Name: バンドウイルカ イルカ (バンドウイルカ) 精子: 異種には体外受精、凍結保存、コレクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学ぶバンドウイルカ精子の採取・凍結保存・異種体外受精プロトコル。牛卵を用いて凍結精子の機能を評価し、海洋哺乳類の生殖技術と保全に貢献する方法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

経済競争力 (AGL2015-70140-R + Rizos に)、a. グティエレス アダンと j. f. ペレス Gutiérrez に AGL2015 66145R とセネカ ムルシア財団 (グラント 20040/生殖/16 f. ガルシア ・ バスケスに) スペイン語省によって資金が供給された彼の作品

倫理の声明: すべての実験プロシージャが審査し、承認機関動物ケアとセルバンテス ナシオナル ・ デ ・危惧 y テクノロジー Agraria y Alimentaria (INIA) の利用委員会。再生研究のためまたは動物福祉法海棲哺乳動物のケアのために社会によって採用されているケアと実験動物の使用のためのガイドにしたがってすべての実験を行った.
 1。 イルカ精液採取し凍結保存 <ol><li>準備 <ol><li>作る FERT 媒体 (ヘパリンとヒポタウリン フリー)。25 mM 重炭酸、乳酸ナトリウム 22 mM、1 mM ピルビン酸ナトリウム、6 mg/mL 脂肪酸無料 BSA 10 mg/mL のヘパリン (pH 7.4) と FERT, 培を準備します 。
		注: 使用の日にこの媒体を準備し、38.5 ° C、5% の CO 2 と空気中で使用する前に少なくとも 2 時間の最大湿度雰囲気下でそれを維持します</li>。
		<li>の準備のトリス卵卵黄ベースのバッファー。30.28 グラム/L のトリス、16.75 グラム/L のクエン酸、12.5 g/L 果糖や純水 0.5 g/L ストレプトマイシン溶解 (pH 7.3、浸透圧 = 310 mOsm/kg)。20% の卵の黄身 (v/v) を追加します</li>。
	</ol></li> <li>背 recumbence 自主精液採取のためプールの端の近くで横に実績のある繁殖男性バンドウイルカを列車します 。
	注: 男性のドルフィン トレーニングを 6 ヶ月以上正の強化で 4 を前述のようします</li>。
	<li>性器の溝からペニスの自主的な押し出しを引き出すためにイルカの性器の溝の頭蓋領域に優しく押すことによってさまざまな触覚刺激を実行します</li>。
	<li>達成した後完全に勃起、射精を取得する滅菌容器にペニスの先端を直接します</li>。
	<li>は、分析まで 37 ° C で精子サンプルを維持します。手順 1.3 と 1.4 連続射精コレクションのたびに新しいプロピレン ガラスを使用しています</li>。
	<li>コレクションの後すぐに以前 37 ° c. の評価色、pH、浸透圧 (マイクロ osmometer を使用して) 射精の暖められたガラス シリンダーを用いたボリュームを決定します</li>。
	射精、精子の濃度を評価する <li>は、蒸留水の 90 μ L を含むエッペン チューブに精子懸濁液の 10 μ L を追加します。カウント部屋精子を使って精子の濃度を決定します 。
	: 評価においては, 注意射精の残りの部分の 37 ° c.</li>
	<li>運動パラメーターを評価します。
	<ol><li>精子サンプルの 10 μ L を取るし、予め温めておいた精子チャンバー</li>。
		<li>精子運動 2 を客観的に評価するために, バンドウイルカの検証済みコンピューターによる精子分析システムを使用して運動性を評価します 。
		注: 必要に応じて、精子の運動性の適切な可視化 (ヘパリンとヒポタウリン フリー) FERT 中精子サンプルを希釈します。評価においては, 加熱顕微鏡ステージ上 37 ° C でサンプルを維持します</li>。
	</ol></li> <li>精子サンプルの 20 μ L を取り、前述 5 生存率、精子形態を評価します</li>。
	<li>精子サンプルを遠心管に転送します。5 分の 250 x g で精子のサンプルを遠心します。後カウント チャンバーを用いた精子濃度を決定する、400 x 10 6 精子/ml 精子濃度を調整します 。
	注: 必要に応じて、遠心分離 (250 × g, 10 分) によって同じ射精の過剰体積から分離された精漿と集中射精からペレットを希釈します。
	<ol><li>5 分にわたって、ゆっくりと希薄精子サンプル 1:1 (v/v) 1.5% グリセロールを含んでトリス卵卵黄ベースのバッファー。1 時間 30 分の 5 ° C で精子懸濁液を含むチューブ</li>
		<li>実行精子懸濁液、トリスの第 2 希釈卵 3% 最終的なグリセロール濃度および 200 x 10 6 精子/mL の最終的な集中を取得するグリセロールを含む卵黄ベースのバッファーです。10 分の 5 ° C で精子懸濁液を維持</li>
	</ol></li> <li>精子懸濁液を 0.25 mL のストローに読み込みます。ストローをヒートシールします。ラックの上で 10 分間液体窒素 4.5 cm のストロー ストローを液体窒素に突入し、評価まで保存場所</li>。
</ol> 2。異種 体外 受精を使用してゾナそのまま卵子 <ol><li><ol><li>染色の準備の 準備 ソリューションとメディアをマウントします。
		<ol><li>準備ヘキスト原液 1 mL の蒸留水のヘキストの 1 mg を溶解することにより。30 μ 因数を行い、使用するまで-20 ° C で暗闇の中でそれらを保ちます。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1 g/L PVA を添加した 5 mL にヘキスト原液の 25 μ L を追加することで染色液を準備します。よく混合し、4 ° C で暗闇の中で使用されるまで維持します</li>。
			<li>準備 6.25 mL グリセリンとヘキスト原液の 6.25 μ L 6.25 mL の PBS を混合することによってメディアをマウントします。よく混合し、4 ° C で暗闇の中で使用されるまで維持します</li>。
		</ol></li> <li>卵コレクションと 体外 受精のためのメディアの準備します。
		<ol><li>0.9 %nacl 蒸留水にゲンタマイシンの 0.5 mL を追加して食塩を準備します</li>。
			<li>は、TCM 199 10 mL に 10 ng/mL 上皮成長因子 (EGF) と 10% 牛胎児血清 (FCS) を追加することによって在庫成熟培地を準備します。38.5 ° c、5% の CO 2 と空気中で使用する前に少なくとも 2 時間の最大湿度雰囲気下でメディアの両方を維持します</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>33-35 ° C で食塩の屠殺場で卵巣を収集し、コレクションから 4 時間以内に検査室にそれらを転送します</li>。
	<li>一度卵巣 3 回を洗う所で残骸を削除し、以前 37 に温めた生理食塩水ソリューションを使用して血 ° C 卵巣で維持 37 ° C で食塩プロセス中にします</li>。
	<li>吸引 2 〜 8 ミリメートルの包 18 g 針、10 mL の注射器。50 mL チューブに吸気の卵胞液を収集します</li>。
	<li>は、セル底まで 37 ° C で約 15 分のスタンドに卵子を含む卵胞液を許可します。パスツール ピペット管の上澄みを除去し、PBS でペレットを再停止します</li>。
	<li>顕微鏡下で 90 mm 料理卵丘卵子複合体 (Coc) を回復します</li>。
	<li>PBS で、成熟中 COCs を 3 回洗浄します</li>。
	<li>形態通常 Coc に転送 4 よく料理もウェルあたり 50 COCs のグループで、成熟中の 500 mL を含む各 。
	注: ここでは、3 つの井戸 &#8211; 異種体外受精、相同の体外受精は、1 つのコントロールのみを含んでいるよくよく成熟単為発生コントロールとして Coc &#8211; 使用された</li>。<li>5% CO 2 と最大湿度と空気雰囲気下での 38.5 ° C で 24 時間の Coc をインキュベートします</li>。
	<li>媒体と密度勾配の準備します。
	<ol>受精メディア (フェール) の準備、25 mM 重炭酸、乳酸ナトリウム 22 mM、1 mM ピルビン酸ナトリウム、6 mg/mL 脂肪酸無料 BSA 10 mg/mL のヘパリンと FERT, 媒体を補完する <li>。38.5 ° c、5% の CO 2 と空気中で使用する前に少なくとも 2 時間の最大湿度雰囲気下で維持します</li>。
		<li>は、密度勾配媒体 15 mL チューブに、15 mL チューブへの解決策を洗浄の 3 mL の 1 mL を追加することによって、密度勾配を準備します。少なくとも 1 h. のための 38.5 ° C でそれらを維持</li>
	</ol></li> <li>洗濯 体外 成熟 FERT 中 2 回卵</li>。
	<li>は、それぞれよくフェールの 250 mL の 50 COCs を含むに 4 よく料理に、卵母細胞に転送します。受精する精子を準備中に 5% CO 2 と最大湿度と空気雰囲気下での 38.5 ° C で 4 よく料理を維持します</li>。
	<li>解凍 50 37 ° C の水浴中でイルカの精子を含む冷凍稲藁米 
	注: 相同体外受精用精液は相同ウシ体外受精の標準的なプロトコルに従う並行処理必要があります</li>。
	<li>の精子を取る 10 μ L サンプル カウント部屋に予め温めておいた精子に配置.精子の運動性を客観的に評価するために、種の検証済みコンピューターによる精子分析システムを使用して運動性を評価します。この時間の間に維持 38.5 で精子サンプル ° C</li>
	<li>は、精子サンプルを密度勾配管 (ステップ 2.10.2) に追加します。250 x g. で 10 分間遠心</li>
	<li>は、パスツール ピペットを使用して上清を慎重に取り外します。ペレットを含む管に洗浄溶液 3 mL を追加します。軽く混ぜてペレットを再中断します</li>。
	<li>250 x g に 5 分間遠心する精子量 300 μ L をパスツール ピペットで上澄みを削除します</li>。
	<li>95 μ L の蒸留水を含む遠心機に精子懸濁液の追加 5 μ L。38.5 精子懸濁液を維持 ° C. 塗りつぶしセルのカウントは、1:20 の 10 μ L で商工会議所精子希釈と測定濃度。2 x 10 6 精子/mL を取得する精子の 100 μ L に追加する必要があります FERT 媒体の量を計算します</li>。
	<li>15 mL チューブに計算される FERT と精子のボリュームを追加し、そっとパスツール ピペットを使用してミックスします</li>。
	<li>、最終濃度が 1 × 10 6 精子/mL の成熟卵子と FERT 媒体を含んでいる 4 よく料理の各ウェルに精子 FERT 懸濁液の追加 250 μ L.</li>
	<li>共同 38.5 ° c、5% CO 2 と最大湿度と空気雰囲気下で 18 h の配偶子をインキュベートします</li>。
	<li>は、5% の FCS を添加した合成卵管液に培養液を準備します。鉱物油の 3 mL で覆われている 35 mm 料理における合成卵管液の培養液滴の 25 μ L を準備します。38.5 ° c、5% の CO 2 と空気中で使用する前に少なくとも 2 時間の最大湿度雰囲気下で維持します</li>。
	<li>2.5 h 投稿共同培養皿から 20 卵母細胞を削除; 同じ条件下でインキュベーターで残りの卵子を維持します。
	<ol><li>精力的にピペッティング ナローボア パスツール ピペットで卵子の半分を 10 回で緩く接続されている精子を削除します</li>。
		<li>ヘキスト染色溶液中 15 分間の 50 μ L に卵 30 分洗浄 5 分 PBS で卵母細胞を転送のための 0.5% グルタルアルデヒドの 50 μ L に 20 卵を修正し 5 分のための PBS の卵母細胞の洗浄</li>
		<li>はスライドごと 10 卵子の割合でメディアをマウント 2 μ L 水滴に個別に卵子を転送します。優しく、coverslip でカバーし、マニキュアでシールします</li>。
		<li>Epifluorescent 光学 40 倍の倍率で 361 nm 励起フィルターと位相差顕微鏡によるウシ体外に接続されている精子の数をカウントします</li>。
	</ol></li> <li>共同培養 12 時間後 4 も料理から 10 受精卵を削除; 同じ条件下でインキュベーターで残りの推定受精卵を維持します。
	<ol><li>転送、10 推定受精 15 mL 遠心チューブ含む 2 mL PBS と渦 2 分静かに卵丘細胞を除去します。洗浄 2 回 PBS、修正プログラム、および汚れ、前述 (ステップ 2.23.2)</li>。
	</ol></li> <li>18、20、22、および共同のインキュベーションの 24 h は 10 を削除後 4 よく料理や渦から受精卵修正と前述 (一歩 2.23.2)、それらを染色します。同じ条件下でインキュベーターで受精卵の残りの部分を保持します。
	<ol><li>ヘキスト染色前核形成と同種および異種の両方の体外受精グループの位相コントラスト/epifluorescent 顕微鏡下で多精子侵入を評価します</li>。
		<li>は、サンプルあたりの 10 のランダムに選ばれた推定ハイブリッド受精卵前核形成を評価します。共焦点レーザー顕微鏡を用いた 488 nm アルゴン レーザー励起で、515 に 530 nm 検出前核形成を確認します</li>。
		<li>は光学的に受精卵を順番にセクション (2 mm) し、イメージング ソフトウェアを使用して画像を収集します。3 D 解析ソフトウェア パッケージを使って視覚化します</li>。
		<li>共同培養 24 時間後洗う 50 受精卵 4 回 PBS と 2 回培</li>。
	</ol></li> <li>培以前の準備し、平衡の微小油滴中に 25 のグループでそれらを転送します</li>。
	<li>5%/5% O 2 の雰囲気下で 38.5 ° C で維持する CO 2 と最大湿度の空気中です</li>。
	<li>後 26 と共培養の 28 h 料理と渦、修正から 10 受精卵を削除し、それらを染色、前述 (ステップ 2.23.2).</li>
	<li>文化の 48 時間後、実体顕微鏡下で胸の谷間を観察</li>。
	<li>5 mg/mL のプロテアーゼ溶液に胚を転送することによって透明帯 (ZP) を削除します</li>。
	個別に PBS でそれぞれの胚 3 回を洗う <li>。スナップ-凍結に 0.2 mL マイクロ遠心チューブ用の液体窒素で。解析まで-80 ° C で保存します</li>。
</ol> 3。PCR <ol><li>材料および試薬 注: 試薬、材料、および PCR のプロトコルを実行するための装置材料のテーブルの詳細については、PCR チューブ ラックとマイクロ ピペット (P2、P20、P200、P1000) のセットを取り込む 1.5 mL遠心チューブ、PCR チューブ キャップ、サーマルサイクラー、UV 照明、agarose のゲルとバッファー (Tris ホウ酸 EDTA (TBE))。
	<ol><li>は軽く氷の上すべての試薬を解凍します。実験を通して氷でそれらを維持します。弱まりを使用 (dNTPs; dATP dCTP、dTTP と dGTP)、ドルフィン 18 S リボソーム蛋白質 (DQ404537.1); の参照遺伝子符号化のプライマーをターゲットR1: TTGGACACACCCACGGTGCGG と F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA)、DNA ポリメラーゼ、DNA ポリメラーゼ、DNA テンプレート、滅菌水、塩化マグネシウム (MgCl 2 5.0 mM の最終的な集中) の 5 X バッファーします</li>。
		<li>Agarose のゲルとサンプルの準備。
		<ol><li>準備イルカとウシ精子 DNA サンプル。
			<ol><li>50 の雪解け 37 ° C で水のお風呂にそれぞれの種の冷凍わら s. は、ソリューションの洗浄の 3 mL を加えます。250 x g で 10 分間遠心上清を削除します。STES 換散バッファー (50 mM pH 8; 20 mM の NaCl; トリス-HCl と 1 mM 0.1 %sds) の 30 μ L を追加プロティナーゼ K の 2 μ L (20 mg/mL)、およびジチオトレイトール (DTT); の 5 μ L最終濃度: 150 mM。超純水の 55 ° c. を追加 200 μ L で一晩を維持します。250 x g で 5 分間遠心上清をしてください。分光光度計を用いた DNA 濃度を測定します</li>。
			</ol></li> <li>超純水 PCR 条件ことができることを確認するイルカ精子 (すなわち 40、4、および 0.4 ng/mL) から DNA のシリアル希薄を実行イルカ DNA の少量を検出します</li>。
			<li>ウシ精子 DNA (すなわち 4,000、400、40、および 4 ng/mL) 超純水 PCR 条件が牛の DNA の少量を検出できることを確認するためのシリアル希薄を実行します</li>。
			<li>は、イルカとウシ胚を準備します。氷の上の胚を解凍します。100 μ g/mL プロティナーゼ K の 8 μ L を追加し、55 ° C で一晩を維持96 ° c で 5 分間サンプルを配置、反応を停止する</li>
			<li>2% の agarose のゲル TBE バッファーを準備し、標準的な手法を用いた核酸染色の 20 μ L を追加します</li>。
		</ol></li> <li>PCR の準備。
		<ol><li>ラベル PCR 尿管: イルカ シリアル希薄 (40、4、および 0.4 ng/mL)、牛のシリアル希薄 (4,000、400、40、および 4 ng/mL) 相同性ウシ 2 細胞胚、2 セル推定異種胚、ネガティブ コントロール</li>。
			<li>反応あたり 25 μ L の最終巻に滅菌 1.5 mL 遠心チューブにマスターの混合物を準備します。
			<ol><li>(10 mM) 1.5 の dNTPs の 0.5 μ L 5 X DNA ポリメラーゼ フレキシ バッファーの追加 5 μ μ L MgCl 2 (25 mM)、前方および逆プライマー (10 μ M)、1.5 μ L の DNA のテンプレート (精子) または 8 μ L の DNA のテンプレート (2 細胞期胚) の 0.5 μ L の、0.07 μ Taq ポリメラーゼと滅菌蒸留水 25 μ L 最終巻まで。よく混ぜる</li>。
			</ol></li></ol></li></ol></li> <li>増幅プロトコル <ol><li>、サーマルサイクラーにチューブを置きます。次のプログラムを選択: 94 ° C、3 分。40 サイクル 94 ° C の 15 s、59 ° C、25 s、20 の 72 ° C s;5 分の 72 ° c のプログラムを起動します</li>。
		<li>は、2% の agarose のゲルの井戸に混合物の 4 ° C および負荷 15 μ L で各 PCR の製品にローディングバッファーの 4 ° c. の追加 2.5 μ L でチューブを格納します。PCR のフラグメントの正確なサイズの推定に DNA ラダー マーカーを使用します</li>。
		<li>DNA の移行を許可するように 15 分間実行を電気泳動。UV イルミネーターを使用してバンドを視覚化します</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Montano, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+motility%2C+membrane+status+and+DNA+integrity+of+frozen-thawed+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29+spermatozoa+after+sex-sorting+and+recryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation.</a> Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).</li>
<li>Sánchez-calabuig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+field+based+chromatin+dispersion+assay+to+assess+sperm+DNA+fragmentation+in+the+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Domest+Anim%22%5BJournal%5D)">Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus).</a> Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).</li>
<li>Sánchez-calabuig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+murine+and+bovine+IVF+using+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa.</a> Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).</li>
<li>Keller, K. V. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books/about/Training_Atlantic_Bottlenose_Dolphins_Tu.html?id=RKstOAAACAAJ">Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination.</a> IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).</li>
<li>Robeck, T. R., O'brien, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+methods+and+precryopreservation+storage+on+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa.</a> Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).</li>
<li>Coy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hardening+of+the+zona+pellucida+of+unfertilized+eggs+can+reduce+polyspermic+fertilization+in+the+pig+and+cow%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow.</a> Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).</li>
<li>Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).</li>
<li>Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchroeder%2C+JP+%22The+Bottlenose+dolphin%22">The Bottlenose dolphin</a>. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).</li>
<li>Sánchez-Calabuig, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cryopreservation+on+the+sperm+DNA+fragmentation+dynamics+of+the+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Domest+Anim%22%5BJournal%5D)">Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus).</a> Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).</li>
<li>Robeck, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrous+cycle+characterisation+and+artificial+insemination+using+frozen-thawed+spermatozoa+in+the+bottlenose+dolphin+%28Tursiops+truncatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus).</a> Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).</li>
<li>Robeck, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+deep+intra-uterine+artificial+insemination+using+cryopreserved+sexed+spermatozoa+in+bottlenose+dolphins+%28Tursiops+truncatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus).</a> Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).</li>
<li>Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchroeder%2C+JP+%22The+Bottlenose+dolphin%22">The Bottlenose dolphin</a>. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).</li>
<li>Madeddu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cooling+rate+on+the+survival+of+cryopreserved+rooster+sperm%3A+Comparison+of+different+distances+in+the+vapor+above+the+surface+of+the+liquid+nitrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen.</a> Anim Reprod Sci. , (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

多くの異なった哺乳類種類の凍結・融解後の精子を使用するさまざまな利点があります。貴重な遺伝物質、世界的な流通の可能性、汚染、低リスク、雄性配偶子を何十年も維持するために機能を転送する機能が含まれます。この種は CITES Appendix 2、トランスポートおよび別の水生公園の間の動物の交換を制限の下で保護されているために、バンドウイルカが、凍結保存精子の使用が欠かせません。イルカ輸送の物流の問題と危険なリスクを作成する活動であります。しかし、それらを運ぶを控える結果、動物の捕獲下人口に血族を導入するリスクなどがあります。1 つのソリューションは、精子の凍結保存は。何人かの著者が, 凍結保存イルカ精子5,7,8,9, と非常に有望な結果。また、2005 年に最初の凍結保存精子を用いた人工授精によって考案イルカ子牛誕生報告10。これはいく...

海洋哺乳類を含む野生動物の生殖補助医療技術の発達は悪い。精子受精成功を評価する機密性の高い手法の欠如は、イルカなどの種の生殖技術の遅い開発に貢献します。それまでなかった最近ハンドウイルカ (バンドウイルカ) の基本的な精液パラメーターが報告された1,2。ただし、運動性および形態などの変数は、広く使用されているが与える生殖効率に関する限定的な情報です。精子の質の最良の指標は、受精能力の評価です。
最近、私たちのグループでは、イルカ精子ゾナそのまま卵子3を使用して異種の体外受精後ハイブリッド胚形成および/または雄性前核形成を評価することによって可能性を肥やすことを評価するためにメソッドが使用されます。イルカ ウシ異種体外受精の使用相同体外受精に重要な利点は、それはイルカの卵子を得ることの難しさを克服し、十分にテストされた体外ウシ卵母細胞の成熟システムの使用が容易になります。種特異性を避けるためには、異種受精は通常 ZP の不在で行われます。それは卵黄膜と融合する精子の先体反応の能力の評価できますが、受精に関連するその他の機能の評価を損ないます。手順ゾナそのまま卵を使用し、次のパラメーターの評価を許可: 精子ゾナ バインディングと添付ファイル、浸透、多精子侵入、前核形成およびハイブリッド胚胸の谷間。
ここで、紹介イルカの精子機能の評価と同様、精液採取、基本的な精子分析、精子凍結のいくつかのプロトコル異種体外受精後男性の前核および/またはハイブリッド胚の形成を評価することによってソナをそのまま使用して卵子。

<table><tbody><tr><td>FERT-TALP 媒体</td><td>メルク</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCM-199</td><td>シグマ</td><td>M-4530</td><td></td></tr><tr><td>ヘキスト 33342</td><td>シグマ</td><td>B-2261</td><td></td></tr><tr><td>4 ウェルディッシュ</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>密度勾配 BoviPure</td><td>ニダコンインターナショナル</td><td>BP-100</td><td></td></tr><tr><td>洗浄液 ボビウォッシュ</td><td>ニダコンインターナショナル</td><td>BW-100</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Promega</td><td>A35 1H</td><td></td></tr><tr><td>滅菌水</td><td>Mili Q sintesis A10 Millipore</td><td>A35 1H</td><td></td></tr><tr><td>バッファー トリスホウ酸塩 EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>MB アガロース</td><td>Biotools</td><td>20.012</td><td></td></tr><tr><td>5X GoTaq flexi バッファー</td><td>Mili Q sintesis A10 ミリポア</td><td>M 890 A</td><td></td></tr><tr><td>MB アガロー</td><td>ス Biotools</td><td>20.012</td><td></td></tr><tr><td>Taqポリメラーゼ</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SafeView</td><td>NBS Biologicals Ltd.</td><td>M 890 A</td><td></td></tr><tr><td>Makler 計数室</td><td>Sefi Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thoma チャンバー</td><td>Hecht-Assistant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter MicropH 2000</td><td>Crison Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>浸透圧計 Advanced micro Osmometer 3300</td><td>Norwood</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer assisted sperm analysis system</td><td>Projectes y Serveis R+D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡 MZ 95</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エピ蛍光光学系 Eclipse Te300</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点アシスタント 4.02 ソフトウェア</td><td>Bio-Rad</td><td>3D 解析ソフトウェア</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropippetes (P2.P20、P200、P1000)</td><td>ギルソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブVWR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVイルミネーター</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR サーマルサイクラー Primus 96 Plus</td><td>MWG AG Biotech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

バンドウイルカ イルカ (バンドウイルカ) 精子: 異種には体外受精、凍結保存、コレクション

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

精子凍結保存イルカの使用する水生公園間の遺伝物質の交換が容易になります、精子を海洋哺乳類生殖の理解を深める研究所にアクセス可能になります。異種体外受精、相同の体外受精のための取り替えは、精子の受精能力のポテンシャルをテストする手段を提供できます。研究配偶子生理・初期胚の開発;貴重なイルカ卵子を得ることが困難であるの使用を避けること。ここでは、イルカの精子を凍結して正常に使用されているプロトコルを提案する.精液の採取は、訓練を受けたイルカの手動刺激によって実行されます。凍結は、グリセロールとトリス卵黄ベースのエクステンダーを使用して行われます。さらに、イルカの精子と卵子を使用して異種の体外受精について説明し、PCR を使用して作成された胚のハイブリッドな性格を検証するプロトコルを提案する.異種受精受精に疑問し、配偶子の生理学と初期胚発生を研究するツールとして使用することができます。また、異種の体外受精の成功は、イルカ精子の受精能力は、さらに検討の価値があるをテストするこの技術の可能性を示します。

すべての結果、テーブルとここで紹介する数字 (1 と 2) は、許可3で再現されました。
イルカ精子凍結融解後高運動性があります。
イルカの凍結・融解後の射精は、84.5 ± 5.3 合計運動と 69.1 ± 5.1 進歩的な運動精子の割合 (% ± SD) を示した。運動面ではこれらの数字は高品質凍結保存精子の代表です。
イルカの精子は地中ソーナそのままウシ卵母細胞の生産の雑種胚が可能です。
図 1 aと表...

ここでは、イルカの精子コレクション、凍結、卵子を使用して異種の体外受精パフォーマンスに正常に使用されているプロトコルを提案する.

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

本手法の全体的な目的は、凍結保存されたイルカ精子と透明帯が保持されたウシ卵母細胞を用いた異種間体外受精により、凍結保存イルカ精子の機能を評価することです。本ビデオでは、イルカ精子の採取、評価、および凍結保存の方法を説明します。その後、精子の相互作用および透明帯までの浸入能を評価します。雄性前核の形成とハイブリッド胚の卵割。生殖補助医療の開発における重要な課題の一つは、精子の機能評価であり、これは受精能によって最も適切に示されます。精子機能の評価には一般的に同種間IVF技術が用いられますが、イルカの卵母細胞を得ることは非常に困難です。異種間体外受精の主な利点は、その簡便さにあります。ウシの卵母細胞は容易に入手可能であり、十分に検証されたプロトコルを用いて体外で処理することができます。また、液体窒素蒸気を用いたイルカ精子の凍結保存方法についても実演します。高度に専門的な冷凍設備を必要としない簡便な手法です。本手順にあたり、雄のイルカには正の強化を用いて6か月間の事前トレーニングを行っておく必要があります。動物をプールの端付近で仰向けの状態にさせます。そこで、生殖溝の頭側領域を軽く圧迫してさまざまな触覚刺激を行い、陰茎の随意的な突出を促します。完全に勃起した後、陰茎の先端を滅菌容器に向けます。射精物は分析まで37 °Cで保持してください。必要に応じて、毎回新しいポリプロピレン製ガラス管を用いて、連続的な精液採取のための触覚刺激を繰り返します。採取後、精液を常に37 °Cに保持した状態で直ちに評価します。精液の容量、色、pH、および浸透圧を測定します。次に、10 µLのアリコートを用いて、血球計数器で精子濃度を測定します。射精液をスライドガラスに滴下し、37 °Cに加熱した顕微鏡ステージに設置します。コンピュータ解析システムを用いて、精子の運動能を評価します。必要に応じて、観察しやすくするために精子を授精培地で希釈します。次に、射精物の20 µL分注量を用い、エオシン・ニグロシン染色およびSpermacによる従来の手法で精子の生存率と形態を評価します。凍結保存を行う場合は、まず精子サンプルを遠心チューブに移します。次に、精子を250 Gで5分間遠心分離してペレット化します。その後、1.5% glycerolを含むtrace egg yolkベースのバッファーを用いて、5分間かけて精子サンプルを1:1にゆっくりと希釈します。最後に、サンプルを5°Cで1.5時間冷却します。1時間後、同じバッファーを用いて1:1の希釈を繰り返し、その後、精子懸濁液を5°Cで10分間保持します。次に、懸濁液を0.25 mLストローに充填し、ストローを熱封印します。ストローをラックに入れ、ラックを液体窒素の4.5 cm上に10分間吊り下げます。その後、ストローを液体窒素に浸して長期保存します。本プロトコルでは、採取後3時間以内に温生理食塩水で保存されたウシ卵巣を使用します。まず、卵巣を生理食塩水で3回洗浄することから始めてください。常に37 °Cに保持してください。次に、18ゲージの針とシリンジを用いて、2 mmから8 mmの卵胞をすべて吸引します。50 mLチューブに移し、卵細胞を15分間静置させます。次に上清を除去し、卵胞をPBSで再懸濁します。実体顕微鏡下で、90 mmディッシュを用いてCOCを回収します。細胞質が均質で、少なくとも3層の卵丘細胞に囲まれているグレード1および2の卵母細胞を選別します。これらの卵母細胞を35 millimeterのディッシュ内のPBSに移します。次に、COCをPBSで3回、成熟培地で1回洗浄します。その後、1ウェルあたり50 COCと500 millilitersの成熟培地を4ウェルディッシュに分注し、COCを24時間インキュベートします。卵母細胞の周囲の帯状細胞（cumulous cells）が拡張すれば、成熟したことになります。その後、受精培地で2回洗浄し、1ウェルあたり250 millilitersの受精培地を入れた4ウェルディッシュに、50個ずつのグループに分けて移します。次に、COCを受精用インキュベーターに戻し、受精させるための精子の調製を行います。イルカ精子を含む凍結ストローとウシ精子を含むストローを、37 °Cの水槽で50秒間融解させます。次に、位相差顕微鏡を用いて精子の運動性を主観的に評価します。その後、精子サンプルを密度勾配チューブに移し、250 Gで10分間遠心分離します。上清を慎重に除去してください。洗浄液を3 mL加え戻します。その後、穏やかに混ぜ合わせて精子を再懸濁します。再度チューブを遠心分離し、上清の大部分を除去して、精子を300 µLの中に残します。次に、精子数を計測し、受精培地で希釈して濃度を1mLあたり200万個に調整します。卵子が入った各ウェルにこの懸濁液を250µL添加し、最終的な精子濃度を1mLあたり100万個にします。実体顕微鏡下で、拡張した成熟卵子が、運動性のあるウシまたはイルカの精子に囲まれていることを観察します。なお、イルカの精子はウシの精子よりも小さいです。配偶子を18時間共培養します。透明帯と精子の相互作用を評価するため、共培養開始から2.5時間後に、ディッシュから卵母細胞を20個取り出します。口径の狭いパステールピペットで激しくピペッティングし、緩く付着している精子を除去します。次に、oocytesを固定し、3342を用いて染色します。染色したoocytesを個別に2 µLのマウンティングメディア液滴に移し、位相差顕微鏡を用いてoocytesに付着したspermatozoaの数を数えます。共培養開始から18時間後、10個の推定zygotesを2 mLのPBSを含む15 mL遠心チューブに移し、3分間緩やかにボルテックスしてcumulous cellsを除去します。PBSで2回洗浄し、既述の方法で固定および染色を行う。さらに、共培養18時間後に50個の接合子を回収して培養に供する。これらをPBS中で3分間ボルテックスし、その後PBSで2回洗浄する。洗浄後、細胞質が均一な接合子を選択して培養に使用します。これらを25個ずつのグループに分け、5%胎児血清を添加した合成卵管液の25 microliterドロップに移します。その後、接合子候補を48時間培養し、実体顕微鏡を用いて分裂率を評価します。その後、テキストのプロトコルに従い、PCRを用いてそれらの遺伝的構成をさらに評価します。凍結融解したイルカ射精物の精子は、約85%が運動性を有し、70%が前進運動性を示しました。これらの数値は、高品質に凍結保存された精子を代表するものです。イルカの精子は、ウシの透明帯と2.5時間共培養した後、ウシの精子よりも高い割合で付着しました。イルカの精子は、無傷のウシ卵母細胞の透明帯を貫通することができ、その結果、前核形成および分裂が認められました。異種間体外受精群において、多精子受精は観察されませんでした。前核形成は24時間後に最高の割合に達しました。前核形成は同種群においてより迅速に進行しました。48時間後の卵割率は、同種受精よりも異種受精において低くなりました。PCRにより、ハイブリッド胚中にイルカの遺伝物質が存在することが確認されました。190 bpの産物を生成するイルカの18sリボソーム遺伝子に対するプライマーを用いて試験を行いました。レーン1から30はイルカ・ウシハイブリッドです。コントロールとして、SレーンにはイルカのDNAを、Cレーンには2細胞期のウシ胚を用いました。自家体外受精について提示したプロトコルにより、ハンドウイルカが正常なウシ卵子を受精させ、ハイブリッド胚を形成させることが可能であることが示されました。本手法をさらに発展させ最適化することで、イルカ精子の機能評価が容易になります。液体窒素蒸気を用いたイルカ精子の凍結保存は、安価で迅速かつ簡便な方法であり、良好な前進運動能パラメータが得られ、異種間体外受精を成功させることが可能です。イルカ精子がウシ卵母細胞を受精させることができるという知見は、イルカおよびその他の海洋動物の生殖に関する研究に新たな領域を切り拓くものです。また、未だに多くが解明されていない受精のメカニズムについても疑問を投げかけています。

bottlenose-dolphin-tursiops-truncatus-spermatozoa-collection

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオ、記事では、高解凍後の生存率とハムスターの卵母細胞を収集し、凍結保存する方法についてステップバイステップのデモンストレーションを提示する。同じ手順でもうまく着床前の発達の異なる段階でマウスの胚を凍結融解に適用することができます。...

コレクションとハムスターの卵母細胞とマウス胚の凍結保存

これは、ゼブラフィッシュのためのハイスループット精子の凍結保存プロトコルです。精子は、このプロトコルを使用すると、その後の体外受精で25％の肥沃度の平均値を持ち、長年にわたって安定な凍結保存。...

ゼブラフィッシュ精子の凍結保存用ハイスループット法とインビトロ受精

マウスの胚のエチレングリコールベースの​​ガラス化法が説明されています。それは、そのシンプルさと低胚毒性の他の方法に有利であるため、近交系や遺伝子改変マウスを含むマウスの多くの株、に広く適用することができます。...

エチレングリコール系ガラス化によるマウス胚の凍結保存

ここでは、マウス精子の凍結保存のための新開発のI•クライオキットを示しています。凍結融解精子を持つ二細胞期胚の開発は、このキットの使用で5マウス系統で一貫して改善された。...

I ·クライオキットを使用してマウスの精子の凍結保存と回復

ゼブラフィッシュは、高等脊椎動物との遺伝的類似性から、発生生物学およびヒト疾患研究のための強力なモデルシステムです。このプロトコルは、初期胚形成に不可欠な遺伝子の劣性突然変異を特定するためのフォワードスクリーニング戦略に利用できる一倍体ゼブラフィッシュ胚を作成する方法論を説明しています。...

半数ゼブラフィッシュ胚の生成により<em&gt;体外</em&gt;受精

倍数性操作のための修正されたプロトコルは、初期胚に細胞質分裂における1サイクルのストールを誘導するために熱ショックを使用しています。このプロトコルは、ゼブラフィッシュで実証されているが、他の種にも適用可能です。...

熱ショック2処理とゼブラフィッシュ胚の倍数性マニピュレーション

本研究の主な目的は、針を合わせて全体のゼブラフィッシュ精巣を凍結保存するガラス (NIV) の手順を浸漬でした。さらに、5...

全体の睾丸針によるゼブラフィッシュを精原細胞の凍結保存に超急速冷却浸漬

この議定書は、精子のコンピューター支援型分析を使用して、デバイスを冷却魚精子評価の手順を説明します。ソフトウェアは、迅速、正確なと養殖業の再生の成功を改善するために便利なツールをすることができます、精子運動に基づく魚の精子の質の定量分析を与えます。...

魚の精子の評価ソフトウェアを使用して、冷却装置

ヨーロッパのウナギの成熟と精子の凍結保存のためのプロトコルは、最後の年にわたって改善されています。この資料では、成熟と保護剤の検討としてメタノールを誘発するひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG)...

処理と治療の男性欧州ウナギ (アンギラ) ホルモンの成熟、精子凍結保存

このプロトコルは、遺伝的多様性を確保し、サンゴ礁の回復努力を支援することを目的として、絶滅の危機に瀕しているサンゴ種からの精子の処理と凍結保存の効率と能力を改善するための半自動化された経路を説明しています。...

バイオバンキングと水産養殖をサポートするためのサンゴ精子の凍結保存のための半自動ワークフロー

このプロトコルは、凍結保存された馬の精液から生存可能な体細胞(SC)を分離するための簡単なマイクロ吸引技術を提示します。従来の手法とは異なり、この技術は長時間 のin vitro...

クローン作成のための核ドナーとして、クローンのためにクローンを行うクライオ保存馬の精液から体細胞を分離するための簡易微小吸引技術

学ぶバンドウイルカ精子の採取・凍結保存・異種体外受精プロトコル。牛卵を用いて凍結精子の機能を評価し、海洋哺乳類の生殖技術と保全に貢献する方法を解説します。

バンドウイルカイルカ (バンドウイルカ) 精子: 異種には体外受精、凍結保存、コレクション

さらに動画を探す

バンドウイルカ イルカ (バンドウイルカ) 精子: 異種には体外受精、凍結保存、コレクション

さらに動画を探す

バンドウイルカイルカ (バンドウイルカ) 精子: 異種には体外受精、凍結保存、コレクション