真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

このタンデムアフィニティー精製法の全体的な目標は、真核細胞から発現するタンパク質複合体を単離し、生化学的特性評価と分子集合、およびそれらの機能を調節する新規インターアクターと翻訳後修飾の同定を行うことです。この方法により、真核細胞から無傷のタンパク質複合体を精製し、その機能を微調整する新しい相互作用因子と調節可能な翻訳後修飾を同定することが可能になります。この技術の主な利点は、タンパク質複合体の高純度と高収率で、その機能と活性を研究するための下流のin vitroアプリケーションを可能にすることです。

細胞は、トランスフェクションの48時間後にSTREPアフィニティー精製から収集されます。メディアを取り外し、8ミリリットルのコールドPBSを追加します。ピペットを上下に動かして、細胞をプレートから取り外します。

細胞懸濁液を回収して15ミリリットルのチューブに移し、細胞を800倍gで摂氏4度で4分間回転させます。PBS上清を取り除きます。800 g で 4 °C で 1 分間スピンダウンし、残留 PBS を除去します。

この手順を開始するには、各細胞ペレットをパッシブ溶解バッファー(PLB)の細胞ペレット容量の5倍に再懸濁します。細胞懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。懸濁液を短時間渦巻きにし、摂氏4度で30分間回転させます。

細胞懸濁液を10,000倍gで摂氏4度で10分間スピンダウンします。可溶性ライセートを新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、細胞ペレットを廃棄します。可溶性ライセートの最終体積の10%をSTREP-APインプットとして保存し、摂氏4度で保存します。

STREPビーズでプルダウンした複合体は、FLAGビーズでプルダウンした複合体よりも大幅に多くのタンパク質を回収するため、最初のアフィニティー精製ステップではSTREPビーズを使用することが重要です。広口ピペットチップを使用して、アフィニティー精製のために適切な量の50%STREPビーズスラリーを除去します。摂氏4度で2分間、1,500gでスピンダウンします。

上清を取り除き、ビーズに500マイクロリットルのPLBを追加します。ビーズ混合物を摂氏4度で5分間定型化します。もう一度スピンダウンします。

3回目の洗浄後、上清を取り除き、ビーズをPLBに再懸濁して、最終容量がn×40マイクロリットル(nはサンプル数)になるようにします。40マイクロリットルの50%STREPビーズスラリーを各細胞ライセートサンプルに加え、摂氏4度で2時間ヌテートします。このタンパク質産生および回収時には、複数のプレートの細胞を使用することができ、異なるプレートから溶解された同じタンパク質サンプルをSTREPアフィニティー精製中にビーズの一部と組み合わせることができます。

細胞溶解物とSTREPビーズスラリー混合物を2時間インキュベートした後、摂氏4度で2分間、1,500倍gでスピンダウンします。STREP APが流れ、摂氏4度で保存するため、上清を保存します。500マイクロリットルのSTREP APウォッシュバッファーをビーズに加えます。

ビーズを緩衝液混合物中で4°Cで5分間nuteし、摂氏4°Cで2分間1,500倍gで遠心分離します。上清を捨て、500マイクロリットルのSTREP APウォッシュバッファー1で再度洗浄します。3回目の洗浄後、ビーズ溶液を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、タンパク質のバックグラウンドを減らします。

STREP APウォッシュバッファー1で4回目洗浄します。スピン後、上清を取り除き、500マイクロリットルのウォッシュバター2を追加します。チューブを反転させてビーズを平衡化し、摂氏4度で2分間、gの1,500倍でスピンダウンします。

上清を捨てます。目的のタンパク質を50 μLのSTREP溶出バッファーで溶出します。800rpmで摂氏4度で15分間渦

ビーズを1,500gで摂氏4度で1分間回転させます。上清を集めます。この画分は、STREP AP溶出サンプルに対応します。

ビーズ画分を摂氏4度で保存し、2回目の溶出を行います。STREP AP溶出液の10%を銀染色および/またはウェスタンブロッティングに分注します。その後のFLAG免疫沈降のための出発物質の量を増やすために、1回目と2回目のSTREP溶出液を一緒にプールして、FLAG溶出液をより効率的に回収することができます。

この手順は、広口のピペットチップを使用して、適切な量のFLAGビーズ溶液を微量遠心チューブに移すことから始めます。摂氏4度で2分間、1,500gでスピンダウンします。上清を取り除き、500マイクロリットルのFLAG洗浄バッファーをビーズに加えます。

氏4度で2分間、1,500gでスピンダウンします。上清を捨て、FLAG洗浄バッファーで再度洗浄します。3回目の洗浄後、上清を除去し、ビーズをFLAG洗浄バッファーに再懸濁して、最終容量がn×16マイクロリットル(nはサンプル数)になるようにします。

残りのSTREP AP溶出液に16マイクロリットルのFLAGビーズスラリーを加え、摂氏4度で一晩中、FLAGビーズスラリーを添加します。FLAGビーズスラリーとSTREP AP溶出液を一晩インキュベートした後、FLAG免疫沈降を進めます。FLAGビーズ懸濁液を1,500倍gで4°Cで2分間回転させます。

上清はFLAG IPが流れ、摂氏4度で保存されるように保存します。500マイクロリットルのFLAGウォッシュバッファーをビーズに加えます。摂氏4度で5分間定置し、摂氏4度で2分間gの1,500倍で遠心分離します。

上清を捨て、500マイクロリットルのFLAG洗浄バッファーで再度洗浄します。3回目の洗浄後、タンパク質ビーズ溶液を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、バックグラウンドを低減します。FLAG洗浄バッファーで4回目に洗浄します。

最終スピンから上清を取り除き、FLAGペプチド1マイクロリットルあたり200ナノグラムを含む30マイクロリットルのFLAG洗浄バッファーをビーズに加えます。800rpmで4°Cで2時間渦を巻きます。2時間後、懸濁液を1,500倍gで4°Cで2分間回転させます。

上清を採取し、FLAG IP溶出液として摂氏4度で保存します。このビデオでは、Tandemアフィニティー精製(TAP法)をCyclin-T1 CDK9複合体に適用しました。STREPタグ付きCyclin-T1およびFLAGタグ付きCKD9は、HEK293 T細胞で過剰発現していました。

STREPタグ付きCDK9およびFLAGタグ付きCyclin-T1を用いて、相互実験も行った。ウェスタンブロット解析では、FLAGタグ付きCKD9はSTREPビーズからSTREPタグ付きCyclin-T1と共溶出しましたが、ネガティブコントロールではSTREPタグ付きCyclin-T1を欠損したAPでは共溶出しませんでした。両方のタンパク質がFLAG溶出液で検出され、複合体形成がさらに確認されました。

相互TAPの結果は、FLAGタグ付きCyclin-T1がSTREPタグ付きCDK9と共溶出したことを示しており、Cyclin-T1 CDK9相互作用が利用されるエピトープに依存しないことがさらに検証されています。TAPと相互TAPの結果も銀染色によって分析されました。アスタリスクは共溶出不純物を示します。

FLAGタグ付きCKD9は、STREPビーズからSTREPタグ付きCyclin-T1と共溶出しましたが、その後のFLAG溶出 AP.In コントロールからは共溶出せず、STREPタグ付きCyclin-T1をFLAGビーズからCDK9と共溶出しました。同様に、FLAGタグ付きCyclin-T1は、STREPビーズからSTREPタグ付きCDK9と共溶出しましたが、制御APからは溶出しませんでした。そして、タンパク質-タンパク質複合体は、2回目のFLAG IPステップ後に効率的に回収されました。この手法を習得すると、適切に実行されれば細胞を収集する準備ができたときから、2日で完了できます。

この手順を試みる際には、十分なタンパク質を回収して検出できるように、それに応じて実験あたりの細胞プレートの数を増やすことを覚えておくことが重要です。例えば、新規の調節サブユニットの同定や、複雑なサブユニットの翻訳後修飾の研究などです。この技術は、その開発後、タンパク質間相互作用を研究する研究者が真核細胞の新たな相互作用や翻訳後修飾を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、STREPタグとFLAGタグを使用してタンパク質を単離し、特性評価する方法を十分に理解できるはずです。