一度マスターすると、磁気セルの凝集は適切に実行されれば2時間で完了することができます。

この手順を試みるときは、凝集体の形成を容易にするために、標識された細胞をできるだけ小さな体積で再懸濁することを覚えておくことが重要です。足場の磁気播種に続いて、実際のバイオリアクターを使用した動的成熟を行い、新たに合成された軟骨細胞の発現を改善することができます。この技術の開発以来、この技術は、再生医療の分野の研究者が人間の関節軟骨の再生を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、磁気デバイスの構築方法、幹細胞の標識標識、幹細胞凝集体の形成方法、磁気によるスキャフォールドのシード方法、実際のバイオリアクターの使用方法について十分に理解できるはずです。人間の細胞や組織を扱う作業は非常に危険である可能性があるため、手袋、白衣、保護メガネの着用など、常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。