Name: MitoCeption：神経膠芽腫幹細胞に単離されたヒトMSCミトコンドリアの転送 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学ぶMitoCeptionプロトコルで、ヒトMSCから神経膠芽腫幹細胞へミトコンドリアを転送する方法。単離されたミトコンドリアの代謝効果を独立して評価し、がん生物学の理解を深める技術です。

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我々は提供するために、FACS分析のヘルプはモンペリエRIOイメージング施設（MRI）をアンドレア・パルメジャーニ（L2CとDIMNP、モンペリエ）、ブノワCharlotの（IES、モンペリエ）と同様に有用な議論のための研究室のメンバー、クリストフDuperrayに感謝しますFACSおよび共焦点顕微鏡のための適切な環境を提供します。 BNMはLabEx Numev（大会ANR-10-LABX-20）から大学院の交わりによってサポートされていました。 ABは、ワルシャワと欧州連合（EU）の大学（nはPOKL.04.01.02-00-221 / 12°）から学部交わりによってサポートされていました。 MLVは、科学研究のためのナショナルセンター（CNRS）からスタッフの科学者です。

1日目間葉系幹細胞の1ラベリング（MSC）ミトコンドリア（オプション） <ol><li> 1日目に培養液中で4×10 5 MSCを有するように二日、ミトコンドリアの準備の前に、10ミリリットルαMEM/ FBS 10％で、100ミリメートル培養皿にヒトMSCをシード。 </li><li> PBS（4ml）でMSCをすすぎ、4ミリリットルαMEM/ FBS、1％を追加（37℃に予め温め）。 </li><li> 37℃のインキュベーター中で30分間、細胞をミトコンドリア生体染色色素の必要量を添加し、インキュベートします。 </li><li> 、ミトコンドリア色素溶液を外し予め温め4ミリリットル（37°C）αMEM/ FBS、1％で細胞を2回洗浄し、バック4ミリリットルαMEM/ 10％FBSを追加します。 37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li> 2時間後、30分と、別の時間後に培地を変更します（10ミリリットルαMEM/ FBS 10％）。 </li></ol> 1日目神経膠芽腫幹細胞（GSC）の2ラベリング（オプション、ディスカッションセクションを参照してください） <table border="1" fo:keep-together.within-ページ= &quot;1&quot;のfo：キープで-next.within-ページ= &quot;常に&quot;&gt; <tbody><tr><td> 細胞培養培地 </td><td> 組成 </td></tr><tr><td rowspan="5"> GSC基礎培地</td><td> DMEM / F-12を補充し</td></tr><tr><td>インスリンの20mg / mlの</td></tr><tr><td> N2サプリメント1倍</td></tr><tr><td>グルコース3グラム/ L </td></tr><tr><td> L-グルタミン2mMの</td></tr><tr><td rowspan="9"> GSCの増殖培地</td><td>基礎培地に入れます： </td></tr><tr><td> B27サプリメント、1× </td></tr><tr><td> EGFを10ng / mlの</td></tr><tr><td> bFGFを10ng / mLの</td></tr><tr><td> Fungine 10 mg / mlで</td></tr><tr><td>ファンギゾン0.25 mg / mlで</td></tr><tr><td>ヘパリンの2mg / mlの</td></tr><tr><td>シプロフロキサシンを2μg/ mlの</td></tr><tr><td>ゲンタマイシンを2μg/ mlの</td></tr><tr><td rowspan="4"> MSCの増殖培地</td><td> ＆＃945; MEMはを補っ</td></tr><tr><td> L-グルタミン2mMの</td></tr><tr><td> 10％FBS </td></tr><tr><td> bFGFを2 ngの/ mlの</td></tr></tbody></table> 表1：培養培地。 <ol><li>ポリHEMAコーティングした細胞培養フラスコ上のニューロスフェアとして成長GSCs（GB4細胞株32（10×10 6細胞）（ステップ3.12から3.1を参照してください）解離します。 </li><li> 10 5細胞で48ウェルプレート中の種子GSCs /ウェルでGSCの増殖培地（500μl）を（ 表1参照します）。 </li><li> 20℃で5分間、270×gでプレートを遠心。 </li><li>細胞生体染色色素の必要量を加え、37℃で30分間インキュベートします。 </li><li> 48ウェルプレートのウェル当たりGSC基礎培地（ 表1）の500μLを加えます。 </li><li> 5分間、20℃で270×gでプレートを遠心。上清を吸引除去します。 </li><li>繰り返しは、2.6から2.5まで繰り返します。 </li><li> GSC基礎培地500μlを加え、37℃で30分間インキュベートします。 </li><li> 5分間、20℃で270×gでプレートを遠心。上清を吸引除去します。 </li><li> 48ウェルプレートのウェルあたりGSC増殖培地500μlを加え、37℃のインキュベーターでインキュベートします。 注：GSCsの量を示した（10×10 6細胞）を、異なる用量応答実験とFACSの制御を行うことができます。実験条件をより正確に定義すると、この量を縮小することができます。 </li></ol> 2日目神経膠芽腫幹細胞の3播種<ol><li> 50mlのチューブ中20℃で、5分間、270×gで遠心分離することによってGSCのニューロスフェア（10×10 6細胞）を収集します。 </li><li> HBSS 5mlで細胞を洗浄し、20℃で5分間、270×gで遠心。 </li><li>上清を吸引除去します。 </li><li>静かに10×10あたり（100μlのトリプシン-EDTA（0.25％）でGSCペレットを再懸濁<s&gt; 6細胞）まで</li><li> 3分間37℃でインキュベートします。 </li><li> 10μlののCaCl 2（20mMの）と2μlのDNアーゼI（10mg / ml）を追加します。 </li><li>優しくP200ピペットでピペッティング（30-50x）によってニューロスフェアを解離。気泡を避けてください。すべてGSCsが解離して、顕微鏡下で確認してください。 </li><li> 10μlのトリプシン阻害剤（5％）、10mlのHBSSを追加します。 </li><li> 20℃で7分間、270×gで遠心分離GSCs。 </li><li>上清を捨て、10ミリリットルGSC基礎培地（ 表1）を追加します。 </li><li>トーマ計数室でGSCsをカウントした後、20℃で7分間、270×gで細胞を遠心します。 </li><li> 10 6 GSCs / mlの細胞濃度に達するようにGSC増殖培地（ 表1）の適切な量を加えます。 </li><li>シード10、96ウェルプレートのウェルあたり5 GSCs（100μlの細胞懸濁液）。 </li><li>ボットでGSCsを取得するために20℃で7分間、270×gでプレートを遠心井戸のトム。 </li><li>第5節まで37℃で96ウェルプレートをインキュベートします。 </li></ol> 2日目 4. MSCミトコンドリアの単離<ol><li> 4℃にマイクロチューブの遠心分離温度を調整します。 </li><li>ミトコンドリア抽出（200μlの試薬Aと400μlの試薬C、EDTA不含プロテアーゼ阻害剤を含有するの両方）のための試薬を含む二1.5 mlチューブ「A」と「C」を調製します。 「MSC」と「水戸」と表示された2他のチューブを準備します。氷の上ですべてのチューブを保管してください。また、ミトコンドリアの段階希釈用チューブを準備します。 </li><li>予め温めた10ミリリットル（37℃）PBSで洗浄するのMSC。 </li><li> 2ミリリットルのトリプシンを洗浄のMSC（EDTAなし）10秒間、1mlのトリプシン（EDTAなし）を追加します。 37℃で5〜10分間細胞をインキュベートします。 </li><li> 10ミリリットルαMEM/ FBS 10％、50mlのチューブへの転送を追加することにより、MSCを回復します。 </li><li> 20℃で5分間、270×gで遠心分離細胞。 </li><li>上清を捨て、追加細胞ペレットを10ミリリットルαMEM/ FBS 10％。 </li><li> Malassez数える室とMSCをカウントします。 </li><li>遠心分離機のMSC（4-5×10 5）20℃で5分間、270×gで。 </li><li>上清を捨て、細胞ペレットに1メートルの氷冷αMEM/ FBSに10％を追加して（ステップ4.2で調製）「MSC」で標識したチューブに細胞を移します。チューブを氷上に保管してください。 </li><li>遠心機で4℃で5分間、900×gでMSCを含有するチューブ。 </li><li>チューブから全ての残留培地を除去。 </li><li>ミトコンドリア単離試薬A（EDTAフリープロテアーゼ阻害剤を含む）の200μlのを追加します。 5秒間中速でボルテックスし、正確に2分間氷上でチューブを残します。 </li><li> 10秒間最大速度でミトコンドリアの単離試薬B.渦の2.5μLを追加し、氷上でチューブを残します。 5分間、30秒ごとに繰り返します。 </li><li> （EDTAフリープロテアーゼ阻害剤を含む）ミトコンドリア単離試薬Cの200μlのを追加します。チューブを傾けることによりミックス（ROughly 30回、ない渦を行います）。 4℃で10分間、700×gでチューブを遠心。 </li><li> （ステップ4.2で調製）「水戸」チューブに（MSCのミトコンドリアを含む）上清を移します。 </li><li>ミトコンドリアペレットを得るために3000×gで遠心分離し、4℃で15分、。上清を捨てます。ペレットは、単離されたミトコンドリアが含まれています。 </li><li>ミトコンドリアペレットを得るために、そして試薬Cの200μlを、12,000×gで遠心分離、4℃で5分間でミトコンドリアペレットを洗浄します。 </li></ol> GSCsに単離されたMSCミトコンドリアの5転送（MitoCeption） <ol><li> MSCは（4×10 5）から単離したミトコンドリアペレットに予備冷却（0℃）GSC増殖培地200μlを追加します。 </li><li>一貫GSCsにミトコンドリア懸濁液の20μlのを追加する（GSC増殖培地中の）ミトコンドリアの準備を希釈します。 </li><li> 96ワットのウェルに単離ミトコンドリアのボリュームを追加します。エルプレートは、所望の濃度（0.1〜10μgの）で、（ステップ3.15から）GSCsを含みます。少なくとも一度表面全体を覆って、ウェルの底に近い、ゆっくりとミトコンドリアを追加します。 </li><li> MSCのミトコンドリアの重要な色素漏出を制御するために、GSCの増殖培地のみ（GSCs）を（生体染色色素漏れ検出のためのパート6.2を参照）を含む96ウェルプレートのウェルにミトコンドリアの準備（0.1から10μg）の同量を追加します。 </li><li>遠心し、4℃で15分間1500×gでMSCのミトコンドリア（ステップ5.3）とミトコンドリアの受信者GSCsとコントロールプレート（ステップ5.4）を含む96ウェルプレート。 </li><li>すぐに遠心分離した後、37℃の細胞インキュベーターで培養プレートを置きます。 注：ミトコンドリア転送プロトコルがSYSTに応じて調整することができる遠心分離の数と、十分な遠心力で培養した細胞のミトコンドリア懸濁液を遠心分離に依存していますミトコンドリアドナー/レシピエント細胞のEM。 </li></ol> 3日目 FACSおよび共焦点イメージングによってミトコンドリア転送6.分析<ol><li> FACS分析のためGSCサンプルの調製 注：MSCミトコンドリアを予め生体染色色素（セクション1）で標識した場合、効率は24時間ミトコンドリア転写後、FACSによってモニターすることができます。 <ol><li>遠心分離機20℃で5分間、270×gでMitoCepted GSCsで96ウェルプレート。 </li><li>上清を捨てます。 </li><li>各ウェルに100μlのトリプシン（EDTAなし）を追加します。 3分間37℃でインキュベートします。上下にピペットで24時間の期間内に形成されたニューロスフェアを解離します。 </li><li> GSC基礎培地100μlを加えます。 </li><li> 20℃で5分間、270×gでプレートを遠心し、上清を捨てます。 </li><li> FACSに300μlのGSC基礎培地と転送再懸濁GSCsは、チューブを適応しました。 </li><li> FACS ANを実行しますalysis。 </li></ol></li><li> 単離ミトコンドリアからのミトコンドリアの重要な色素漏出のための制御（FACS） 注：このステップの目的はむしろ、本物のMSCのミトコンドリアの転送を反映ではないでしょう背景FACS信号、MitoCeption（ステップ5.3）に使用される標識されたMSCのミトコンドリアからの生体染料の単なる漏れを決定することです。 <ol><li> 3.15にステップ3.1で説明したようにGSC細胞をシード。 </li><li> 37℃で1時間細胞をインキュベートします。 </li><li>遠心分離機20℃で5分間、1500×gで（ステップ5.4から5.6まで）のみミトコンドリアを含む96ウェルプレート。 </li><li> GSC 96ウェルプレート（ステップ6.2.2）から培地を吸引し、ミトコンドリアのみ（ステップ6.2.3からの上清）とインキュベートした媒体によってそれを置き換えます。 </li><li> 2時間37℃でGSCsを含む96ウェルプレートをインキュベート。 </li><li>手順でFACS分析のために6.1.7に6.1.1のように進みます。 </li></ol></li><li> GSC SAMPの調製共焦点イメージングのためのレ 注：GSCsにMSCミトコンドリアの転送は蛍光イメージングにより分析される場合、MSCおよびGSCs両方ミトコンドリア（ステップ1）および細胞（ステップ2）バイタル染料でそれぞれ、予め標識される必要があります。 <ol><li>ステップ6.1.5に6.1.1のようにGSCsを準備します。 </li><li> 35mm培養皿中で2％FBS及びシード（ガラスボトム）を含有する2ml中に再懸濁GSCs GSC増殖媒体。 </li><li> 24時間後に転送された蛍光MSCミトコンドリアとGSCsに共焦点イメージングを実行します。 </li></ol></li></ol>

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INSERM（研究所国立・デ・ラ・サンテらデラRECHERCHEMédicale）、これでCJとML.V.提携している、MitoCeption技術（EP14306154.7）に特許出願しました。

研究の増加は、細胞がミトコンドリアを交換することができること、およびこれらのミトコンドリアは、標的細胞の代謝および機能に重大な影響を有することを示しています。したがって、定量的に、それらの生物学的効果の正確な研究を可能にするために、これらの標的細胞へのドナー細胞からのミトコンドリアを転送するためのツールを習得することが不可欠です。 ここで説明するプロトコルは、もともと付着癌細胞株MDA-MB-231 33にヒト間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアを転送するために働きました。ここに示されるように、 インビトロでのニューロスフェアとして増殖、がん幹細胞に適合させることができます。ミトコンドリア転送MSCミトコンドリアは、GSCのニューロスフェアに添加されたときに発生したが、本プロトコールに記載のように、それは、単一細胞GSCsでより効率的であることが見出されました。このプロトコルも必要で、T細胞のような、他の非接着性細胞に推定することができMitoCeption工程のためのシードされた細胞濃度をDAPT。 <...

ミトコンドリアは、彼らが栄養摂取ならびにエネルギーおよび代謝物の生産において中心的な役割を果たし、真核細胞に見られる細胞小器官です。これらの細胞小器官は、電子輸送鎖複合体、tRNA及びrRNAの1のタンパク質をコードして16.6キロバイトの長円形のミトコンドリアDNA（mtDNAのを）、含まれています。これらの細胞小器官の機能は、ミトコンドリア機能不全1、2、3で細胞ホメオスタシスおよびいくつかの病態のための重要な関連しているされています。ミトコンドリアの状態は、例えば、治療4、5、6、7への転移及び抵抗性の結果この後者の場合には、炎症、感染症および癌に関連しています。 ミトコンドリアはの驚くべき能力を表示します<html> 「ドナー」と「ターゲット」セル間転勤。最近になって、15の異なる研究室8、9、10、11、12、13、14によって示されるように、これは、例えば、組織修復および化学療法剤に対する耐性のような他の機能の改変と同様に、標的細胞のエネルギー代謝の変化をもたらします、16。ヒト間葉系幹細胞（MSC）は、これらの細胞の機能的特性の改変をもたらす、心筋細胞、内皮細胞、肺の肺胞上皮細胞、腎尿細管細胞と癌細胞を含む標的細胞の多種多様なミトコンドリアを転送するこの能力を示します8、&gt; 9、10、12、17、18。 ミトコンドリア交換は、現在の異なる細胞型の数が互いに通信し、それらの生物学的特性を変更することができ、広く使用されるメカニズムとして現れます。このミトコンドリア交換は19複雑なコネキシン43を含むギャップジャンクション8またはM-秒/ TNFaip2とエクソシストを含む、トンネルナノチューブ（TNT）の形成を介して発生する可能性があります。代替的に、ミトコンドリアの転送は、ドメイン含有タンパク質1媒介性微小胞（ARMMs）20アレスチンによって媒介されることが示されました。興味深いことに、ミトコンドリアの転送の有効性は、RhoのGTPアーゼ1 MIRO1 21、iPSC-間のミトコンドリア転送効能の違いを説明するための重要な因子の発現率にリンクされましたMSCおよび成人BM-MSCの22。 細胞と細胞のミトコンドリア交換に関するデータのこの富のにもかかわらず、比較的少ないが、このミトコンドリア転送の代謝性および生物学的結果について知られています。したがって、それは完全に完全にこの転送の生物学的効果を評価するための適切なツールをセットアップ保証します。長年にわたり、受容細胞へのドナーからミトコンドリアを転送するためのいくつかの技術的なアプローチが提案されています。これは27、transmitochondrialサイブリッド26を生成するために、卵母細胞23、24、25、細胞融合にミトコンドリアの直接注入を含みます そして、最近では、光熱nanoblades 28を用いて、単離されたミトコンドリアの転送。 我々と他の人は以前に分離されたmitochondの能力を実証しましたインビトロおよびインビボの両方で観察されたようにRIAは、生細胞によって内在化されます メカニズムを通して29、30、31は 、マクロピノサイトーシス32が関与することを提案しました。我々はさらに、定量的（付着）で例示されるように、標的細胞にMDA-MB-231乳癌細胞株31（MSCS）から単離されたミトコンドリアを転送するために、MitoCeptionと呼ばれる方法を開発しました。このプロトコルは、神経膠芽腫幹細胞（GSCs）の単離されたヒトMSCのミトコンドリアの転送のためにここに適合させました。 神経膠芽腫は急速に主に起因する腫瘍33内に存在する神経膠芽腫幹細胞（GSC）に、治療に耐性となる脳の積極的な悪性腫瘍です。これらのGSCsは、in vitroでのニューロスフェアとして成長し、異種移植モデルにおいて腫瘍を発生させます。神経膠芽腫内癌細胞は持っています放射線治療抵抗性星細胞腫のネットワーク34で、その結果、移行することができるミトコンドリア（ならびにカルシウムおよび細胞核）まで延長マイクロチューブを介して、その相互接続アストロサイトの脳腫瘍細胞のために最近示されるように、細胞から細胞への接続を行うための能力。神経膠芽腫は、MSC 35、36を含む、腫瘍微小環境内の多くの異なる細胞を動員することができます。我々は、GSC機能的特性を変更すると予想される（データは示さず）MSCは共培養でGSCsと細胞間接続を行い、それらのミトコンドリアを転送することができることを示しました。現在のプロトコルはMitoCeption技術はそれらの機能の生物学的結果を決定する目的でヒトGSCsに、ヒトMSCからのミトコンドリア、孤立事前を転送するために使用する方法について説明します。多能性の高い腫瘍形成GB4 GSC線37は、この研究において使用しました。

<table><tbody><tr><td>組織用ミトコンドリア単離キット&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>10579663</tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11520536</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement w/o VIT A (50x)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>11500446</tr><tr><td>HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+</sup</td><td>>&nbsp;シグマ</td><td>H4385</td><td></td></tr><tr><td>ポリヘム&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>aMEM グルタミンなし</td><td>オザイム</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 グルタミン無し</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>11540566</tr><tr><td>L-グルタミン&nbsp;</td><td>インビトロジェン&nbsp;</td><td>25030-024&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>グルコース&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>インスリン&nbsp;</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>私は1882年&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>人間&nbsp;bFGF&nbsp;</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>ヒトEGF&nbsp;</td><td>ペプロテック&nbsp;</td><td>AF-100-15&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>シグマ</td><td>H3149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MERCK</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>SIGMA&nbsp;</td><td></td><td></td>10104159001</tr><tr><td>トリプシン0.25%/ EDTA 1&nbsp;mM</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>トリプシン</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤EDTAフリー</td><td>シグマ</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>シプロフロキサシン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>17850-5G-F</td><td></td></tr><tr><td>ファンジン&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>ant-fn-1</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>ユーロメデックス</td><td>EU0410</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker グリーン FM</td><td>分子プローブ</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker レッド CMXRos</td><td>分子プローブ&</td><td>nbsp;M7512</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker 深赤色FM</td><td>分子プローブ</td><td>&nbsp;M22426&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA</td><td>Molecular Probes</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Blue CMF2HC</td><td>Molecular Probes</td><td>C12881</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-24948</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish Sterile Culture Dish</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>FACSチューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>2,523,749</td><td></td></tr><tr><td>FACS装置</td><td>ガリオス&nbsp;</td><td>&nbsp;3L 10C</td><td></td></tr><tr><td>LC FAST START DNA MASTER PLUS&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>3515885001</td><td></td></tr></tbody></table>

mitoception：神経膠芽腫幹細胞に単離されたヒトmscミトコンドリアの転送

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

ミトコンドリアは、細胞代謝、エネルギー産生およびアポトーシスの制御に中心的な役割を果たす。不十分なミトコンドリア機能は、神経病変から癌に至るまで、非常に多様な疾患の原因が分かっています。興味深いことに、ミトコンドリアは最近容量を表示することが示されており、さらに現在の関心を高め、ミトコンドリアのレシピエント細胞を代謝および機能的結果と、共培養条件下で癌細胞にヒト間葉系幹細胞（MSC）からのとりわけ、細胞タイプとの間で転送されますこれらの細胞小器官の生物学的特性のために。 標的細胞における転写MSCミトコンドリアの効果を評価することは、細胞 - 細胞相互作用の生物学的結果を理解するために最も重要です。ここで説明MitoCeptionプロトコルは、MSCのミトコンドリアを用いて、標的細胞へのドナー細胞から予め単離されたミトコンドリアの移動を可能にしますモデル系としておよび神経膠芽腫幹細胞（GSC）。このプロトコルは、以前にMDA-MB-231癌細胞を接着するために、MSCをから単離されたミトコンドリアを転送するために使用されてきました。このミトコンドリア転送プロトコルは、in vitroでのニューロスフェアとして成長の具体的な特殊性を提示GSCsのためにここに適合されています。単離ミトコンドリアの転写は、ミトコンドリア生体染色色素を用いた蛍光活性化細胞選別（FACS）および共焦点イメージングによって追跡することができます。異なるハプロタイプ（のSNP）を有するミトコンドリアのドナーおよび標的細胞の使用は、標的細胞におけるそれらの円形のミトコンドリアDNA（ミトコンドリアDNA）の濃度に基づいて、転送ミトコンドリアの検出を可能にします。プロトコルは、これらの条件で検証された後、転送ミトコンドリアを有する細胞はさらに、細胞代謝、可塑性、増殖、および治療に対する応答としての生物学的特性に外因性のミトコンドリアの効果を決定するために分析することができます。

間葉系幹細胞（MSC）とMitoCeptionによって標的神経膠芽腫幹細胞（GSC）への転写からミトコンドリアの単離を概説する処理手順は、 図1に示されています。 GSCsは、それらの幹細胞の特性を保持するニューロスフェアとして増殖させたがん幹細胞です。プロトコルの場合、GSCsは時間のカップル（FACSデータ図3B参照）、より高いミトコンドリアの転送効率を可能にするために、ミトコンドリア（ステップ3）の転送の前に単一細胞として播種します。セクション5（3日目）に続いて、これらの細胞は、ニューロスフェア（図1）を形成するように再び観察されます。 GB4 GSCsのイメージングは、蛍光標識されたMSCのミトコンドリアとMitoCeption 72時間後には、共焦点画像から得られた直交ビューによって示されるように、MSC...

ここでは、プロトコル（MitoCeption）はGSCの代謝および機能に対するそれらの生物学的効果を研究する目的で、神経膠芽腫幹細胞（GSC）を、ヒト間葉系幹細胞（MSC）から単離されたミトコンドリアを転送するために提示されています。同様のプロトコルは、他の細胞型との間のミトコンドリアを転送するように適合させることができます。

MitoCeption：神経膠芽腫幹細胞に単離されたヒトMSCミトコンドリアの転送

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...

この手順の全体的な目的は、間葉系幹細胞などのドナー細胞からあらかじめ単離したミトコンドリアを、膠芽腫幹細胞などのターゲット細胞へと転移させることです。この手順は、トンネルナノチューブやマイクロベシクルなどのプロセスによって細胞間に自発的に転移するミトコンドリアの代謝的および生物学的影響など、代謝分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、サイトカインや代謝物などの微小環境に存在する他の要因や、トンネルナノチューブ内で輸送される可能性のある他の化合物とは独立して、ミトコンドリアの影響を評価できることです。イメージングのため、MitoCeptionによるミトコンドリア転移前に、MSCミトコンドリアおよびGSCを生存染色剤で標識することができます。まず、テキストプロトコルに従ってGSCを生存染色剤で事前標識した後、20 °Cで270 ×g、5分間の遠心分離により、50 mLチューブにGSCニューロスフィアを回収します。5 mLのHBSSを用いて細胞を洗浄し、再度チューブを遠心分離します。上清を吸引し、100 µLの0.25% Trypsin-EDTAを用いてGSCペレットを穏やかに再懸濁します。次に、細胞を37 °Cで3分間インキュベートします。その後、10 µMの塩化カルシウム10 µLと、10 mg/mLのDNase Iを2 µL、チューブに加えます。P200ピペットを用いて、気泡が混入しないように注意しながら30～50回ゆっくりとピペッティングし、ニューロスフィアを解離させます。10 mLのHBSSに調製した5% Trypsin inhibitorを10 µL細胞に添加し、GSCを7分間遠心分離します。その後、上清を捨て、10 mLのGSC Basal Mediumをサンプルに加えます。次に、トーマ血球計数器を用いて、再度遠心分離を行う前に細胞数をカウントします。GSC増殖培地を適切な量加え、細胞濃度を10⁶ GSCs/mLに調整してください。その後、96ウェルプレートの各ウェルに10⁵ GSCsを播種します。プレートを遠心分離し、GSCをウェルの底に沈降させます。顕微鏡下で細胞を確認します。その後、プレートを37°Cでインキュベートします。MSCミトコンドリアの単離を行うには、まずマイクロセントリフュージの温度を4°Cに調整します。ミトコンドリア抽出用の試薬を入れた、AおよびCとラベル付けした1.5 mLチューブを2本用意します。さらに、MSCおよびMiToとラベル付けしたチューブを2本用意します。チューブを氷上で保持します。また、ミトコンドリア調製液と共に準備するミトコンドリア連続希釈用のチューブを用意します。37°Cに予熱した10 mLのPBSを使用して、MSCを洗浄します。次に、2 mLのEDTAフリーTrypsinで細胞を10秒間洗浄し、さらに1 mLのTrypsinを加えてから、37 °Cで5〜10分間インキュベートします。プロトコルに従い、特にMSCのTrypsin処理およびミトコンドリア調製に使用するプロテアーゼ阻害剤において、EDTAの使用は避けてください。10 mLのAlpha MEM 10%FBSを加えてMSCを回収し、懸濁液を50 mLチューブに移します。次に、細胞を遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットにAlpha MEM 10%FBSを10 milliliters加えます。その後、Malassez計数盤を用いてMSCをカウントし、4～5×10⁵個の細胞を回収するために遠心分離します。上清を捨て、氷冷した10%FBS含有Alpha MEMを1 mL細胞ペレットに加え、氷上に保持したまま、あらかじめ準備したMSC標記のチューブに細胞を移します。次に、MSCチューブを4°Cで900 ×g、5分間遠心分離し、チューブ内から残存している培地をすべて除きます。続いて、EDTAフリーのプロテアーゼ阻害剤を含むミトコンドリア抽出試薬Aを200 µL MSCに加え、中速で5秒間ボルテックスします。その後、チューブを氷上に正確に2分間置きます。ミトコンドリア分離試薬Bを2.5 µL加え、チューブを再び氷上に置く前に、最大速度で10秒間細胞をボルテックスします。このボルテックス操作を、5分間、30秒ごとに繰り返します。次に、EDTAフリーのプロテアーゼ阻害剤を含むミトコンドリア分離試薬Cを200 µLチューブに加え、チューブを30回ほど傾けて内容物を混合します。チューブを4 °C、700 ×gで10分間遠心分離します。MSCミトコンドリアを含む上清を、あらかじめ準備しておいたMiToチューブに転送します。サンプルを4°C、3,000 ×gで15分間遠心分離します。上清を捨てた後、200 µLの試薬Cを用いてミトコンドリアペレットを洗浄します。その後、懸濁液を4°C、12,000 ×gで5分間遠心分離し、オルガネラをペレット化します。単離したMSCミトコンドリアをGSCに転移させるには、あらかじめ冷却したGSC増殖培地200 µLをミトコンドリアペレットに加えます。GSCに20 µLのミトコンドリア懸濁液を一貫して添加できるよう、GSC増殖培地でミトコンドリア調製液を希釈します。次に、ウェルの底に近い位置にゆっくりとミトコンドリアを添加します。MSCミトコンドリアのバイタルダイ漏出を制御するため、GSC増殖培地のみを含む96ウェルプレートのウェルに、同量のミトコンドリア調製液を加えます。プレートを4°Cで1,500 ×gにて15分間遠心分離します。その後、直ちに培養物を37°Cに置きます。翌日、コントロールウェルの生存染料漏出を分析するため、前述の手順に従ってGSC細胞を播種し、プレートを遠心分離した後、培養物を37°Cで1時間インキュベートします。ミトコンドリアのみを含む96ウェルプレートを遠心分離します。次に、GSC 96ウェルプレートから培地を吸引し、ミトコンドリアの上清に置換します。GSCをミトコンドリア上清とともに37°Cで2時間インキュベートします。最後に、テキストのプロトコルに従って、ミトコンドリア転移の解析、FACS解析、および共焦点イメージングを行います。GSCは、幹細胞としての特性を維持するためにニューロスフィアとして培養されたがん幹細胞です。ミトコンドリア転移の直前に、高い転移効率を確保するために単一細胞として播種し、翌日、ここに示すように、細胞が再びニューロスフィアを形成していることが観察されます。この図では、蛍光標識されたMSCミトコンドリアがGb4 GSCsの内部に局在していることが確認できます。MSCミトコンドリアは、GSC自体のミトコンドリアと同様に、GSCs全体に分布しています。GSCの共焦点画像から得られた3D再構成により、ほとんどのGSCにおいてMSCミトコンドリアの移行が観察され、移行したMSCミトコンドリアの細胞間局在が確認されました。GSCを青色の細胞生存染色剤と赤色のミトコンドリア生存染色剤の両方で事前標識することで、内在性のGSCミトコンドリアに対する移行したMSCミトコンドリア（緑色）の局在を可視化することができました。ここに示されるように、蛍光標識したMSCミトコンドリアの量を増やすことで、MitoCeptionによるFACS信号が増加し、対照信号よりも数桁高い値となりました。本稿で提示した単一細胞GSCにおけるミトコンドリア移行プロトコルでは、用量依存的な反応および相対的な平均蛍光強度が示されました。最終的に、MSCミトコンドリアの移行はGSCニューロスフィアにおいても達成されましたが、これらの条件下でのGSCへの移行効率は、単一細胞として最初に播種したGSCへのミトコンドリア移行と比較して低い結果となりました。この手法を習得し、適切に実施すれば、3時間で完了させることが可能です。この手順を実施する際は、ミトコンドリア調製物を常に氷上に保持しておくことが重要です。これらの手順に従い、FACS、共焦点顕微鏡観察、ミトコンドリアDNAのQPCRなどの他の手法を行うことで、標的細胞へのMSCミトコンドリア転移を可視化および定量化できます。また、転移したミトコンドリアの生物学的影響を判断するために、機能研究を行うことも可能です。これらの研究は、一般的に、ミトコンドリア転移の可視化に使用したものよりも少量のミトコンドリアを用いて行われることに留意してください。この手法により、正常な生理的条件下または病理的条件下で細胞間に自発的に転移したミトコンドリアの結果と生物学的影響を探索することが可能となり、ひいては新しい治療法の開発に寄与します。

mitoception-transferring-isolated-human-msc-mitochondria-to

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、分離、濃縮、および異所性ソニックヘッジホッグ経路の活性をもつ変異マウス由来の髄芽腫の腫瘍幹細胞の維持を説明します。...

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このビデオでは、蛍光標識されたミトコンドリアを遠心分離によって膠芽腫幹細胞(GSC)に移す方法が示されています。ドナーミトコンドリアの良好な取り込みと機能的統合は、共焦点顕微鏡を使用して蛍光を検出することによって確認されます。...

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腫瘍を求めて治療間葉系幹細胞 (MSCs) 侵襲神経膠芽腫のための処置として約束を示します。最適な移植には、足場に腫瘍切除キャビティへの MSCs の配信が含まれます。ここでは、神経膠芽腫の MSC 治療を研究する臨床技術を含んで提供される: 画像ガイド下腫瘍切除;MSC シード足場;...

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がん細胞株を用いた伝達性サイブリッドの作製

ここでは、ミトコンドリアのトレーシング、間葉系幹細胞(MSC)と網膜色素上皮細胞(ARPE19)の直接共培養手順、トンネルナノチューブ(TNT)形成とミトコンドリア移動の観察と統計解析の方法を含むプロトコールを提示し、MSCとARPE19細胞間のTNTを介したミトコンドリア交換を特徴付けます。...

In vitroでの間葉系幹細胞と網膜色素上皮との間のトンネルナノチューブを介したミトコンドリア転写

脳オルガノイドは、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、脳卒中様エピソード (MELAS)...

脳オルガノイドを用いたミトコンドリア疾患のモデル化:ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソードに焦点を当てる

ヒト胚性幹（ES）細胞の増殖

生存細胞の正確な数の知識は、多くの組織培養の操作が必要です。このプロトコルは、生細胞と死細胞を区別し、血球計算盤を用いて細胞を定量化する方法について説明します。それはヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCsを）数えて説明していますが、それは他の細胞型に使用することができます。...

ヒト神経幹細胞を数える

学ぶMitoCeptionプロトコルで、ヒトMSCから神経膠芽腫幹細胞へミトコンドリアを転送する方法。単離されたミトコンドリアの代謝効果を独立して評価し、がん生物学の理解を深める技術です。

MitoCeption：神経膠芽腫幹細胞に単離されたヒトMSCミトコンドリアの転送

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