Name: 抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュを用いたヒトインフルエンザAウイルス感染モデルによる抗ウイルス薬スクリーニングと宿主免疫細胞応答の解析手法。この方法はウイルス学および免疫学研究に応用可能です。

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著者は、ゼブラフィッシュの手入れとメンテナンスをしてくれたMark Nilan氏と、NS1-GFPを伝播し、IAV力価を決定してくれたMeghan Breitbach氏とDeborah Bouchard氏に感謝したいと思います。本研究は、NIGMSの助成金であるNIH P20GM103534とMaine Agricultural and Forest Experiment Station(公開番号3493)の支援を受けて行われました。

すべての作業は、バイオセーフティーレベル2（またはBSL2）米国疾病管理センターによって記述規格（CDC）を使用して実施し、施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって確立された指令に基づくべきです。安全性とコンプライアンスを確保するため、適当な当局と協議してください。 1.ゼブラフィッシュの手入れとメンテナンス<ol><li>ゼブラフィッシュをスポーンし、実験のための胚の必要な数を収集します。 Adatto らによって記載されたもののような、必要な場合、大量飼育タンク。 図32は 、発育ステージの胚の多数を収集するために使用することができます。 </li><li>胚は低密度で深いペトリ皿中の所望の発達段階（ローカライズされた、泳ぐ膀胱感染の全身IAV感染[セクション3]または5日後に受精のための48時間後に受精[セクション4]）（まで発展することを許可します&lt; 6を含む滅菌卵の水に28℃での100の胚/皿）蒸留水で0 / mlの海の塩（ 例えば 、インスタントオーシャン）。 <ol><li>プラスチック製のトランスファーピペットで死んだ胚を削除し、最適な健康と発展を確保するために毎日卵水を変更します。 </li></ol></li></ol>材料および試薬の調製<ol><li>蒸留水とオートクレーブ中で（7.0から7.4にpHを調整）トリカイン-Sの4 mg / mlでストック溶液を準備します。 4℃で保存。 </li><li>マイクロピペットプラー使用してフィラメントとホウケイ酸ガラスキャピラリーを引いて（以下の設定で例えばマイクロピペットプラーを：圧力設定= 100、熱= 550を引っ張る= [値なし]、速度= 130、時間= 110）。 注：前に針をトリミングに、針は、針の先端にテーパーし始めるところからの長さは約12〜15ミリメートルであろう。これは、好みや用途に基づいて、しかしながら、変化することができます。長く、より緩やかなテーパーが原因胚を貫通する能力の増加と減少里のより好ましいかもしれません針曲げや折れのSK。 </li><li>マイクロ波を用いて100 mLの卵水にアガロース2gのメルト。深いペトリ皿にアガロース溶融注ぎ、それを固化させることにより、ラインアップや胚を注入する上でプレートを作成します。 </li><li>ヌクレアーゼフリー水にザナミビルの10 mg / mlでストックしてください。 -20℃で小分けし、凍結。 </li><li>胚取り付けアガロースを作るためにマイクロ波を使用して50ミリリットル卵水に0.5グラムのアガロースを溶かします。撮像時に使用する直前まで50℃の水浴中で維持します。 </li></ol> 3.全身IAV感染症（48時間後に受精） 注意：すべての研究員がIAVで作業を開始する前にワクチン接種に関する上司や医師に相談してください。 <ol><li> ＃5鉗子を用いた実験の日に手動dechorionate胚。 200 / mlのトリカイン溶液中のプロセスで負傷された胚を削除し、安楽死させるように注意してください。 </li><li>準備OマイクロインジェクションのためのF IAV 注：ゼブラフィッシュ胚に感染することが示されている株は、インフルエンザA / PR / 8/34（H1N1）（APR8）、インフルエンザA X-31 A /愛知県/ 68（H3N2）（X-31）、および蛍光レポーターでありますインフルエンザ株NS1-GFP 33。 APR8とX-31、および他の株についての詳細は、インフルエンザ研究データベースで見つけることができます<ol><li>以前に34、35に記載されているように発育鶏卵でIAVのNS1-GFP株を伝播します。 、収集アリコート、およびIAVを含む尿膜液を滴定し、-80℃で保存。 APR8予備滴定及びX-31ウイルスは、商業的に購入することができます。 <ol><li>感染の直前に、急速に手袋をはめた手でIAVのアリコートを解凍し、その後すぐに力価の損失を低減するために氷の上に置きます。 </li></ol></li><li>ウイルス希釈<ol><li> APR8またはX-31ウイルスを使用している場合は、滅菌、氷冷PBSのsupplemで50％（EID50）/ mlの3.3×10 6卵感染量に希釈します0.25％フェノールレッドでentedは、層流フード中で（視覚化を助けるために）。同時に、0.25％フェノールレッドを滅菌PBSを含むコントロールを設定します。 </li><li> NS1-GFP系統33を使用する場合、層流フード中で0.25％フェノールレッドを含む滅菌氷冷PBS（可視化を助けるために）でNLあたりの単位（PFU）を形成〜1.5×10 2プラークに希釈します。同時に、0.25％フェノールレッドとの無菌PBS中のウイルスのように希釈された非感染鶏の卵からの尿膜腔液を含むコントロールを設定します。 </li><li>使用する準備ができるまで氷上でIAVを維持します。 </li></ol></li><li>使用直前にmicroloaderのヒントを使用して、マイクロインジェクション針にピペットウイルス液。射出装置（ 例えば MPPI-3圧力噴射システム）の適切なホルダーにマイクロインジェクションの針を挿入します。 </li><li>実体顕微鏡下で表示している状態で、優しくシャープ、滅菌＃5鉗子でマイクロインジェクションの針の先端をクリップ。 注：それはrecommenされますDEDマイクロインジェクションの先端が徐々にクリップされていること。 </li><li>圧力注入システムのフットペダルを押し、キャリブレーションマイクロスライド上の顕微鏡液浸油の液滴に注入します。ドロップの直径を測定します。式を使用して液滴の体積を計算するV = VボリュームがNLであり、Rはミクロンで半径/3πr3 4。 注：ドロップ径が小さすぎると、追加のガラスがクリッピングされ得るか、または圧力およびタイミングの設定を調整することができます。液滴の直径が大きすぎると、圧力及びタイミングの設定を調整することができます。 </li><li>圧力インジェクタの圧力とタイミング設定を調整および/または所望の注入量は、（一般的に1-3 NL）が達成されるまで、針の先端をreclip。 40と80秒20〜30 psiのパルス持続時間の設定との間の圧力設定が典型的です。それは毛細管圧力に対抗するが、IAV（正味ゼロ圧力）を漏れないように背圧を調整します。 </li></ol></li><li>注射用胚の位置を合わせます<ol><li> 200 / mlのトリカインでdechorionated胚を麻酔。 </li><li>動きが停止すると、プラスチック製のピペットで（セクション2.3で調製）を2％アガロースプレートに10-20胚を移します。過剰な液体を除去するためにプラスチック製のピペットを使用してください。 </li><li>静かにファイアーポリッシュと密封されたホウケイ酸ガラスキャピラリーとマイクロインジェクションのための胚を合わせます。優しくオリエント胚、立体顕微鏡を使用したように、キュビエのダクトまたは後部の主静脈は、マイクロインジェクション針（ 図1A）に沿ったものです。 </li></ol></li><li> IAVマイクロインジェクション<ol><li>ゆっくりキュビエのダクトまたは後部主静脈へのマイクロインジェクションの針を挿入します。胚（ 図1A）の循環系にIAVの所望の体積を注入するためにフットペダルを押し下げます。必要に応じて胚を複数回注入することができます。 注：注射ボーラスは、循環とDISTRIBに飲み込まれるべきです体全体uted。注入量は、注射部位に集まる場合、実験から胚を除去し、安楽死させます。 </li><li>選択されたウイルスの株に特異的な制御ソリューションで別の胚に注射を繰り返します。 APR8とX-31については、セクション3.2.2.1で説明した制御を使用します。 NS1-GFPのために、セクション3.2.2.2で説明したコントロールを使用します。 </li></ol></li><li> 33℃のインキュベーターに無菌卵水と場所を含む標識ペトリ皿に胚を移します。 注：感染した胚は、強化されたウイルスの複製をサポートするために、33℃で増殖させなければなりません。加えて、33℃でのインキュベーションは、より密接に外部環境のより低い温度に密着しているとIAV感染症が発生した場所である人間の上気道の温度を模倣します。胚は、広い温度範囲34に順応することができます。 </li></ol> 4.ローカライズ、Tgの水泳膀胱IAV感染（MPX：mCherryを） </em&gt;のトランスジェニックゼブラフィッシュ（5日後に受精） <ol><li>マイクロインジェクションのためのIAVの準備<ol><li> NS1-GFP株を希釈し、3.2節で説明したように注射液を制御します。 </li><li> 2.2節で説明したように針を準備します。 </li><li>以下の例外を除いて、3.3節で説明したように膨張鰾を含む35幼虫：Tgは（mCherryをMPX）を合わせます。針は浮き袋を貫通することができ、以前36（ 図2A）に記載されているようにウイルスは、浮き袋の後部に堆積させることができるように幼虫を合わせます。 </li></ol></li><li> IAVマイクロインジェクション<ol><li>ゆっくり泳ぐ膀胱内にマイクロインジェクションの針を挿入した構造（ 図2A）の後方に向かって所望の体積（ 例えば 5 NL）を注入します。 注：注射ボーラスが後方に向かって収集しなければならないと浮き袋の気泡は、bの必要がありますeが前方に変位します。 GFP発現は3時間後、注射で観察することを開始する必要があります。 </li><li>セクション3.4.2で説明したように、選択されたウイルスの株に特異的な制御ソリューションで注射を繰り返します。 </li></ol></li><li> 33℃のインキュベーター中の滅菌卵水と場所を含むペトリ皿に幼虫を転送します。 </li></ol> 5.抗ウイルス薬物治療注：以下のプロトコールは、以前ガボールらに示したザナミビル処理について説明します。 19。このプロトコルは、他の抗ウイルス薬をスクリーニングするために変更され、96ウェルプレート、ハイスループット形式で、複数の化合物をスクリーニングするために修正される可能性を有することができます。 <ol><li> 3時間後の感染では、0、16.7、33.3 ngの/ mlのザナミビルを含む滅菌卵水と卵NS1-GFP-の水と制御感染魚を交換してください。 注：これらの濃度は、foは達成生理的レベルを複製しようとするために、選択されましたヒト患者におけるザナミビルのllowing管理（100、200、または600 mgを、静脈内、1日2回または1日10 mgを1日2回、吸入）。ヒト患者における血清濃度は、9.83から45.3 ngの/ mlの36の範囲でした。 </li><li> 5日間にわたって、12時間ごとに卵の水を変更し、ザナミビルの適切な量を含有する滅菌卵水と交換してください。 </li><li>感染の経過を追跡します。 <ol><li> 200 / mlのトリカインにゼブラフィッシュを麻酔。視覚的にIAV感染と対照魚の間および薬物の異なる濃度に浸漬した魚のうち、感染パターンの違いを観察するステレオ蛍光顕微鏡によってGFP発現を監視します。 </li><li> 5日間にわたって罹患率と死亡率を追跡します。 <ol><li>無気力や浮腫の証拠、色素沈着、眼および頭蓋顔面奇形の違い、および前弯の兆候を含む、疾患の病理学に関連する感染症のダイナミクス、約レコード観測。疾患病状典型的には、注入されたウイルスの量に依存して、24-48時間ポスト噴射の制御感染魚に明らかになる。イメージの24時間後、注射を収集します。 </li><li> 5日後、感染の24時間毎に、死者の数、病的、および健康幼虫を記録。死は、識別可能な心拍の欠如によって定義されます。所望のようにデータをプロットします。例えば、健康な病的な、または死んだ魚の割合で積み重ね棒グラフとしてプロットデータは、y軸とx軸上の処置群にプロット。 19 注：死亡率は、カプラン・マイヤー生存推定によって獲得することができます。アプリケーションに応じて、観察前述の病理学的特徴に基づいて、罹患の程度を定量化することができるスコアリングマトリックスを含む魚の罹患率をスコアリングするための代替的なアプローチを開発することが適切であり得ます。 </li><li>適切な統計分析を適用するために、統計学者に相談してください。 </li></ol></li></ol></li></ol> 6。好中球遊走注：以下のプロトコールは、ローカライズ、上皮IAV感染後の浮き袋に好中球移動を追跡するための方法を記載しています。記載された方法は、遺伝的および化学的操作の影響を試験するために修飾することができます。この技術を使用して、IAV感染の間に好中球の動作の基礎となるメカニズムを特徴づけることが可能になります。 <ol><li>イメージングのためにゼブラフィッシュのマウント<ol><li> 200 / mlのトリカインに結像される幼虫を麻酔。 </li><li>卵、水（〜50-100μl）を小滴で、24ウェル、ガラスボトムプレートのウェルにNS1-GFPに感染した幼虫：個々 のTg（mCherryをMPX）を転送します。他のIAV感染と対照魚と繰り返します。 </li><li>ゆっくりと大きな気泡を導入しないように注意しながら、各ウェル（セクション2.5）にメディアをマウント1％アガロース胚を追加します。 <ol><li>それはその側面に搭載されているように、ゆっくりと幼虫の位置を調整します。グッディとヘンリー37は、フィラメントとホウケイ酸ガラスキャピラリーに取り付けられ、所定の位置にsupergluedされた昆虫のピンを使用して、このアプリケーションで十分に機能するプローブを作成する方法について説明します。 </li></ol></li><li>アガロースが硬化したら、軽く200 / mlのトリカインを含む卵の水で個々のウェルを埋めます。 </li><li>共焦点顕微鏡を用いて、浮き袋に焦点を当てた20Xの対物レンズを用いて、明視野および蛍光画像のAZスタックシリーズをキャプチャします。 <ol><li>彼らはすべての目に見え、観察緑と赤の蛍光を捕捉するように上限と下限を設定します。 </li><li> 2.0マイクロ秒/≤4μmであるステップとピクセルで画像をキャプチャします。画素あたりの時間を増加させ、ステップ（ 例えば 0.5から1.0μm）との間の距離を小さくすると画像の解像度と品質を向上します。 </li><li>層をマージして2次元画像を生成します。 </li><li>現在私MPX-mCherryを陽性好中球の数を比較nはIAV感染および制御注入ゼブラフィッシュの鰾。 </li></ol></li></ol></li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

ヒト宿主 - 病原体相互作用をモデル化するために、小さな動物を使用することから得られる利益を最大化するためには、モデルシステムの固有の利点を生かす研究課題とテスト仮説をフレームに重要です。人間IAV感染のモデルとして、ゼブラフィッシュは、高い繁殖力、光学的透明度、薬物スクリーニングに従順、および好中球などの免疫細胞を標識したトランスジェニック系統の可用性を含むいくつかの長所を持っています。ゼブラフィッシュは、炎症および先天性免疫の研究のためのマウスモデルシステムにますます強力な代替手段として開発されました。彼らは開発の最初の4-6週間の間に機能して適応免疫応答を欠いているので、ゼブラフィッシュは、傷害および感染37から保護するために、自然免疫応答をマウントします。開発中のこの初期期間においては、単離し、単独で、自然免疫応答に起因する抗ウイルス応答のメカニズムを研究することが可能です。ティ赤色蛍光タンパク質と好中球のラベル、：作品は、Tgは（mCherryをMPX）のようなトランスジェニックゼブラフィッシュ系統の開発によって促進されてきました。 <...

世界保健機関（WHO）によると、インフルエンザウイルスは大人5〜10％であり、毎年子どもたちの20から30までパーセントに感染し、重症の3〜5000000例の原因となり、世界中の1 50万人が死亡。インフルエンザに対する毎年のワクチン接種は、病気を防ぐための最良の選択肢のまま。 WHOグローバル・アクションプランのような取り組みは、季節性インフルエンザの流行2に関連する罹患率および死亡率を減少させるために、季節性ワクチンの使用、ワクチン生産能力、そしてより強力なワクチン戦略の研究開発が増加しています。ノイラミニダーゼ阻害剤（ 例えばザナミビルおよびオセルタミビル）のような抗ウイルス薬は、一部の国で利用可能であり、発症3、4、5の最初の48時間以内に投与された場合、症状を緩和するのに有効であることが証明されています。グローバルな努力にもかかわらず、季節性インフルエンザの封じ込めのouインフルエンザウイルス抗原ドリフトは、多くの場合、ウイルス6の変化ゲノムに適応するために、現在の能力を超えるようtbreaksは、この時点では手ごわい課題です。ウイルスの新たな株を標的とワクチン戦略は、事前に開発されなければならない、時にはにより、最終的にインフルエンザシーズンに優勢株の種類が予期せぬ変化に最適に効果的な未満レンダリングされます。これらの理由から、感染症を含み、死亡率を減少させるための代替的な治療戦略を開発する明確な必要性が存在します。宿主-ウイルス相互作用の理解を達成することにより、新しい抗インフルエンザ薬およびアジュバント療法7,8を開発することが可能です。 ヒト宿主-インフルエンザウイルス（IAV）の相互作用は複雑です。ヒトIAV感染のいくつかの動物モデルがINCLUD、宿主 - ウイルス相互作用への洞察を得るために開発されていますマウス、モルモット、コットンラット、ハムスター、フェレット、およびマカク9る。ホスト-IAVダイナミクスの理解を高めてきた重要なデータを提供しながら、各モデル生物は、ヒトの医療に調査結果を翻訳しようとしたときに考慮しなければならない重大な欠点を有しています。ヒトインフルエンザが9を分離に感染したとき例えば、最も広く使用されているモデルであるマウスは、容易にIAV誘発性感染症の症状を発症しません。マウスは、マウスの上皮細胞ではなくヒト上皮細胞10上で発現α-2,6シアル酸結合のα-2,3シアル酸結合を発現するので、ヒトインフルエンザ自然向性単離物欠いているためです。人間IAVに存在する赤血球凝集素タンパク質は、好意的受容体媒介性エンドサイトーシス9、11を介してα-2,6シアル酸結合を保有する宿主細胞に結合し、入力して隔離します</s12、13&gt;まで。その結果、現在ではヒトインフルエンザのためのマウスモデルを開発中で、ケアは、人間の病気の側面を再現疾患の表現型を達成するために、インフルエンザの適切な株とマウスの適切な歪みをペアリングするために注意しなければならないことが認められています。対照的に、フェレットの上気道上皮細胞は、ヒト細胞14に似ているα-2,6シアル酸結合を有します。感染したフェレットは、ヒトおよび鳥インフルエンザウイルス14、15の病原性と伝達率などのヒト疾患において観察された病理学的および臨床的特徴の多くを共有しています。彼らはまた、ワクチンの有効性試験に非常に適しています。それにもかかわらず、ヒトインフルエンザのためのフェレットモデルは、統計的にsignifiの取得を行い、主にそのサイズと畜産のコストに関連するいくつかの欠点があります挑戦カントデータ。また、フェレットは、以前のテストの有効性を困難にする薬剤の薬物動態、生物学的利用能、および毒性の違いを表示しています。例えば、フェレットはM2イオンチャネル阻害剤、アマンタジン16に毒性を示します。したがって、人間IAV感染症についての質問を研究するための動物モデルを選択する際に、その固有の利点と限界、および調査中であるホストウイルスの相互作用の側面を考慮することが重要であることは明らかです。 ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュ 、微生物感染を調査するためのユニークな機会を提供する動物モデルである、免疫応答をホストし、そして潜在的な薬物療法17、18、19、20、21、22、23、&lt;SUPクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 24、25、26、27、28。ゼブラフィッシュの細胞の表面上のα-2,6結合したシアル酸の存在は、感染研究で裏付けとIAV 19の蛍光レポーター株を用いてin vivoで画像化したIAV、への感受性を示唆しました。 IAV感染ゼブラフィッシュでは、抗ウイルスifnphi1とMXA転写産物の発現増加は、先天性免疫応答が刺激されたことを示し、および浮腫および組織破壊を含むIAV感染ゼブラフィッシュ、で表示される病変は、ヒトインフルエンザ感染で観察されたものと同様でした。また、IAV抗ウイルスノイラミニダーゼ阻害剤ザナミビル限られた死亡率およびゼブラフィッシュ19で減少ウイルス複製。 この報告書では、システムを開始するためのプロトコルゼブラフィッシュ胚におけるIC IAV感染について説明します。プルーフの原理として臨床的に関連する用量でザナミビルを使用して、抗ウイルス活性について化合物をスクリーニングするためのこのゼブラフィッシュIAV感染モデルの有用性が実証されます。さらに、ゼブラフィッシュ浮き袋、解剖学的に哺乳動物の肺21に機能的に類似であると考えられている臓器、29、30、31に局在し、上皮IAV感染を発生するためのプロトコルは、記載されています。この局所的なIAV感染モデルを用いて、感染部位への好中球動員は、IAV感染および炎症における好中球生物学の役割の調査を可能に追跡することができます。これらのゼブラフィッシュモデルは、ヒトIAV感染の既存の動物モデルを補完し、小分子およびので増強の可能性の免疫細胞応答を試験するために特に有用ですtatisticalパワー、ハイスループットアッセイに中程度の能力、および光顕微鏡での免疫細胞の挙動と機能を追跡する能力。

<table><tbody><tr><td>インスタントオーシャン</td><td>スペクトラムブランド</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 25 mm滅菌使い捨てペトリ皿&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット&nbsp;</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S (MS-222)</td><td>ウェスタンケミカル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー、フィラメント付き&nbsp;</td><td>サッターインストゥルメント&nbsp;</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Zanamivir</td><td>AK Scientific</td><td>G939</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 鉗子&nbsp;</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72700-D</td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダーのヒント</td><td>エッペンドルフ</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡浸漬油</td><td>オリンパス</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ステージ キャリブレーション スライド&nbsp;</td><td>AmScope</td><td>MR095</td><td></td></tr><tr><td>MPPI-3 圧力インジェクター&nbsp;</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>背圧ユニット</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットホルダーキット</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>フットスイッチ</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>アプライド・サイエンティフィック・インスツルメンテーション</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>マグネットベース</td><td>アプライド・サイエンティフィック・インスツルメン</td><td>テーション マグネティックベース</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>P-4758</td><td></td></tr><tr><td>低温インキュベーター</td><td>VWR</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V12</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イルミネーター</td><td>ツァイス</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>冷光源</td><td>ツァイス&nbsp;</td><td>CL6000 LED</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底マルチウェルプレート、24 ウェル</td><td>Mattek</td><td>P24G-0-13-F</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX-81 FV-1000 レーザー走査型共焦点システム</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview ソフトウェア</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プリズム v6</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インフルエンザ A/PR/8/34 (H1N1) ウイルス&nbsp;</td><td>チャールズ川&nbsp;</td><td>490710</td><td></td></tr><tr><td>インフルエンザA型X-31、愛知県/68号(H3N2)&nbsp;</td><td>チャールズ川&nbsp;</td><td></td><td></td>490715</tr><tr><td>インフルエンザ NS1-GFP</td><td></td><td></td><td>は Manicassamy et al. 2010</td></tr><tr><td>Tg(mpx:mCherry)</td><td></td><td></td><td>Lam et al. 2013 で参照</td></tr></tbody></table>

抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザaウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

毎年、季節性インフルエンザの発生は世界中の社会に深刻な影響を与えています。世界的な取り組みにもかかわらず、インフルエンザは依然として医療の難治性の負担となっています。感染を抑制するための主要な戦略は、毎年のワクチン接種です。インフルエンザに罹患した人では、抗ウイルス薬が症状を緩和することができます。インフルエンザと闘うための代替戦略を開発する必要性は明らかで、満たされていない。宿主とインフルエンザの相互作用をモデル化するために、いくつかの動物モデルが作成されています。ここでは、全身性および限局性ヒトインフルエンザAウイルス(IAV)感染に対するゼブラフィッシュモデルを生成するためのプロトコルについて説明します。全身性IAV感染モデルを用いて、抗ウイルス活性が期待できる低分子をスクリーニングすることができます。その原理証明として、IAV感染ゼブラフィッシュにおける抗ウイルス薬ザナミビルの有効性を実証するプロトコールが記載されています。IAV感染ゼブラフィッシュにおける潜在的な抗ウイルス薬の相対的な有効性をスコアリングするために、疾患の表現型を定量化する方法を示しています。近年、好中球がインフルエンザ感染に対するヒト宿主の反応に重要な役割を果たしていることが注目されています。ゼブラフィッシュは、好中球生物学の研究に不可欠なモデルであり、人間の医学に直接影響を与えることが証明されています。Tg(mpx:mCherry)ゼブラフィッシュ系統で局所的なIAV感染を生じさせ、局所的なウイルス感染の状況下で好中球生物学を研究するためのプロトコールが記載されている。局所的な感染部位への好中球の動員は、治療への応用が可能な実験的操作を評価するための追加の定量化可能な表現型を提供します。記載されているゼブラフィッシュのプロトコルは両方とも、ヒトIAV感染の側面を忠実に再現しています。ゼブラフィッシュモデルには、高い繁殖力、光学的透明度、薬物スクリーニングへの適合性、好中球などの免疫細胞が蛍光タンパク質で標識されているものを含むトランスジェニック系統の利用可能性など、多くの固有の利点があります。ここで詳述するプロトコルは、これらの利点を活用し、最終的に臨床につながる可能性のある宿主とIAVの相互作用に関する重要な洞察を明らかにする可能性を秘めています。

ここでは、ゼブラフィッシュにおける全身IAV感染は、薬効（ 図1A）をテストするために使用することができる方法を示すデータが提供されます。 48時間後、受精における胚は、ウイルス感染を開始するためキュビエのダクトを介しAPR8（ 図1C、1F）、X-31（ 図1D、1G）、またはNS1-GFP（ 図1H-1I）を注射します。 48時間後に受精で胚の別のコホートは、ウイルス感染（ 図1B、1E）のコントロールとして機能するように注入しました。 48時間後に感染することにより、IAVを注入したゼブラフィッシュは、心膜（ 図1G）全体に存在する赤血球で、心膜浮腫（ 図1C、1D）と循環停止（ 図1F）の証拠を示しました。早ければ3時間後に感染が認められたとして、蛍光顕微鏡によりNS1-GFP、GFPの最初の式を...

ヒトインフルエンザAウイルスの全身および局所的なゼブラフィッシュ感染モデルが示されています。全身感染モデルを用いて、ゼブラフィッシュは抗ウイルス薬のスクリーニングに使用することができます。局所感染モデルを使用して、ゼブラフィッシュは宿主免疫細胞の応答を特徴付けるために使用できます。

抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

これらの手順の全体的な目的は、ゼブラフィッシュをインフルエンザモデルとして利用し、ウイルス感染に対する宿主の免疫応答を研究すること、および抗ウイルス化合物のスクリーニングを行うことです。これらの手法は、感染中の免疫および炎症において貪食細胞が果たす役割や、潜在的な抗ウイルス療法の有効性など、インフルエンザ研究分野における重要な疑問への回答に寄与します。ゼブラフィッシュのインフルエンザモデルは、成長過程にあるゼブラフィッシュの光学的な透明性と、中〜高スループットアッセイを実施できる能力により、これまで解決できなかった疑問へのアプローチを可能にします。テキストプロトコルに従って試薬を調製し、胚を目的のステージまで育成させた後、実験当日に5番ピンセットを用いて胚の脱殻を行います。APR-8またはX31ウイルスを使用する場合は、層流クリーンベンチ内で、0.25% フェノールレッドを添加した滅菌済みの氷冷PBSを用いて、ウイルスを3.3×10⁶ EID₅₀に希釈します。NS1-GFP株を使用する場合は、ウイルスを約1.5×10² PFU/nLに希釈します。同時に、ウイルスと同様に希釈した非感染鶏卵由来の尿囊液を含むコントロールを準備します。次に、マイクロローダーチップを用いて、ウイルス溶液をマイクロインジェクション針にピペットで分注し、インジェクション装置の適切なホルダーにマイクロインジェクション針を挿入します。テキストプロトコルに従って針をクリッピングした後、所望の注入量が得られるまで、プレッシャーインジェクターの圧力とタイミングの設定を調整し、または針先を再度クリッピングします。胚を麻酔した後、プラスチックピペットを使用して10～20個の胚を2%アガロースプレートに移し、余分な液体をピペットで除去します。実体顕微鏡下で、火炎研磨して封止したホウケイ酸ガラスキャピラリーを用い、クヴィエ管または後主静脈がマイクロインジェクション針と直線状になるように、胚を慎重に整列・配向させます。IAVのマイクロインジェクションを行うには、マイクロインジェクション針をクヴィエ管または後主静脈にゆっくりと挿入します。次に、フットペダルを踏んで、目的量のIAVを胚の循環系に注入します。全身感染を達成させるには、注入したボラスが循環系に巻き込まれ、全身に分散することが極めて重要です。ボラスが感染部位に留まっている場合は、その胚を実験から除外し、安楽死させてください。受精から5日後、本ビデオの前半で説明した方法で針を準備します。先ほど示したように、浮き袋が膨らんでいるTG MPX mCherry幼魚を配置します。ただし、針が浮き袋を貫通し、ウイルスの投与部位が浮き袋の後方になるように幼魚の位置を調整してください。マイクロインジェクション針を浮き袋にゆっくりと挿入し、目的の容量を器官の後方に向けて注入します。注入液は後方に集まり、浮き袋の気泡は前方に押し出される必要があります。浮き袋への感染を成立させるには、注入した液塊が浮き袋の後方に集まり、それによって気泡が前方に移動することが不可欠です。注入後早ければ3時間でGFPの発現が観察され始めます。対照溶液を含む注入作業が完了した後、幼魚を滅菌卵水が入ったシャーレに移し、33 °Cでインキュベートします。抗ウイルス薬治療を行うには、感染から3時間後に、NS1-GFPおよび対照感染魚の卵水を、0、16.7、または33.3 ng/mLのZanamivirを含む滅菌水に交換します。注入から24～48時間後より、嗜眠状態の兆候や浮腫の証拠、色素沈着の違い、眼球および頭蓋顔面の変形、脊柱後弯症など、疾患の病理に関連する感染ダイナミクスの観察記録を開始します。感染後5日間、24時間ごとに死亡、罹患、および健康な幼魚の数を記録します。データを積層棒グラフとしてプロットし、Y軸に健康、罹患、または死亡した魚の割合を、X軸に処理群をプロットします。イメージング用にゼブラフィッシュを固定するには、NS1-GFPを感染させた個々のトランスジェニック MPX mCherry 幼魚を、24ウェルガラスボトムプレートのウェルに転送し、少量の卵水（egg water）を加えます。他のIAV感染魚および対照魚についても同様に繰り返します。大きな気泡が入らないように注意しながら、1%アガロース胚固定培地を各ウェルにゆっくりと加えます。幼魚の位置を慎重に調整し、それぞれが側臥位で固定されるようにします。アガロースが凝固したら、200 µg/Lのトリカインを含む卵水を用いて、個々のウェルに静かに満たします。共焦点顕微鏡を用い、浮き袋に焦点を合わせた20倍対物レンズを使用して、明視野像および蛍光像のZスタックシリーズを撮影します。IAV感染ゼブラフィッシュと対照注入ゼブラフィッシュの浮き袋に存在するMPX mCherry陽性好中球の数を定量し、比較します。ここでは、ゼブラフィッシュにおける全身性IAV感染を、薬剤の有効性試験にどのように利用できるかを示すデータを示しています。48 HPFの胚のキュビエ管にAPR8、X31、またはNS1-GFPを注入し、ウイルス感染を惹起させました。ウイルス感染のコントロールとして用いる胚には、48 HPFで注入を行いました。感染後48時間までに、IAVを注入したゼブラフィッシュでは、心膜浮腫および心膜全体に赤血球が認められる循環停止の徴候が見られた。ザナミビルを投与しなかった感染魚では、全身的なGFP発現において浮腫の特徴が見られた。ザナミビルを投与したNS1-GFP感染幼魚では、GFP蛍光による肉眼的な病理所見の軽減が観察された。ゼブラフィッシュの局所的な浮袋感染モデルを用いた本実験では、受精後5日目のトランスジェニックMPX mCherry稚魚の浮袋にNS1-GFPウイルスを注入し、mCherryで標識された好中球の浮袋への動員を追跡しました。感染後20時間において、PBSを注入した対照群と比較して、IAV感染魚の浮袋への好中球の顕著な遊走が観察され、IAVがヒトの肺と同様に、好中球を浮袋へと動員できることが示されました。これらの手法は、最終的に臨床への応用につながる可能性のある、宿主とインフルエンザAウイルス（IAV）との相互作用に関する重要な知見を明らかにする可能性を秘めており、抗ウイルス療法への発展が期待されます。インフルエンザの取り扱いは極めて危険であるため、本手順を実施する際は、ワクチン接種や適切なPPE（個人用保護具）の着用を含む予防策を必ず講じてください。

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学ぶゼブラフィッシュを用いたヒトインフルエンザAウイルス感染モデルによる抗ウイルス薬スクリーニングと宿主免疫細胞応答の解析手法。この方法はウイルス学および免疫学研究に応用可能です。

抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、

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