ティッシュ・エンジニアリングと疾病調査に使用するための小児のヒト食道上皮細胞の条件付き再プログラミング

本手順の全体的な目的は、内視鏡生検から得られた患者由来の食道上皮細胞を増殖させ、食道疾患の研究を行うこと、または後続のモデリングや食道組織の置換に向けた3D食道スキャホールドを作成することです。この手法を用いることで、食道疾患における食道上皮細胞の役割をより深く理解することが可能になります。また、モデリングや移植のための3Dスキャホールドの作製にも活用できます。

この手法の利点は、遺伝的な改変や恒久的な処置を必要とせず、ごく少量の組織片から患者特異的な上皮細胞を生成できることです。この技術の意義は、好酸球性食道炎の病態生理の解明や、食道閉鎖症および好酸球性食道炎の治療法の開発にまで及びます。一般的に、この手法に不慣れな場合は、純度を維持するためにヒト食道上皮細胞を回収する前にフィーダー細胞を完全に除去することに苦労します。

この手法の実演を行うのは、当研究室の技術者であるChristopher Fosterです。患者サンプルを採取する少なくとも3日前に、組織処理済みT75フラスコに3T3培養培地を用いて3T3細胞を播種します。実験当日、サンプルを採取する直前に、1フラスコあたり5 millilitersの0.25%Trypsin-EDTAを用いて、37 degrees Celsiusで約5分間3T3細胞を剥離させます。

ほとんどの細胞が浮遊したら、3T3培地を5 milliliters加えて反応を停止させ、細胞懸濁液を15 milliliterのコニカルチューブに移して遠心分離します。ペレットを培地で再懸濁して細胞数をカウントします。その後、播種に必要な細胞数を15 milliliterのコニカルチューブに移します。

次に、新鮮な3T3培地25 millilitersを細胞に加え、3000 radsで照射します。その後、遠心分離により細胞を回収し、100 millimeterプレートあたり5 millilitersの条件付きプログラミング培地でペレットを再懸濁します。内視鏡検査時に約6箇所の食道生検組織を取得し、Primocinを添加した完全無血清角化細胞培地を含む15 milliliterコニカルチューブに入れ、氷上で保持します。

1つの生検検体を、氷上の緩衝ホルマリン5 mLに入れ、もう1つの生検検体を、包埋剤の入った小型生検用クライオモールドに入れます。直ちに、モールドを液体窒素容器内の氷またはペンタンが入ったビーカーに浸します。組織が凍結したら、クライオモールドを検体袋に入れ、ポリスチレンフォーム容器内のドライアイス上に置きます。

次に、生検検体の入ったチューブを密封可能な袋に入れ、バイオハザードラベルを貼付した輸送箱の中の濡れた氷と共に保管し、輸送用に両方の容器を密封してバイオハザードステッカーでラベルを貼ります。ラボに到着後、直ちに凍結生検検体を-80 °Cの保存庫に移し、後続の切片作成またはRNA抽出に備えます。サンプルをFormalinに入れ、4 °Cの冷蔵庫で一晩固定し、残りの生検検体は遠心分離機に入れます。

各チューブの培地を10 millilitersのdispase溶液に置換し、チューブを密閉して37 °Cのウォーターバスで15分間インキュベートします。インキュベーション終了後、生検試料を再度遠心分離し、5 millilitersの0.25% Trypsin-EDTAに再懸濁します。生検試料を1つの100 milliliter滅菌プレートに移し、2本の滅菌済みカミソリを用いて組織をできるだけ細かく微砕します。

組織の切断がすべて完了したら、組織片を新しい15 milliliterチューブに移し、プレートを0.05% Trypsin-EDTA 5 milliliterで2回洗浄します。洗浄液をチューブに回収し、サンプルを37 degree Celsiusのウォーターバスに戻します。10分後、消化したサンプル片とフィーダー細胞を遠心分離し、それぞれのペレットを5 milliliterの条件付きリプログラミング培地で再懸濁します。

次に、フィーダー細胞と食道生検サンプルの両方を1本のチューブに合わせ、ROCK阻害剤（rhoキナーゼ阻害剤）を添加し、ゼラチンコートした組織培養ディッシュで共培養します。約5日後、吸引によって培地と細切した生検片を除去し、5 mLの滅菌PBSでディッシュを2〜3回洗浄します。最後の洗浄後、ROCK阻害剤を添加した新鮮な培地10 mLをプレートに加え、細胞が70%コンフルエンスに達するまでインキュベーターに戻します。

細胞を拡張するため、37 °Cで0.05% Trypsin-EDTAを5 mL加え、2分30秒以内にフィーダー細胞を除去します。プレートを5 mLの新鮮なPBSで洗浄して浮遊したフィーダー細胞を取り除き、0.25% Trypsin-EDTAを5 mL加えて、生検サンプル細胞がプレート底面から剥離するまで5～10分間インキュベートします。その後、10 mLの新鮮な培地で反応を停止させ、細胞を50 mLコニカルチューブに移して遠心分離します。

ペレットを新鮮な条件付きリプログラミング培地で再懸濁して細胞数を計測し、1×10⁶個のヒト食道細胞を新しいコニカルチューブに分注します。この食道細胞に1.2×10⁶個の照射済み3T3細胞を加え、新鮮な条件付きリプログラミング培地を用いてチューブ内の全量を15 mLにします。その後、新鮮なROCK阻害剤を細胞に加え、共培養物をゼラチンコートした150 mmディッシュに播種します。

食道細胞を-80°Cで保存するために凍結させるには、先ほど示した方法でフィーダーを除去し、食道細胞を回収します。次に、遠心分離のために細胞を新しい50 mLコニカルチューブに移し、ペレットを凍結保存液2 mLあたり1×10⁶ cellsの濃度で再懸濁します。その後、あらかじめラベルを貼った各クライオバイアルに細胞懸濁液を2 mLずつ分注し、長期的な液体窒素保存に移す前に、少なくとも24時間は-80°Cで保存してください。

上皮細胞のコロニーは約4〜5日で形成され、線維芽細胞のフィーダー細胞に囲まれます。これらのコロニーが拡大するにつれて、他のコロニーと融合し、より大きなコロニーを形成します。培養細胞が70%コンフルエントに達した時点で、継代して拡大させる必要があります。

フィーダー細胞を除去した後、接着性上皮細胞をトリプシン処理し、新たに照射したフィーダー細胞上に再播種することができます。qRT-PCRによるこれらの細胞の表現型解析では、初代バイオプシー検体と比較して、継代1回終了時に前駆細胞マーカーであるP63の上方制御が認められ、細胞がより前駆幹細胞に近い状態にリプログラミングされたことが示されます。これらの細胞を通常の組織培養プレートに移すと、P63の発現が減少し、密接結合タンパク質1（TJP1）およびE-カドヘリンの発現が増加し、前駆細胞からより分化した上皮細胞への表現型シフトが実証されます。

継代1回後の細胞をフローサイトメトリーで解析した結果、細胞の90%以上がEpCAM陽性であることが示されました。免疫蛍光染色により、これらの細胞が上皮マーカー、前駆細胞マーカー、増殖マーカー、および上皮タイトジャンクションタンパク質の発現を保持していることが証明されました。非疾患患者由来の食道細胞の倍加時間は約36〜40時間と算出されていますが、疾患細胞の倍加時間はより遅くなる可能性があります。

この手法に習熟すれば、約1時間で完了します。本手順を行う際は、コンタミネーションを防ぐために無菌操作を徹底し、細胞の生存率を維持するために迅速に作業してください。本手順の後、トランスウェル培養などの他のアッセイを実施することで、どの抗原が食道炎症または病原性を引き起こしているかを評価できます。

本アッセイの開発により、好酸性食道炎を引き起こす誘因抗原の特定や、これらの患者に対する新たな治療法の選択肢を研究者が追求することが可能になります。このビデオを視聴することで、食道疾患の研究や3Dモデルの作製に用いるため、内視鏡生検組織から食道上皮細胞を分離し、拡大培養する方法について十分に理解できるはずです。鋭利な器具や生物学的組織を取り扱う際は危険が伴うことに注意してください。

鋭利な器具は適切に廃棄し、適切なバイオセーフティの実践を徹底してください。