ショウジョウバエのグルーミング行動の定量

この手法の全体的な目的は、グルーミングを行った条件と行わなかった条件において、個体の体に残ったブリリアントイエロー染料の量を定量化および比較することで、ショウジョウバエのグルーミング行動を測定することです。この手法は、微細な運動スキルの協調や、それに関連する分子調節因子および回路など、神経生物学および行動遺伝学の分野における重要な疑問への解答に寄与します。本手法の主な利点は、迅速かつ堅牢であり、さまざまなスキルレベルの研究者や学生が容易に実施できる点にあります。

この手順の実演は、私の研究室の学生であるFrankie Barradaleが行います。実験を開始するために、生きたDrosophilaを培養 vialからグルーミングチャンバーへ移動させるためのアスピレーターを準備します。ハサミを使用して、Tygonチューブを1.5 feet分カットしてください。

1 mL使い捨てマイクロピペットチップの先端を少なくとも1インチ切り取り、1 cm四方のメッシュを切り取ったチップの1/16インチの開口部の上に保持します。その上から新しい1 mLマイクロピペットチップをメッシュと切り取ったチップにぴったりとはめ込み、ショウジョウバエの保持チャンバーを作成します。新しいマイクロピペットチップの最先端部分を切り取り、1匹のハエが通過できる十分な広さに開口部を広げます。

穴のサイズは、グルーミングチャンバーの開口部とおおよそ一致します。入れ子状にしたチップをTygonチューブの端にぴったりと装着してください。真空圧を維持できるよう、チップをチューブに押し込み、密着させてください。

チューブの反対側で、200 µLマイクロピペットチップの先端を切り取り、切り取った狭い端をチューブに差し込んで、アスピレーターの口側を作成します。粉末分注チューブを準備するために、薬紙上で5 mgのブリリアントイエロー染料を量り取ります。この粉末を8 mLマイクロ遠心チューブに注ぎ、キャップをしっかりと閉めます。

次に、エタノールチューブを準備するため、15 mLマイクロ遠心チューブに100%エタノールを1 mLピペットで加えます。チューブにラベルを貼り、キャップをして、グルーミングアッセイの完了まで保存しておきます。また、ネガティブコントロールとして、ハエを入れずに1 mLのエタノールのみを入れたブランクサンプルを少なくとも1つ含めてください。

スライド式のトッププレート（小さい穴がある方）をねじ込み、ダスト添加用にボトムプレート（大きい穴がある方）を取り外した状態で、各グルーミングチャンバーを組み立てます。必要なグルーミングチャンバーをすべて、上面を下にしてテーブルの上に平らに置きます。チューブを目的のウェルの上のチャンバー表面に軽く叩きつけ、5 mgのブリリアントイエロー染料の分注量を各チャンバーに投入します。

チャンバーをテーブルに軽く叩きつけ、すべての粉末がメッシュを通ってプレートの上部に落ちるようにします。次に、円錐形開口部の広い側が外側を向き、穴がウェルに重ならないようにして、各チャンバーに底板をねじ込みます。底板がずれて染料が漏れないよう、しっかりと固定してください。

チャンバーをひっくり返し、テーブルに数回軽く叩きつけて、ダストがメッシュを通り抜けて底板に落ちるようにします。チャンバーのトッププレートをスライドさせ、小さな穴が15個のウェルと一致する開放位置に合わせ、個々のウェルにハエを導入できるようにします。ストローを使うようにアスピレーターの端からそっと吸い込み、ハエを1匹ずつマウスアスピレーターにロードします。

軽く息を吹きかけ、開口部を標的に向けることで、ショウジョウバエを投入します。ウェルに投入した後、上部プレートをスライドさせてハエをチャンバー内に閉じ込め、他のウェルに投入している間にハエが逃げ出さないよう、ホールチャンバーへの投入中はウェルの開口部にテープを貼ります。1つのウェルに複数のハエが吸引された場合は、ハエが1匹だけになるまでその開口部を覆わずにしておきます。

必要なすべてのウェルにハエを入れた後、チャンバーを反転させ、底板を上にし、粉末がメッシュを通り抜けてハエに付着するようにします。ネジを締めて上下のプレートをしっかりと固定し、チャンバーを4秒間ボルテックスしてハエに粉末を付着させます。チャンバーの上板を下にしてテーブルに2回叩きつけ、染料を反対側へ落とします。

次に、チャンバーを反転させてトッププレートを上にし、チャンバーを2回軽く叩いて、染料がトップチャンバーに保持されたハエから離れ、底面チャンバーの底に沈むようにします。グルーミングをさせない対照群のハエについては、直ちにサンプル調製に進みます。ハエにグルーミングをさせるため、トッププレートを上にしてチャンバーをテーブルまたはカウンターの上に30分間平らに置きます。

すべてのグルーミング実験において環境を一定に保つため、チャンバーを騒音や振動のない場所に設置してください。チャンバーを水平に保ち、トッププレートを上にした状態で、底板をゆっくりと緩めてチャンバーから取り出します。この際、染料をこぼさないように注意してください。ハエが麻酔されるまで、空気の流れを弱くしたCO2パッドの上にチャンバーを置きます。

チャンバーからトッププレートを外し、ピンセットで脚を慎重に掴んで、各チャンバーから染色の施されたハエを1匹ずつ取り出し、エタノールが入った1.5 milliliter マイクロ遠心チューブに入れます。各マイクロ遠心チューブにハエが1匹ずつ入ったら、キャップを閉め、チューブを3回反転させて、染料とエタノールの溶液を撹拌・混合します。染料がハエから溶液へ完全に除去されるよう、エタノールとハエが入ったチューブを室温で5時間インキュベートします。

5時間後、各チューブを2秒間軽くボルテックスし、ショウジョウバエから染料が完全に除去されていることを確認します。実験用の1.5 milliliterチューブから50 microlitersを96ウェルプレートのウェルに分注し、プレート上の各サンプルの位置を記録します。染料が多く付着した個体や、グルーミング不全による封鎖効果を避けるため、200 microlitersのエタノールを加えてサンプルを5倍に希釈します。

プレートリーダーを使用して、各サンプルを397ナノメートルで分析します。プレートリーダーを通じてサンプルを記録し、プレート上の記録サンプルを含むスプレッドシートを保存します。我々はこの方法を用いて、強力なハイポモルフおよびnull DopR変異体と野生型系統とのグルーミング性能を比較することにより、DopRを研究しました。

DopR変異体は、野生型またはレスキュー個体よりも有意に多くの染料を保持しており、DopR変異体がグルーミング行動において効率が低いことを示しています。Rutabagaショウジョウバエを用いた並行実験では、変異体はDopR変異体よりも高い染料蓄積レベルを示し、グルーミング行動におけるDopRの重要な役割が示唆されました。このビデオを視聴することで、行動解析のためのハエの取り扱い方法およびグルーミング行動の測定方法について十分に理解できるはずです。