Name: 真菌による迅速な欠失生産アグロバクテリウム OSCAR削除コンストラクトの仲介された変換 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 学ぶOSCAR法による真菌の遺伝子欠失変異体作製とアグロバクテリウム介在変換技術。高速なプラスミド構築と相同組換えを活用し、病原性関連遺伝子機能の解明に貢献します。

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著者らは、 Fusarium v​​erticillioiodesの OSCAR突然変異体を作製するために、Anjellica Miller、Athar Naseer、Xiu Lin、Katelyn Woodburry、Chelsea Patterson、Kathleen Robertson、Krystina Bradley、Ashton Rogers、Alexis McKensie、Manny Hernandez 、Ashli​​ Crepsac、Jeff Delong、Christian King、Gi Jeong、Maria Belding、Christy Burre、Daniel O&#39;Meara、Lauren（Victoria）Cook、Jake Goodman、Sampriti De、Oge Okoye、Alyssa Beckstead、Garrett Hibbs、Nick Goldstein、Caroline Twum 、Chris Benson、Louis Stokes、Hannah Itell、Jane Hulse、Jasim Mohammed、James Loggins、Kelli Russell、Gre&#39;Nisha Jones、Kristin Sheaffer、Mariam Hammady、Ava Wilson、カトリーナ・バズモア、トニー・ハーパー、カリン・マクギー、モハメド・モミン、リマ・モミンThi Ngoc Le、Angel Phamなどがあります。

1.遺伝子側面のPCR増幅のためのプライマー設計<ol><li>オープンリーディングフレーム（ORF）を含む目的遺伝子（GOI）のゲノム領域と、FungiDBまたは他のゲノムデータリソースから両側に遺伝子を隣接する少なくとも2kbをワードプロセッシングファイルにダウンロードする。 </li><li>削除するORFを強調表示し、コドンの開始と停止をラベルします。 </li><li>ダウンロードしたシーケンス内の隣接するORFを特定し強調表示します。 </li><li> GOI ORFの2kb 5 &#39;末端とプライマー設計ツール（材料リストを参照）を使用して、PCRプライマー対O1およびO2を設計して、1kbの最小サイズ産物を生成する。隣接するORFには影響しないように注意してください。 <ol><li> 2kbの5 &#39;側面を「Sequence Entry」ウィンドウに貼り付けます。 [Show Custom Parameters]ボックスをクリックします。プライマーTM 58（min）、60（opt）および62（max）のカスタムデザインパラメータを入力します。プライマーGC40（min）、50（opt）および60（max）。プライマーサイズ22（分）、24（オプト）および26（最大）; Ampliconサイズ1250（分）、1500（オプト）および2000（最大）。 </li><li> ORFに最も近いリバースプライマー（O2）を配置する結果を選択します。アッセイのスクリーンショットをキャプチャし、プライマー配列をコピーしてワードプロセシング文書に貼り付ける。 </li><li>プライマーO3およびO4を生成するために3 &#39;側部のためのプロセスを繰り返すが、今回は標的ORFに最も近いフォワードプライマー（O3）を配置する結果を選択する。 </li></ol></li><li>プライマー1〜4の5 &#39;末端に適切な付加部位を付加する（ 表1参照）。 </li><li>また、以下のセクション4の削除確認に使用するORF特異的プライマーを設計し、発注する。パラメータは、必要に応じてAmplicon Size 500（min）、750（opt）、1000（max）のORFの長さを調整する以外は、手順1.4.1と同じにする必要があります。最後に、相同組換え体の確認のために、染色体内の側面のすぐ外側にあるプライマーを5 &#39;および3&#39;に生成する。これらの「アウト」プライマーは、hygR（210）およびhygF（850）と比較した（ 図2 ）。 </li><li>プライマーを注文する。 </li></ol> 2. OSCARコンストラクトの生産<ol><li>高忠実度のTaqを使用して、1つの反応でプライマー（100μM）O1およびO2を使用し、第2の反応でプライマーO3およびO4を使用して、5 &#39;および3&#39;側面にそれぞれ1つずつ、2つの反応を実施する。反応混合物は、29.5μLの滅菌蒸留水（SDW）、5μLの10×LA PCR緩衝液、8μLの2.5mM dNTP混合物、5μLの25mM MgCl 2、1μLの鋳型（50ng /μL）忠実度Taq 、0.5μLのプライマーO1および0.5μLのプライマーO2を5 &#39;フランク（または0.5μLのプライマーO3および0.5μLのプライマーを3&#39;側面に使用）使用条件：94℃で1分間、次いで30サイクル30秒間、94℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で2分間、最後に72℃で5分間、その後、10℃で無期限に保持する。 </li><li> 0.8％を実行アガロース1×TAE（40mM TrisアセテートpH8.3,1mM EDTA）ゲル電気泳動を標準ミニゲル装置で約125Vhで行い、生成物のサイズおよび相対濃度を決定する。製造者の指示に従って非エチジウム染色でゲルをポストする。 UV照明で視覚化する。 </li><li> 5 &#39;および3&#39;フランク産物がほぼ均一濃度である場合、それらを組み合わせて、アフィニティーカラムキット（またはPEG沈殿物90μLの結合PCR産物、240μLのTE緩衝液pH7.5,160μLの30％ポリエチレングリコールPEG8000 30mM MgCl 2 ）PCR産物を製造業者のプロトコールに従って共精製する。それらが等濃度でなければ、低濃度生成物の全てを、より高い収率反応からの生成物の推定量と組み合わせる。 </li><li>分光光度計を使用して精製DNA濃度を測定する。 </li><li>以下のものを混合してBP反応を実施してください：1μLの60 ng /μLポスカール、2μL60 ng /μLpA-Hyg-OSCAR、1μLの60ng /μLの組合わせた側面、1μLのクロナーゼ。 25℃で16時間インキュベートする。 0.5μLのプロテイナーゼKを加えて反応を停止させ、37℃で10分間インキュベートする。 </li><li>高能力を変えるE。 コリ細胞。商業的に入手可能なコンピテント細胞および自家製DH5αCaCl2コンピテント細胞の両方を、製造者の説明書に記載されているようにレシピエントとして首尾よく使用した。 100μg/ mLスペクチノマイシン（Spec）を含有する低ナトリウム（0.5g / L NaCl）LB上のプレート。 </li><li>上で生成したコロニーのDNAミニプレップ10を実行することによって正しい構築物を同定する。 Hin dIIIおよびKpn Iで以下のように二重消化を行います：ピペット5μLDNA、各酵素2U、SDWを含む適切な10×バッファー2μL、総容量20μL。これにより、ベクター（ 約 7kb）から挿入物（約1.5kbの遺伝子側面を有する約4.5kb）が放出され、予測可能なバンドサイズを与えることができる側面。 </li><li>配列11は 、適切なバンディングパターンを示すクローンを選択する。 </li></ol>真菌のアグロバクテリウム・ ツメファシエンス媒介形質転換（ATMT） <ol><li> OSCAR欠失構築物12を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス株AGL1を形質転換する。 </li><li> GOI OSCAR欠失プラスミドを含むAGL1で真菌を形質転換する。これを実行するには、以下の手順を実行します。 <ol><li> 2×10 6胞子/ mLの滅菌水で真菌胞子懸濁液を調製する。血球計または自動セルカウンターで胞子を定量する。これを500 mLの1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。このセットアップは、4つの変換プレート用です。 </li><li> 2〜3日齢のLB-Spec 100培地からAGL1を含む欠失プラスミドの容易に目に見えるゴブ（ループ直径の約20％を覆うべきである）を加えるために青色の無菌使い捨てループを使用する（Materials List for composition）プレートを含み、胞子懸濁液に混合する。細菌細胞がよく分散するまでボルテックスする（ 約 5分間の中速）。 </li><li> 100μLの分生子 - アグロ懸濁液を、共培養培地12を含む4つの6cmペトリ皿のそれぞれに置かれたセルロースメンブランフィルターの中心にピペットで移す。 </li><li>懸濁液を滅菌ガラスビーズ（約4）で広げて、膜フィルターの全表面を覆う。あるいは、伝統的なスプレッダーツールを使用してサスペンションを広げます。膜フィルターをフード内で約10分間乾燥させ、パラフィンフィルムで包みます。手順3.2.2と3.2.3を繰り返して、複数の変換を設定します。 </li><li>プレートを室温で2日間インキュベートし、逆さにする。 </li><li>ハイグロマイシンB（Hyg）150μg/ mL、200mMセフォタキシムおよび100μg/ mLを含有する6cm アスペルギルス選択培地12プレートに膜フィルターを移す。モキサラクタム。 Hyg耐性コロニーを単離する前に、室温で5〜7日間インキュベートする。 </li><li>滅菌したつまようじを用いて、150μg/ mL Hyg、100μg/ mLカナマイシンを含む6 cm Potato Dextrose Agar（PDA）プレートに推定形質転換体を移す。 </li></ol></li></ol> 4. PCRによる欠失変異体の同定<ol><li> 熱分解により形質転換体からPCRのためのDNAを抽出する13 。 <ol><li>形質転換体がステップ3.2.7のPDA上にコロニーを形成したら、滅菌した爪楊枝を用いて少量（2mm×2mm）の菌糸または酵母細胞をコロニーから100μLの溶解溶液（50mMリン酸ナトリウム、pH 7.4mM、1mM EDTA、5％グリセロール）を微量遠心チューブ中に添加した。 </li><li>混合物を85〜90℃で20〜30分間インキュベートする。ステップ4.2で使用するまで、ゲノムDNAを含む粗抽出物を-20℃で保存する。 </li></ol></li><li>形質転換体あたり4回のPCR反応を行い、それぞれをd選択マーカー（この場合、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）のためのものとGOI ORFのためのものとのそれぞれの5 &#39;および3&#39;側面の相同組換えを示す。 注：これらの反応には、安価な低忠実度Taqを使用します。反応条件は上記の2.1に記載の通りであり、SDW20μL、10×Taq緩衝液2.5μL、dNTPS（10mM）0.5μL、自家製Taq14,0.5μL、プライマーA（100μM）0.5μL、プライマーB（100μM ）0.5μL、テンプレート0.5μL。より低い濃度のプライマーストック（10μM）も同様に良好に使用することができる。 </li><li> PCR産物のアガロースゲル（ 例えば、 0.8％）を流す。欠損突然変異体は、Hygバンドを産生するが、ORF産物は産生しない。異所的組込み体は両方のバンドを示す。野生型では、ORFバンドのみが生成されます。 </li><li>将来の使用のために、欠失突然変異体（および異所形質転換体または対照用の2つ）を永久保存する。 注：15％グリセロールを使用して我々の株は-80℃で長期間耐えられました。 </li></ol>

<ol><li>Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+construction+of+Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids+%28OSCAR%29%2C+an+efficient+and+robust+tool+for+ATMT+based+gene+deletion+construction+in+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi.</a> Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).</li>
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</ol>

著者は何も開示することはない。

アグロバクテリウムのワンステップ構築 - 絶滅のおそれのあるプラスミド（OSCAR）は、漸増する麹菌（Ascomycota fungi）の使用に成功しました。この方法はまた、 アグロバクテリウム媒介形質転換および相同組換えが可能であると仮定して、担子菌および他の真菌門由来の種（選択マーカー遺伝子を駆動する適切なプロモーターを有する）にも容易に適用可能であるべきである。抗真菌化合物の選択肢を多様化するとともに、二重および高次の変異体の産生を可能にするために、さらなるマーカーベクターが作製されている。これらには、G418、ノーセオスリシン、そして最近除草剤グルホシネートアンモニウムおよびクロリムロンエチル4に対する耐性が含まれる。 この方法はVerticillium dahliaeでの使用のために考案されたもので、ここに示した画像は主に1である。最近では、OSCARは削除に広く使用されていますマイコトキシン生成菌...

遺伝的切開は、個々の遺伝子または遺伝子の組み合わせの機能的重要性を決定するための強力な方法論である。特定の遺伝子の役割を理解するための標準的なアプローチは、他のどの遺伝子でも改変されていない単一の遺伝子変異体の産生である。最も強力で潜在的に混乱を招くアプローチは、他の遺伝子機能を損なうことなく、関心対象のオープンリーディングフレーム（GOI ORF）の遺伝子を完全かつ正確に欠失させることである。 欠失プラスミド生成のための標準ライゲーションアプローチは複数のステップを必要とするので、OSCAR1の合理的な方がより迅速なインビトロアプローチを生成することであった。 図1は、OSCARアプローチにおけるアセンブリプロセスを示しています。本明細書に記載されている方法は、単一のマルチパート反応における個々の遺伝子欠失ベクターの迅速な構築と、その後のアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介トランスフェクションrmation（ATMT）。 OSCARは非常に迅速であり、酵母2におけるギブソンアセンブリの使用などの他の戦略とよく比較される。 OSCAR法は、いくつかの胞子嚢腫種（Ascomycota species ofcungi）と共に首尾よく使用されている。これらの種には以下のものが含まれる： Fusarium v​​erticillioides （未発表）、 Verticillium dahliae 3 、Setophaeria turcica 4 、Metarhizium robertsii 5 、Fusarium oxysporum f。 sp。 vasinfectum 6 、Pestalotiopsis microspora 7 、Colletotrichum higginsianum 8 およびDothistroma septosporum 9およびSarocladium zeae （未公開）が含まれる。 このプロトコールは、プライマー設計、フランクPCR増幅、OSCAR BP反応、欠失構築物構造確認、形質転換を含む方法のための段階的な指示を提供するアグロバクテリウムのアグロバクテリウムイオンをコンストラクトと接触させ、続いて欠損構築物を真菌細胞にATMTベースで移し、最後に真菌の欠失突然変異体を異所的に組み込まれた欠失構築物と区別する。

<table><tbody><tr><td>FungiDB</td><td></td><td></td><td>データベース/ http://fungidb.org/fungidb/</td></tr> <tr><td>IDTプライマークエストIDT</td><td></td><td></td><td>プライマーデザインオンラインソフトウェア/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</td></tr><tr><td>Microsoft Word</td><td></td><td></td><td>シーケンスファイル操作</td></tr><tr><td>低Na LBスペック100ミディアム</td><td></td><td></td><td>大腸菌</E>M形質転換体選択、組成:1%トリプトン、0.05%NaCl、0.5%酵母抽出物、1.5%寒天培地の場合、固体培</td></tr><tr><td>地共栽培培地</td><td></td><td></td><td>ATMT形質転換誘導(参考文献12)</td></tr><tr><td>アスペルギルス最小培地ハイグロマイシン</td><td></td><td></td><td>真菌形質転換体選択</td></tr><tr><td>PDA培地</td><td>Acumedia</td><td>7149A</td><td>単一胞子傾斜チューブ</td></tr><tr><td>PDA-Hyg-Kan中</td><td></td><td></td><td>型真菌剤のランスフォルマント分離、PDAは150 &mu;g/mL ハイグロマイシン B および 100 &mu;g/mL カナマイシン</td></tr><tr><td>ガラスビーズ</td><td>Genlantis</td><td>C400100</td><td>プレートスプレッド</td></tr><tr><td>ニトロセルロースフィルター (47 mm)</td><td>Fisher</td><td>09-719-555</td><td>ATMT の共培養</td></tr><tr><td>各種センチフュージチューブ</td><td></td><td></td><td>複数の準備</td></tr><tr><td>ペトリプレート (各種)</td><td></td><td></td><td>細菌と真菌の培養</td></tr><tr><td>pA-Hyg OSCAR</td><td>Addgene</td><td>29640</td><td>選択可能なマーカー</td></tr><tr><td>ベクターpOSCAR</td><td>Addgene</td><td>29639</td><td>アセンブリ</td></tr><tr><td>ベクターDH5&#945;ワンショットコンピテント大腸菌cells</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>12297-016</td><td>BP反応変換</td></tr><tr><td>ccdB生存大腸菌細胞</td>ライフ<td>テクノロジー&nbsp;</td><td>A10460</td><td>pOSCARのメンテナンス</td></tr><tr><td>木製転写スティック</td><td></td><td></td><td>コロニーストリーキング</td></tr><tr><td>つまようじ</td><td></td><td></td><td>コロニーピッキング</td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td></td><td></td><td>ペレット化 バクテリア、etc.</td></tr><tr><td>Preparative 遠心分離機</td><td></td><td></td><td>真菌胞子採取</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td></td><td></td><td>シングル胞子の分離</td></tr><tr><td>自動細胞カウンター</td><td></td><td></td><td>胞子懸濁液計算</td></tr><tr><td>化合物顕微鏡</td><td></td><td></td><td>血球計算盤 細胞計数</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR 遺伝子側面タンパク質精製</td></tr><tr><td>TaKaRa LA Taq&nbsp;</td><td>Takara Bio</td><td>USA RR002A</td><td>Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg-5</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma</td><td>22189-32-8</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxime</td><td>TCI America</td><td>C2224</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td></td><td>11815032</td><td></td></tr><tr><td>Moxalactam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43963</td><td></td></tr><tr><td>ゲルレッド</td><td>&nbsp;Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>染色後アガロースゲル</td></tr><tr><td>Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat.No.28104)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(OneShot_ Mach1TM T1RまたはOne Shot_ OmniMAX&trade; Invitrogen製2 T1R)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C862003</td><td></td></tr><tr><td>ゲートウェイ BP Clonase II 酵素ミックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11789020</td><td>pOSAR で欠失コンストラクトを組み立てるために使用</td></tr></tbody></table>

真菌による迅速な欠失生産<em&gt;アグロバクテリウム</em&gt; oscar削除コンストラクトの仲介された変換

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

残りのゲノムを変えずに目的の遺伝子を正確に欠失させることは、生物における特定の遺伝子の機能を決定するための理想的な産物を提供する。このプロトコルでは、正確で迅速な欠失プラスミド構築のOSCAR法が記載されている。 OSCARは、目的の遺伝子の精製されたPCR増幅5 &#39;および3&#39;側面および2つのプラスミド、pA-Hyg OSCAR（マーカーベクター）およびpOSCAR（組立体）を含む単一のリコンビナーゼ反応が行われるクローニングシステムに依存するベクター）。正しく組み立てられた欠失ベクターの確認は、制限消化マッピングとそれに続く配列決定によって行われる。 次いで、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いて、欠損構築物の真菌胞子への導入を仲介する（ATMTと呼ばれる）。最後に、相同組換えまたは非相同組換えによって組み込まれた欠失構築物が遺伝子欠失を示しているかどうかを決定するためのPCRアッセイが記載されている異所性の統合である。このアプローチは、 Verticillium dahliaeおよび他の種の中のFusarium v​​erticillioidesにおける多数の遺伝子の欠失に首尾よく用いられている。

OSCAR法は、単一の反応で、選択マーカーカセットを取り囲む、欠失される標的遺伝子の側面を含むプラスミドを生成する。 OSCARを使用した削除構造の作成は非常に効率的です。しかしながら、この系は、3つの断片のすべてではなく一部を含む部分的な構築物（2つの遺伝子の側面および選択マーカー）を産生することができる。一般に、 大腸菌形質転換体の大部分は正しいOSCAR構築物を含む。例えば、 図2は、 Verticillium dahliae遺伝子VDAG_06812のOSCAR欠失構築物を示す。この場合、VDAG_06812の側面にはHindIIIまたはKpnI部位が欠けており、したがって4,247bpのプラスミド挿入物が放出されるはずである。 図3は、異常な構造を示すレーン5および11を除いて、正しいプラスミド構造のHindIII- KpnI制限酵素二重消化確認を示すts。 図4は、サザンブロットによる2つの異なる遺伝子欠...

相同組換えにより生成された遺伝子欠失突然変異体は、遺伝子機能研究のゴールドスタンダードである。削除構築物の迅速な生成のためのOSCAR（アグロバクテリウム - 組換え準備プラスミドのワンステップ構築）法が記載されている。 アグロバクテリウム媒介真菌形質転換が続く。最後に、真菌形質転換体における遺伝子欠失のPCRに基づく確認方法を提示する。

真菌による迅速な欠失生産<em&gt;アグロバクテリウム</em&gt; OSCAR削除コンストラクトの仲介された変換

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

この手順の全体的な目的は、真菌において精密な遺伝子欠損変異株を作製することです。この手法は、特定の目的遺伝子が真菌の病原性にどのような役割を果たすかなど、真菌の機能遺伝学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、精密な欠損を導入するためのプラスミドを非常に迅速に構築できることです。本手法を用いることで、効率的な相同組換えシステムを持つあらゆる真菌に関する知見を得ることが可能です。また、原生生物や線虫の細胞など、他のシステムへ応用できる可能性もあります。我々がこの手法を考案したのは、Oscarに関連し、アグロバクテリウム経由ではなくプロトプラスト形質転換に用いられるDelsGateシステムを開発した時でした。この手法には最適化されたステップや直感に反するステップが数多く含まれているため、視覚的な実演が不可欠です。手順の実演は、My Laboratoryの技術者であるNicole Crenshawが行います。このプライマー設計戦略では、目的遺伝子のオープンリーディングフレームを含むゲノム領域と、遺伝子の両側に少なくとも2 kilobaseの隣接領域を含むワードプロセッサファイルが必要です。まず、欠損させる予定のオープンリーディングフレーム（ORF）をハイライトし、開始コドンと終止コドンをラベル付けします。ダウンロードした配列内で、隣接するオープンリーディングフレームを特定し、ハイライトします。次に、プライマー設計ツールを用いて、目的遺伝子のオープンリーディングフレームの5'側フランキング領域に対するPCRプライマーを設計します。目的遺伝子のオープンリーディングフレームの5'側2kbを用いて、最小サイズ1kbの産物を生成するためのPCRプライマーペアO1およびO2を設計します。リバースプライマーO2がオープンリーディングフレームに最も近くなる結果を選択してください。その際、隣接するオープンリーディングフレームに影響が出ないように注意してください。アッセイのスクリーンショットを撮り、プライマー配列をワードプロセッサのドキュメントにコピー＆ペーストします。3つのプライムフランクに対して同様の操作を繰り返し、プライマーO3およびO4を生成した後、4種類すべてのプライマーの5つのプライマンドに適切なアタッチサイトを追加します。最後に、テキストプロトコルの指示に従い、欠損の確認および相同組換えの確認に使用するプライマーを設計します。本手順は、5'側フランカーおよび3'側フランカーの2つのPCR反応を設定することから開始します。両方の反応ミックスに、滅菌蒸留水 29.5 µL、10x LA PCR buffer 5 µL、2.5 mM dNTP mix 8 µL、25 mM 塩化マグネシウム 5 µL、テンプレート 1 µL、および hi-fidelity Taq 0.5 µLを加えます。5'側フランカーの反応には、Primer O1 0.5 µLとPrimer O2 0.5 µLを加えます。3'側フランカーの反応には、Primer O3 0.5 µLとPrimer O4 0.5 µLを加えます。以下の反応条件下でPCRを行います：94 °Cで1分間、続いて「94 °Cで30秒、60 °Cで30秒、72 °Cで2分」を30サイクル、最終ステップとして72 °Cで5分間加熱し、その後10 °Cで静置します。産物のサイズと相対的な濃度を決定するために、標準的なミニゲル電気泳動装置を用い、1x TLEの0.8%アガロースゲルで PCR 産物を約 125 volt hours 電気泳動します。メーカーの指示に従って非エチジウム染色剤でゲルを後染色し、UVイルミネーターで可視化します。5'末端側および 3'末端側のフラグメントがほぼ同等の濃度であれば、それらを混合します。濃度が等しくない場合は、低濃度の産物を、高収率反応で得られた概算で同量の産物と混合します。メーカーのプロトコルに従い、infinity column kitを使用してPCR産物を共精製します。次に、アセンブリベクター1 µL、マーカーベクター2 µL、混合フランク1 µL、およびクローナーゼ1 µLを混合し、BPクローナーゼ反応を行います。25 °Cで16時間インキュベートします。0.5 µLのProteinase Kを添加し、37 °Cで10分間インキュベートして反応を停止させます。BP反応物をE.coli細胞に形質転換し、テキストプロトコルに従ってDNAを単離した後、HindIIIとKpnIによるダブルダイジェストを行い、正しいコンストラクトを同定します。ダブルダイジェスティングシーケンシングによってOSCAR欠損コンストラクトを同定した後、このコンストラクトをアグロバクテリウム tumefaciens 菌株AGL1に形質転換します。次のステップは、OSCAR欠損コンストラクトを含むAGL1を真菌に形質転換することです。まず、滅菌水を用いて、1 mLあたり2 × 10⁶個の胞子を含む真菌胞子懸濁液を調製します。胞子を希釈した後、真菌胞子懸濁液 500 µL を 1.5 mL マイクロ遠心チューブに入れます。滅菌済みの青色使い捨てループを用いて、AGL1 を含む欠損プラスミドの目に見える程度の塊を胞子懸濁液に加えます。細菌細胞が十分に分散するまでボルテックスミキサーで攪拌します。共培養培地を入れた4枚の6 cmペトリ皿に、それぞれセルロース膜フィルターを配置し、各皿に滅菌済みのガラスビーズを約4個加えます。分生子懸濁液100 µLを各膜フィルターの中央にピペットで滴下し、ビーズを用いて懸濁液を広げ、膜フィルターの全表面を覆います。ビーズを取り除いた後、クリーンベンチ内で膜フィルターを約10分間乾燥させ、その後、ペトリ皿をパラフィンフィルムで密封します。ディッシュを倒置し、室温で2日間インキュベートします。2日後、各メンブレンフィルターを、Hygromycin Bおよびkanamycinを含む6 cmのasper gel選択培地プレートに移します。室温で5〜8日間インキュベートします。ハイグロマイシン耐性コロニーを単離するため、滅菌した爪楊枝を用いて、ハイグロマイシンおよびカナマイシンを含む6 cmのポテトデキストロース寒天培地に推定形質転換体を移します。プレートを室温で培養します。形質転換体がプレート上でコロニーを形成したら、滅菌した爪楊枝を用いてコロニーから少量の菌糸または酵母細胞を採取し、マイクロ遠心チューブ内の100 µLの溶解液に移します。混合物を85〜90°Cで20〜30分間インキュベートします。ゲノムDNAを含む粗抽出液は、PCRを行うまで-20°Cで保存します。欠損変異体を特定するために、まず各形質転換体について、目的遺伝子のオープンリーディングフレームおよび選択マーカーを検出するためのPCRを行います。OSCAR構築物の作製には、同様の反応条件を用いてください。単一胞子の分離および熱溶解後、オープンリーディングフレームとHygromycinのPCR、ならびに5'末端および3'末端フランキング領域の相同組換えを検出するためのPCRを繰り返します。その後、PCR産物のアガロースゲル電気泳動を行います。OSCAR法では、選択マーカー遺伝子を含み、その両側に欠損させる標的遺伝子（本例ではVerticillium dahliae遺伝子）の隣接領域を配したプラスミドを構築します。ダブルダイジェスト（二重消化）を行った際、本例では4,247 bpのインサートが放出されることで、レーン5と11を除くすべてのレーンでプラスミド構造が正しく構築されていることが確認されます。欠損の確認にはPCR法を用います。この例では、5つのFusarium verticillioides形質転換体の解析を示しています。上のゲルにおいて、レーン2から6は5'側フランキング領域の増幅産物であり、レーン7から11はオープンリーディングフレームの増幅産物です。下のゲルにおいて、レーン2から6は選択マーカー遺伝子の増幅産物であり、レーン7から11は3'側フランキング領域の増幅産物です。5'側フランカー、3'側フランカー、および選択マーカー遺伝子の増幅産物にバンドが存在し、オープンリーディングフレームの増幅産物にバンドが存在しないことから、系統1131、1132、および1133が欠損形質転換体であることが確認されました。オープンリーディングフレームおよび選択マーカー遺伝子の増幅産物にバンドが存在し、5'側フランカーおよび3'側フランカーの増幅産物にバンドが存在しないことは、系統1134および1135が異所的形質転換体であることを示しています。遺伝子欠損はサザンブロット法によっても確認可能です。この手法を習得すれば、シーケンシング時間を除いて2日間で、真菌の形質転換に使用可能なOscar欠損プラスミドを作製できます。本手順を行う際は、ハイフィデリティTaqを用いた予備操作を行うこと、および隣接する遺伝子に影響が出ないことを確認することが重要です。本手順の後、特定のプロセス（薬剤感受性や耐性など）において遺伝子が重要であるかといった追加の疑問を解決するために、変異体の表現型を試験する他の手法を実施することが可能です。アグロバクテリアや真菌などの生 organisms を扱うことは、特に免疫不全の方にとって危険である可能性があることに注意してください。また、本手順においては、取り扱い後の手洗いなどの予防措置を常に講じる必要があります。

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JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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学ぶOSCAR法による真菌の遺伝子欠失変異体作製とアグロバクテリウム介在変換技術。高速なプラスミド構築と相同組換えを活用し、病原性関連遺伝子機能の解明に貢献します。

真菌による迅速な欠失生産

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