Name: 真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 学ぶタンデムアフィニティー精製法で真核細胞からタンパク質複合体を高純度・高収率で単離し、新規相互作用因子や翻訳後修飾を同定する生化学的手法。この技術はタンパク質機能解析に有用です。

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>jove_content<この出版物で報告された研究は、NIHの国立アレルギー感染症研究所(NIAID)の支援を受け、賞番号R01AI114362とウェルチ財団がI-1782をIván D'Orsoに授与しました。

1.めっきセル<ol><li>トランスフェクションの1日前に、10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）および1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）10mLに3.5×10 6 HEK293T細胞をプレート100ミリメートル皿当たり（10,000 U / mlのストック）。十分なタンパク質回収を確実にするために、実験/条件当たり5 100mm皿 - プレート3。 注意：プレートの数は、目的のタンパク質複合体の発現レベルおよび溶解度に依存するそれぞれの実験/条件に対して決定されなければなりません。より大規模な精製が必要な場合は別の方法として、細胞株は、スピナーフラスコ2に懸濁液中で増殖するように適合させることができますが、この方法は、一過性トランスフェクションのために動作しません。 </li></ol> 2.細胞をトランスフェクトまたは安定な細胞株を誘導<ol><li>翌日、細胞を顕微鏡下で確認してください。 proce前に、80％コンフルエント - 細胞は70でなければなりませんeding。 </li><li>プラスミドDNAの7μgの100 mmディッシュあたりのトランスフェクション試薬の21μlの総混合物で細胞をトランスフェクトします。トランスフェクション効率のコントロールとしてGFP（ 表1）を発現するベクターで細胞をトランスフェクトします。 注：HEK293-T-REXまたはドキシサイクリン14,15に応答して二つ以上の複合体のサブユニットの発現を誘導する同様の安定した細胞株を使用する場合、誘導物質を細胞に添加し、48時間インキュベートされなければなりません。同様に、誘導物質の添加時にGFPの発現を誘導する安定な細胞株はまた、検証目的のために必要とされるであろう。 2.7に進みます。 </li><li> 100ミリメートル皿当たりトランスフェクション混合物を準備します。 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブでは、（2以上のプラスミドに相当）総プラスミドDNAの7μgのと非補充DMEM500μlのを混ぜます。別々のマイクロ遠心チューブでは、未補充DMEMのwiの500μLを混ぜますトランスフェクション試薬の第21μlの。各トランスフェクション反応のために繰り返します。 </li><li>プラスミドDNA溶液へのトランスフェクション試薬溶液をピペットで（逆の順序でソリューションを混在させないでください）。少なくとも4回ピペッティングして混ぜます。 </li><li>もはや15分より15分、しかし - 10室温でこの混合物をインキュベートしていません。 </li><li>メディアリザーバーを作成して、慎重に細胞を乱すことなく、プレートの内側に滴下トランスフェクション混合物をピペットするためにプレートを傾けます。元の平らな位置に皿を返し、混合物を配布するために穏やかに旋回。 </li><li> （この条件は以下「組織培養インキュベーター」とも呼ばれる）、5％CO 2の加湿細胞培養インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートします。メディア5時間後、トランスフェクション（オプション）を交換してください。 </li></ol> 3.確認トランスフェクションまたは誘導効率<ol><li> 24時間後、トランスフェクションでは、インフルエンザの下で細胞を可視化orescent顕微鏡は、トランスフェクション効率（またはGFPを発現制御HEK293T-REX安定な細胞株の誘導）をチェックします。さらに24時間インキュベートします。 </li></ol> 4. STREPアフィニティー精製（STREP AP） <ol><li> 細胞を収集します <ol><li> 48時間トランスフェクション後に、培地を除去し、冷1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の8ミリリットルを追加します。プレートから細胞を剥離するために上下にピペット。 </li><li>収集し、15 mLのチューブに細胞懸濁液を移し、4℃で4分間、800×gで細胞をスピンダウン。 </li><li> PBS上清を取り除きます。任意の残留PBSを除去するために（4℃で1分間、800×gで）スピンダウン繰り返します。将来の使用のために-80℃で細胞ペレットを保存したり、タンパク質精製を続行するには、以下の手順に従ってください。 </li></ol></li><li> 細胞を溶解 <ol><li>受動溶解緩衝液の細胞ペレットの体積（プレート当たり〜250μl）を×5を使用して、細胞ペレットを再懸濁し（PLB：20mMトリス塩酸pH7.5で、150mMのNaCl、1.5mMのMgCl 2を、1mMのDTT、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠、5％（v / v）のグリセロール、1.0％NP-40）及び細胞懸濁液を転送します1.5ミリリットルマイクロチューブ。 </li><li>簡単に言うと4℃で30分間サスペンションとうなだれるをボルテックス。 </li><li> 4℃で10分間10,000×gで細胞懸濁液をスピンダウン。 </li><li>新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに可溶性溶解物を移し、細胞ペレットを捨てます。可溶性溶解物の最終体積の10％を保存」STREP AP入力。」 4℃で保存。 </li></ol></li><li> STREPビーズを平衡化 注：最初のAPのステップの使用STREPビーズ！複合体はSTREPビーズでプルダウンFLAGビーズでプルダウンものよりも有意に多くのタンパク質を回収。 <ol><li>アウトテイク（nは40μLを×）+ nは50％STREPビーズスラリーμlの（N =サンプル数）、4℃で2分間、1500×gでスピンダウン。 注：使用ワイドメートルピペットビーズにヒントをouthed。 </li><li>上清を除去し、ビーズにPLBの500μlを添加します。 4℃で5分間ビーズ混合物を章動。 4℃で2分間、1500×gでスピンダウン。 <ol><li>合計3回の洗浄のために繰り返します。 40μlの×n個の最終容量までPLB中のビーズを再懸濁します。 </li></ol></li><li> 4℃で2時間、各細胞溶解物のサンプルとうなだれるに50％STREPビーズスラリー40μlのを追加します。 </li></ol></li><li> STREP AP <ol><li> 4℃で2分間、1500×gでソリューションをスピンダウン。 </li><li> 4°Cで「STREP APフロースルー（FT）」と上清とストアを削除します。 </li><li>ビーズにSTREP AP洗浄緩衝液500μlのI（20mMのトリス塩酸pH7.5で、250mMのNaClを、1.5のMgCl 2、1mMのDTT、5％グリセロールおよび0.2％NP-40）を追加します。 5 4℃で分および4℃で2分間、1500×gで遠心分離するためのビーズ混合物を章動させます。上清を捨てます。 <ol><li> 4回の洗浄の合計のために繰り返します。 <br/&gt;注：第洗浄する前に、タンパク質のバックグラウンドを低減するために、新しい1.5ミリリットルのマイクロチューブにビーズ液を移します。このステップは必須です。 </li></ol></li><li> 500μlの洗浄緩衝液II（100 mMトリス塩酸pH8.0の、150mMのNaCl、および1mM EDTA）を加え、チューブを反転させてビーズを平衡化。 4℃で2分間、1500×gでスピンダウンし、上清を捨てます。 </li><li> STREP溶出緩衝液（100mMのトリス塩酸pH8.0の、150mMのNaCl、1mMのEDTA、および2.5 mMのデスチオビオチン）50μlの目的のタンパク質を溶出させます。 4℃で15分間、800rpmでボルテックス。 </li><li> 4℃で1分間、1500×gでビーズをスピンダウン。上清を収集します。この画分は、「STREP AP溶出」のサンプルに対応します。 </li><li>最初の溶出で得られたタンパク質の量の半分までをもたらし得る2回目の溶出、4℃でビーズ画分を保存します。銀染色および/またはウェスタンブロッティングのためにSTREP AP溶出の一定分量10％16。 </li></ol></li><li> FLAGビーズを平衡化 <ol><li> （NX 16μl）を取り出し+ n個μlのFLAGビーズの溶液（n個のサンプルの=数）と4℃で2分間、1500×gでスピンダウン。 注：ピペットのビーズに広口のヒントを参考にしてください。 </li><li>上清を除去し、FLAG洗浄緩衝液500μlを追加（100mMのトリス塩酸pH8.0の、150mMのNaCl、1mMのEDTA、および0.1％NP-40）ビーズへ。 4℃で2分間、1500×gでスピンダウン。合計3回の洗浄のために繰り返します。 </li><li> NX 16μlの最終体積にFLAG洗浄緩衝液でビーズを再懸濁します。 </li><li> 4℃で残りのSTREP AP溶出とうなだれる一晩にFLAGビーズスラリーの16μLを加えます。 </li></ol></li></ol> 5. FLAG IP <ol><li> 4℃で2分間、1500×gでFLAGビーズ懸濁液をスピンダウン。 4°Cで「FLAG IPフロースルー」（FT）として、上清とストアを保存します。 </li><li> 500を追加します。81;溶液へのFLAG洗浄緩衝液のリットル。 5 4℃で分および4℃で2分間、1500×gで遠心分離するための章動させます。 4回の洗浄の合計のために繰り返して、各洗浄後に上清を除去します。 注：第洗浄する前に、バックグラウンドを低減するために、新しい1.5ミリリットルのマイクロチューブにタンパク質ビーズのソリューションを転送します。このステップは必須です。 </li><li>最後のスピンから上清を除去し、ビーズにFLAGペプチドの200 ngの/μLを含むFLAG洗浄緩衝液の30μLを追加します。 4℃で2時間、800 rpmでボルテックス。 </li><li> 4℃で2分間、1500×gでサスペンションをスピンダウン。 4℃で上清とストアを収穫 &quot;FLAG IP溶出。」 注：溶出サンプルは、標準的なプロトコル16を使用して、銀染色および/またはウェスタンブロットによって確認し、さらにタンパク質アッセイのための準備ができていることができます。 （1）STREP AP入力、（2）STREP AP FT、（3）STREP AP Eluti：ウェスタンブロットを設定する場合は、以下のサンプルのすべてを実行します（4）FLAG IP FT、上、および（5）FLAG IP溶出。ロードされたボリュームは、各実験のために決定する必要があります。すべての収集されたサンプルとビーズは、短期記憶および長期保存のために-80℃で、4℃で保存することができます。 TAPサンプルは、その構成要素の身元を確認するための新規の翻訳後修飾（PTMを）を識別するために、および/または精製された複合体2、17を有する任意の新規なタンパク質相互作用を検出するために質量分析によって分析することができます。この目的のために、クマシーゲルまたは銀染色を実行した後、バンドはきれいなメスを用いてゲルから切り出すことができます。質量分析法を議論するいくつかの優れたレビューは、以前に18、19を発表しました。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

真核細胞からのタンパク質複合体の発現および単離のためにここに記載したプロトコルは、このような分子集合体の生化学的特徴付けに限定されるものではなく、それらの機能を調節することができ、新規な相互作用および翻訳後修飾の同定に利用することができます。親和性タグの使用は、このプロトコルに記載されているものに限定されるものではありません。しかし、我々の経験は、最初のAPステップとしてSTREPを使用して有意に最終タンパク質 - タンパク質複合体の収率を高めることを示唆しています。 STREPビーズへとから結合および溶出手順の両方が他のエピトープタグ（ 例えば 、FLAG）と比較して非常に効率的です。また、理論的に、TAPは、緩衝液条件、（両方の過渡的で安定した発現システム）実験あたりプレートの数、 等さらになどのいくつかのマイナーな最適化と他のタンパク質またはドメインに適用することができる、TAP法もすることができ適用されたトン他の細胞株O特異的タンパク質複合体は、それらの機能やユニークな要因との相互作用のための特別なシステムを必要とする場合。トラブルシューティングを容易にするために、非常に入力し、FTサンプルの...

<html>タンパク質間相互作用（PPIの）生物学的プロセス1の正確な調節のために重要であり、これらのPPIに関するさらなる研究は、それらの機能2をお知らせすることができます。いくつかのアプローチがのPPIの研究と特徴付けのためだけでなく、新たな規制のタンパク質成分のデノボ識別のために考案されています。 1989年、スタンリーフィールズらは、酵母ツーハイブリッド（Y2H）アッセイ3を報告しました 。このアプローチは、 サッカロマイセス・セレビシエの関心の定義されたタンパク質（ベイト）のための相互作用（獲物）の公正かつ包括的な同定を可能にします。 PPIを発見するために著しい有用性に加えて、Y2Hアッセイは、酵母細胞におけるタンパク質の組を特徴付ける最小相互作用ドメインを定義し、そのような相互作用を廃止突然変異を同定するために使用することができます。 Y2Hアッセイを改変することによって、のPPIはまた、哺乳動物細胞において研究することができますクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 4。 Y2Hアッセイ（ 例えば 、酵母スリーハイブリッドシステム）の変動は、細胞内タンパク質、RNAおよびタンパク質-小有機リガンド相互作用を研究するために適用することができます。 相同システムでのPPIを研究するための別の一般的に使用されるツールは、共免疫沈降（共-IP）アッセイ5です。関心対象のタンパク質を免疫沈降するために抗体を使用することにより、共IPアッセイは、研究者が様々な環境条件および実験の状況のた​​めに細胞中でのPPIを監視することを可能にします。親和性精製（AP）メソッド内のエピトープタグ付きタンパク質の使用（ 例えば 、FLAG、Mycを、STREP、およびとりわけHAは、）、銀染色をウェスタンブロットを含むいくつかの下流のアッセイのための複雑なタンパク質混合物からのタンパク質の単離を容易にしました、および酵素的分析。しかしながら、これらの従来のアプローチのいずれも、in vitroでの Aを含む、さらなる特徴付けのためのタンパク質複合体の大量の単離を可能にしませんssays、質量分析による調節サブユニットの発見、および翻訳後修飾の同定。 AP法の改良版は、2後続のAP 6、7を通して精製された2つのエピトープとの融合タンパク質を作成することでのPPIを研究するための精製技術であるタンデムAP（TAP）と呼ばれています。この記事では、二つのサブユニットは、異なるエピトープでタグ付けした後、2回の連続のAP（STREP AP FLAG IPが続く）を通して精製された精製タンパク質複合体のためのTAP方法のバリエーションを提示します。研究者が興味のあるタンパク質複合体に適用できるように、我々はまず、TAPのミニマル概要（ 図1）と、すべての実験工程（ 図2）の詳細な説明を提供します。 TAP法の適用性を実証するために、我々は、PTと呼ばれる（複雑なよく特徴付けサイクリンCDKを選ん調節サブユニット、サイクリンT1（CycT1）及びキナーゼ（CDK9）から構成され、RNAポリメラーゼII（Pol II）8、9、10による転写の調節に関与するEFBキナーゼ）。 P-TEFbはポルIIプロモーターで転写休止を軽減それに関連する負の伸長因子のC末端ドメインをリン酸化し、それによって転写伸長11、12、13を容易にします 。このことを念頭に置い既知の相互作用により、STREPタグ付きCycT1およびFLAGタグCDK9はHEK293T細胞で過剰発現しました。逆数TAP実験をさらにタンパク質相互作用を利用するエピトープとは無関係であることを検証するためにSTREPタグ付きCDK9およびFLAGタグCycT1を用いて行きました。細胞を48時間トランスフェクション後に回収し、溶解しました。可溶性溶解物をTAPにより精製した（STREP APは、FLAGが続きますIP）。入力および精製されたタンパク質は、ウェスタンブロットおよび銀染色（ 図3）によって分析しました。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコ修正イーグルミディアム(DMEM)</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH3002.2FS</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>MP Biomedicals MP091670049</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル&nbsp;</td><td>ロシュ&nbsp;</td><td></td><td></td>11836153001</tr><tr><td>STREP-Tactin Superflow</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1208-010</td><td></td></tr><tr><td>STREP-tag elution buffer</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1000-025</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm &times; 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>タンパク質Lo-Bind エッペンドルフ</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Digital Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>48穴マイクロチューブフォームラック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-215-386</td><td></td></tr><tr><td>Labquakeシェーカーロティサリー&nbsp;</td><td>サーモ&nbsp;</td><td>415110</td><td></td></tr></tbody></table>

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

活性なタンパク質-タンパク質およびタンパク質-核酸複合体の精製は、酵素活性および新規サブユニットおよび翻訳後修飾の新規同定の特徴付けのために重要です。細菌系は、単一のポリペプチドおよびタンパク質複合体の広範囲の発現および精製を可能にします。しかし、このシステムは、翻訳後修飾を含有タンパク質サブユニット（ 例えば 、リン酸化およびアセチル化）の精製、および唯一の存在である新規な調節サブユニットの識別を可能に/真核生物系で表現されません。ここでは、真核細胞から一過性または安定的に発現エピトープタグ付きタンパク質とタンパク質複合体の精製を容易に小説、堅牢、かつSTREP-を使用して効率的なタンデムアフィニティー精製（TAP）法およびFLAGタグ融合タンパク質の詳細な説明を提供します。このプロトコルはPROTを特徴付けるために適用することができますEIN複雑な機能、複雑なサブユニット上の翻訳後修飾を発見する、および質量分析によって新たな規制の複雑なコンポーネントを識別するために。特に、このTAP法は、このように下流の実験機会の広い配列を得、真核生物または病原性（ウイルス性および細菌性）成分により形成されるタンパク質複合体を研究するために適用することができます。我々は、タンパク質複合体を扱う研究者は、多くの異なる方法で、この方法を利用することができることを提案します。

この記事では、我々は（また、P-TEFbキナーゼとして知られている）は、複雑なよく特徴付けCycT1-CDK9にTAP法の適用性を実証します。 CDK9-FLAG（CDK9：F）、またはCDK9-STREP（CDK9：S）およびサイクリンT1-FLAG（CycT1：F）：サイクリンT1-STREP（S CycT1）をコードするプラスミド（ 表1）は 、HEK293T細胞にトランスフェクトしました。 （ それぞれ図3AおよびB）Fプラスミド：FまたはCycT1：ネガティブコントロールが空のベクター及びCDK9とのトランスフェクションが含まれていました。細胞を回収した前のタンパク質を48時間発現させました。細胞の複数のプレートは、タンパク質産生および回収率を増加させる（サンプルあたり5プレートは、図3に示されるデータのた...

>jove_content<ここでは、真核細胞からのタンパク質複合体の発現、単離、および特性評価のための、新しく、堅牢で、効率的なタンデムアフィニティー精製（TAP）法について説明します。このプロトコルは、離散的な複合体の生化学的特性評価、ならびにそれらの機能を調節する新規相互作用因子および翻訳後修飾の同定に利用できる可能性があります。

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

このタンデムアフィニティー精製法の全体的な目的は、生化学的な特性解析、分子アセンブリの研究、およびそれらの機能を調節する新規の相互作用因子や翻訳後修飾の同定のために、真核細胞から発現したタンパク質複合体を単離することです。本手法により、真核細胞から完全なタンパク質複合体を精製し、その機能を微調整する新規の相互作用因子や調節的な翻訳後修飾を同定することが可能になります。この技術の主な利点は、機能や活性を研究するための下流のin vitroアプリケーションに向けて、高純度かつ高収量のタンパク質複合体を得られることです。トランスフェクションの48時間後に、STREPアフィニティー精製により細胞を回収します。培地を除去し、冷PBSを8 mL加えます。ピペッティングを行い、細胞をプレートから剥離させます。細胞懸濁液を回収して15 mLチューブに移し、4°Cで800 ×gにて4分間遠心分離します。PBS上清を除去します。残存するPBSを取り除くため、4°Cで800 ×gにて1分間遠心分離します。本手順を開始するには、各細胞ペレットをペレット体積の5倍量のパッシブライシスバッファー（PLB）で再懸濁します。細胞懸濁液を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。懸濁液を短時間ボルテックスし、4 °Cで30分間ニューテーターで撹拌します。細胞懸濁液を4°Cで10,000 ×gにて10分間遠心分離します。可溶性ライゼートを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、細胞ペレットを廃棄します。可溶性ライゼートの最終容量の10%をSTREP-APインプットとして保存し、4°Cで保管します。STREPビーズでプルダウンした複合体は、FLAGビーズでプルダウンしたものよりも大幅に多くのタンパク質を回収できるため、最初の親和性精製ステップではSTREPビーズを使用することが重要です。広口のピペットチップを用いて、親和性精製に適量の50% STREPビーズスラリーを分取します。4°Cで1,500 ×gにて2分間遠心分離します。上清を除去し、500 µLのPLBをビーズに加えます。ビーズ混合物を4°Cで5分間ニューテーションします。再度スピンダウンします。3回目の洗浄後、上清を除去し、ビーズをPLBで再懸濁して最終容量をn × 40 µLにします（nはサンプル数）。各細胞溶解液サンプルに40 µLの50% STREPビーズスラリーを加え、4°Cで2時間ニューテーションさせます。このタンパク質調製および回収において、複数の細胞プレートを使用することができ、異なるプレートから溶解させた同一のタンパク質サンプルを、STREPアフィニティ精製時に1回分のビーズでまとめて処理することが可能です。細胞溶解物とSTREPビーズスラリーの混合物を2時間インキュベートした後、4°Cで1,500 ×gにて2分間遠心分離します。上清をSTREP APフロースルーとして回収し、4°Cで保存します。ビーズに500 µLのSTREP AP洗浄バッファー1を加えます。4°Cで5分間、緩衝液混合物中でビーズを回転混和し、4°Cで1,500 ×gで2分間遠心分離します。上清を除去し、500 µLのSTREP AP wash buffer oneで再度洗浄します。3回目の洗浄後、タンパク質のバックグラウンドを低減させるため、ビーズ溶液を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。STREP AP洗浄バッファー1で4回目の洗浄を行います。遠心分離後、上清を除去し、500 µLの洗浄バッファー2を加えます。チューブを反転させてビーズを平衡化させ、その後、4°Cで1,500 ×g、2分間遠心分離します。上清を捨てます。50 µLのSTREP溶出バッファーを用いて目的タンパク質を溶出させます。4 °Cで800 rpmで15分間ボルテックスします。ビーズを 4 °C で 1,500 ×g、1 分間遠心分離します。上清を回収します。この画分が STREP AP 溶出サンプルに相当します。2回目の溶出に使用するため、ビーズ画分を4°Cで保存します。STREP AP溶出液の10%を分注し、銀染色および/またはウェスタンブロッティングに使用します。その後のFLAG免疫沈降に使用する開始物質量を増やすために、1回目と2回目のSTREP溶出液を合わせて、FLAG溶出の回収効率を高めることができます。広口のピペットチップを使用して、適切な量のFLAGビーズ溶液をマイクロ遠心チューブに移すことからこの手順を開始します。4°Cで2分間、1,500 ×gで遠心分離します。上清を除去し、ビーズに500 µLのFLAG洗浄バッファーを加えます。4°Cで1,500 ×gにて2分間遠心分離します。上清を捨て、FLAG洗浄バッファーで再度洗浄します。3回目の洗浄後、上清を除去し、ビーズをFLAG洗浄バッファーで再懸濁し、最終容量をn × 16 µLにします（nはサンプル数）。FLAGビーズスラリー16 µLを、残りのSTREP AP溶出液に加え、4 °Cで一晩ニューテーションさせます。FLAGビーズスラリーとSTREP AP溶出液を一晩インキュベートした後、FLAG免疫沈殿を行います。FLAGビーズ懸濁液を 1,500 ×g、4 °Cで2分間遠心分離します。上清をFLAG IPのフロースルーとして回収し、4°Cで保存します。ビーズに500 µLのFLAG洗浄バッファーを加えます。4°Cで5分間ニューテーションし、4°Cで1,500 ×gで2分間遠心分離します。上清を捨て、500 µLのFLAG洗浄バッファーで再度洗浄します。3回目の洗浄後、バックグラウンドを低減させるため、タンパク質ビーズ溶液を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。FLAG洗浄バッファーで4回目の洗浄を行います。最終遠心後の上清を除去し、ビーズに200 ng/µLのFLAGペプチドを含むFLAG洗浄バッファーを30 µL加えます。4°Cで800 rpmにて2時間ボルテックスします。2時間後、懸濁液を4°Cで1,500 ×gで2分間遠心分離します。上清を回収し、FLAG IP溶出液として4°Cで保存します。このビデオでは、タンデムアフィニティー精製（TAP法）をCyclin-T1 CDK9複合体に適用しました。STREPタグ付きCyclin-T1およびFLAGタグ付きCDK9をHEK293 T細胞で過剰発現させました。STREPタグ付きCDK9およびFLAGタグ付きCyclin-T1を用いて、相反的な実験（reciprocal experiment）も行いました。ウェスタンブロット解析の結果、FLAGタグ付きCDK9はSTREPビーズからSTREPタグ付きCyclin-T1と共に共溶出しましたが、STREPタグ付きCyclin-T1を欠いた陰性対照のAPでは共溶出されませんでした。両タンパク質がFLAG溶出液中で検出されたことにより、複合体形成がさらに確認されました。相互TAPの結果から、FLAGタグ付きCyclin-T1がSTREPタグ付きCDK9と共に共溶出したことが示され、Cyclin-T1とCDK9の相互作用が使用したエピトープに依存しないことがさらに検証されました。TAPおよび相互TAPの結果は、銀染色によっても解析されました。アスタリスクは共溶出した不純物を示しています。FLAGタグ付きCDK9は、STREPビーズからSTREPタグ付きCyclin-T1と共に共溶出しましたが、コントロールのAPからは共溶出されませんでした。その後のFLAG溶出では、STREPタグ付きCyclin-T1がFLAGビーズからFLAGタグ付きCDK9と共に共溶出しました。同様に、FLAGタグ付きCyclin-T1はSTREPビーズからSTREPタグ付きCDK9と共に共溶出しましたが、コントロールのAPからは共溶出されませんでした。そして、2回目のFLAG IPステップ後にタンパク質複合体が効率的に回収されました。この手法に習熟すれば、適切に実施することで、細胞の回収準備が整ってから2日間で完了させることができます。この手順を実施する際は、十分な量のタンパク質を回収および検出できるよう、実験あたりの細胞プレート数を適宜増やすことが重要です。例えば、新規の調節サブユニットの同定や、複合体サブユニットにおける翻訳後修飾の解析などが挙げられます。本手法の開発後、タンパク質間相互作用を研究する研究者が、真核細胞における新規の相互作用因子や翻訳後修飾を探索するための道が開かれました。このビデオを視聴することで、STREPタグおよびFLAGタグを用いてタンパク質を単離および特性解析する方法について、十分に理解することができます。

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学ぶタンデムアフィニティー精製法で真核細胞からタンパク質複合体を高純度・高収率で単離し、新規相互作用因子や翻訳後修飾を同定する生化学的手法。この技術はタンパク質機能解析に有用です。

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

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