MitoCeption：神経膠芽腫幹細胞に単離されたヒトMSCミトコンドリアの転送

この手順の全体的な目標は、以前に単離されたミトコンドリアを間葉系幹細胞などのドナー細胞から膠芽腫幹細胞などの標的細胞に移すことです。この手順は、トンネルナノチューブやマイクロベシクルなどのプロセスによって細胞間で自発的に移動するミトコンドリアの代謝的および生物学的影響など、代謝分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ミトコンドリアの影響を、サイトカインや代謝物などの微小環境に存在する他の要因や、トンネルナノチューブ内で輸送される可能性のある他の化合物とは無関係に評価できることです。

イメージングの目的で、MSCミトコンドリアとGSCは、MitoCeptionによるミトコンドリア転写の前に重要な色素で標識できます。まず、テキストプロトコルに従ってGSCをバイタル色素で事前に標識した後、270倍のg、摂氏20度で5分間遠心分離することにより、50ミリリットルのチューブにGSCニューロスフェアを回収します。5ミリリットルのHBSSを使用して細胞を洗浄し、チューブを再度回転させます。

上清を吸引し、100マイクロリットルの0.25%トリプシン-EDTAでGSCペレットを穏やかに再懸濁します。次に、細胞を摂氏37度で3分間インキュベートします。次に、DNase Iの1ミリグラムあたり10ミリグラムで2マイクロリットルの20ミリモル塩化カルシウムを10マイクロリットルのチューブに添加します。

P200ピペットを使用して、気泡の形成を避けながら30〜50回ピペットを優しく上下させることにより、ニューロスフェアを解離します。10ミリリットルのHBSSに10マイクロリットルの5%トリプシン阻害剤を細胞に加え、GSCを7分間遠心分離します。次に、上清と10ミリリットルのGSC基礎培地をサンプルに捨てます。

次に、トーマカウンティングチャンバーを使用して、細胞をカウントしてから再度回転します。適切な量のGSC増殖培地を添加して、1ミリリットルあたり10〜6番目のGSCの細胞濃縮物に到達します。次に、96ウェルプレートのウェルごとに10から5番目のGSCに播種します。

プレートを遠心分離して、GSCがウェルの底に沈殿するようにします。顕微鏡で細胞を確認します。次に、プレートを摂氏37度でインキュベートします。

MSCミトコンドリアの単離を行うには、まず微量遠心分離機の温度を摂氏4度に調整します。ミトコンドリア抽出用の試薬を含むAおよびCとラベル付けされた2本の1.5ミリリットルチューブを準備します。MSCとMiToとラベル付けされた2つの追加のチューブを準備します。

チューブを氷の上に保ちます。また、ミトコンドリア調製物でセットアップされるミトコンドリア連続希釈用のチューブを準備します。MSCを洗浄するために摂氏37度に予熱したPBSの10ミリリットルを使用してください。

次に、2ミリリットルのEDTAフリートリプシンで、細胞を10秒間洗浄し、さらに1ミリリットルのトリプシンを追加してから、細胞を摂氏37度で5〜10分間インキュベートします。EDTAの使用は、特にMSCトリプシン化およびミトコンドリア調製物で使用されるプロテアーゼ阻害剤のために、プロトコルに従って避けるべきです。10ミリリットルのAlpha MEM 10%FBSを追加してMSCを回収し、懸濁液を50ミリリットルのチューブに移します。

次に、細胞を遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットに10ミリリットルのAlpha MEM 10%FBSを加えます。次に、マラセス計数チャンバーを使用してMSCをカウントしてから、10の4〜5倍を5番目の細胞にスピンダウンします。

上清を捨て、1ミリリットルの氷冷Alpha MEM 10%FBSを細胞ペレットに加え、細胞を氷上に保持し続けながら、以前に調製したMSC標識チューブに細胞を移します。次に、MSCチューブを摂氏4度で900gで5分間遠心分離し、チューブから残留培地をすべて取り除きます。次に、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤を含む200マイクロリットルのミトコンドリア単離試薬AをMSCに加え、中速で5秒間ボルテックスします。

その後、チューブを氷の上にちょうど2分間置きます。2.5マイクロリットルのミトコンドリア単離試薬Bを加え、細胞を最大速度で10秒間ボルテックスしてから、チューブを氷上に戻します。この渦を30秒ごとに5分間繰り返します。

次に、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤を含む200マイクロリットルのミトコンドリア単離試薬Cをチューブに加え、チューブを約30回傾けて内容物を混合します。チューブを700 gで摂氏4度で10分間遠心分離します。MSCミトコンドリアを含む上清を、あらかじめ調製したMiToチューブに移します。

サンプルを3, 000倍gで摂氏4度で15分間遠心分離します。上清を捨てた後、200マイクロリットルの試薬Cを使用してミトコンドリアペレットをすすぎます。次に、懸濁液を摂氏4度で12, 000倍gで5分間回転させ、オルガネラをペレット化します。

単離されたMSCミトコンドリアをGSCに移すには、200マイクロリットルの予冷済みGSC増殖培地をミトコンドリアペレットに加えます。ミトコンドリア調製物をGSC増殖培地で希釈し、GSCに20マイクロリットルのミトコンドリア懸濁液を一貫して添加できるようにします。次に、ミトコンドリアをウェルの底近くにゆっくりと加えます。

MSCミトコンドリアのバイタル色素の漏出を制御するには、GSC増殖培地のみを含む96ウェルプレートのウェルに同量のミトコンドリア調製物を追加します。プレートを1,500倍のgで摂氏4度で15分間遠心分離します。次に、すぐに培養物を摂氏37度に置きます。

翌日、コントロールウェルのバイタル色素の漏出を分析するために、前述のようにGSC細胞を播種し、プレートを遠心分離し、培養物を摂氏37度で1時間インキュベートします。ミトコンドリアのみを含む96ウェルプレートを遠心分離します。次に、GSC 96ウェルプレートから培地を吸引し、ミトコンドリア上清と交換します。

GSCをミトコンドリア上清と摂氏37度で2時間インキュベートします。最後に、ミトコンドリア転写の解析、FACS解析、およびテキストプロトコルによる共焦点イメージングを行います。GSCは、幹細胞の特性を維持するためにニューロスフェアとして成長したがん幹細胞です。

ミトコンドリア移植の直前に、ミトコンドリアの移動効率を高めるために単一細胞として播種され、翌日、ここに示すように、細胞が再びニューロスフェアを形成することが観察されます。この図では、蛍光標識されたMSCミトコンドリアがGb4 GSC内に局在していることが確認できます。MSCミトコンドリアは、GSCミトコンドリアと同様にGSC全体に現れます。

MSCミトコンドリアの移行は、GSC共焦点画像からの3D再構成でほとんどのGSCで観察でき、転送されたMSCミトコンドリアの細胞間局在を確認しています。青色の細胞状色素と赤色のミトコンドリアバイタル色素の両方でGSCを事前に標識することで、緑色で見られる転写されたMSCミトコンドリアの内因性GSCミトコンドリアに対する局在を視覚化することができました。ここに示すように、蛍光MSCミトコンドリアの量が増加すると、MitoCeptionはFACSシグナルの増加につながり、制御シグナルよりも数桁高くなりました。

ここで紹介したミトコンドリア転写プロトコルをシングルセルGSCで実施すると、用量依存的な反応と相対的な平均蛍光強度が示されました。最後に、MSCミトコンドリアの移行はGSCニューロスフェアでも達成されましたが、これらの条件下でのGSCへの移行の有効性は、最初に単一細胞として播種されたGSCにミトコンドリアが移植された場合と比較して低かった。このテクニックは、一度マスターすれば、適切に実行すれば3時間で習得できます。

この手順を試みるときは、ミトコンドリアの準備を常に氷の上に置いておくことを忘れないでください。これらの手順に続いて、ミトコンドリアDNA上のFACS、共焦点顕微鏡法、QPCRなどの他の方法を実行して、標的細胞へのMSCミトコンドリア移動を視覚化および定量化することができます。また、転移したミトコンドリアの生物学的影響を決定するために、機能研究を行うこともできます。

これらの研究は、通常、ミトコンドリアの移動を視覚化するために使用されるものよりも少ない量のミトコンドリアで実施されることに注意してください。この技術により、正常な生理学的または病理学的条件で細胞間で自発的に移動するミトコンドリアの結果と生物学的影響を調査することができ、新しい治療法の開発に貢献します。