高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

本手順の全体的な目的は、差速遠心法を用いて骨格筋ミトコンドリアを単離し、ミトコンドリア呼吸鎖複合体I、IIおよびIVの呼吸速度を測定することです。この手法は、多様な神経疾患、敗血症、加齢に伴う疾患など、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患や症候群といった、ミトコンドリアバイオエナジェティクス分野における重要な課題の解明に寄与します。本技法の主な利点は、単離されたミトコンドリア調製物において、ミトコンドリア機能の解析を妨げる可能性のある細胞学的因子の大部分が排除されていることです。手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるSandra Nansozが行います。

本手順を開始するために、テキストプロトコルに記載されている通り、骨格筋サンプルの入ったビーカーを用意します。ビーカーをアイスバケットに置きます。精密剪刀を用いて、筋肉を1〜2 mmのサイズに細かく刻みます。

次に、刻んだ組織を氷冷した分離バッファーで2回、1回あたり20 millilitersを使用して洗浄します。洗浄した組織を組織1gあたり10 millilitersの分離バッファーに懸濁させ、さらに5 milligramsのprotease-G tissueを添加します。その後、ビーカーをマグネチックスターラーを備えた氷浴に入れ、10分間攪拌します。

その後、組織1gあたり0.2%脱脂BSAを添加した単離緩衝液をさらに10ml加えて、懸濁液を希釈します。次に、ビーカーから単離緩衝液をすべて捨てます。0.2%BSAを添加した氷冷単離緩衝液を1回につき20ml使用し、組織を2回洗浄します。

次に、組織1gあたり10 mLのBSA添加分離バッファーを用いて組織を再懸濁します。緩い適合のペッスルを備えた半自動ガラスホモジナイザーを使用して、組織をホモジナイズします。続いて、ホモジナイズ液を遠心管に移し、4°Cで10,000 ×gにて10分間遠心分離します。

セロロジカルピペットを使用して、上清を除去します。組織1gあたり10mLの氷冷BSA添加分離培地を用いて、ペレットを再懸濁します。懸濁液を4°Cで350×g、10分間遠心分離します。

その後、セロロジカルピペットを使用して上清を回収し、ペレットを廃棄します。回収した上清を、氷上に置いたビーカーに2層のガーゼを通してろ過します。ろ過した懸濁液を遠心チューブに移し、4 °Cで7,000 ×gで10分間遠心分離します。

次に、上清を捨てます。粗ミトコンドリアペレットを、組織1gあたり5mLのBSA添加分離バッファーで再懸濁します。この懸濁液を4°Cで10分間、7,000×gで遠心分離します。

次に、上清を捨て、ペレットを20 millilitersの洗浄緩衝液で再懸濁します。4 °Cで10分間、7,000 ×gで遠心分離します。この再懸濁および遠心分離の工程をもう一度繰り返します。

その後、上清を捨て、ペレットを1 mLの洗浄バッファーで再懸濁します。標準的な方法を用いてタンパク質濃度を決定してください。その後、濃縮したミトコンドリア懸濁液を、呼吸能測定アッセイに用いるまで氷上で保持します。

まず、ミトコンドリア濃縮液を呼吸バッファーで再懸濁し、ミトコンドリアタンパク質の最終濃度を0.4 mg/mLにします。次に、空気校正済みのオキシグラフチャンバーから呼吸培地を吸引除去します。ここに、単離したミトコンドリア懸濁液を2.1 mL加えます。

ストッパーを挿入してオキシグラフチャンバーを密閉します。次に、ミトコンドリア懸濁液を37 °Cで700 RPMで連続的に撹拌します。安定した酸素フラックス信号が得られるまで、3〜5分間ベースラインの細胞呼吸を記録します。

複合体I依存的な呼吸を開始させるため、分離したミトコンドリア懸濁液を調製したオキシグラフチャンバーに、ストッパーのチタン製注入ポートを通して0.8 molarのリンゴ酸を12.5 microliters注入します。次に、2 molarのグルタミン酸を10 microliters注入します。酸素フラックスの信号が安定するまで、3〜5分間細胞呼吸を記録します。

その後、注入ポートを通じて0.05 molar ADPを10 µL注入します。酸素フラックスの信号が上昇し、その後低下して安定するまで、細胞呼吸を記録します。複合体II依存性呼吸については、単離ミトコンドリア懸濁液を調製したオキシグラフチャンバーに、0.2 millimolar rotenoneを2 µL注入します。

安定した酸素フラックス信号が得られるまで、細胞呼吸を記録します。その後、1 Mコハク酸を20 µL注入します。さらに、安定した酸素フラックス信号が得られるまで細胞呼吸を記録します。

その後、注入ポートを通じて0.05 molar ADPを10 µLチャンバー内に注入します。酸素フラックスのシグナルが上昇し、その後低下して安定するまで細胞呼吸を記録します。複合体IV依存性呼吸については、単離ミトコンドリア懸濁液を調製したオキシグラフチャンバーに0.8 millimolar アスコルビン酸を2.5 µL注入します。

次に、0.2 MのTMPDを2.5 µL、0.05 MのADPを10 µL直ちに注入します。酸素フラックスの信号が安定するまで、細胞呼吸を記録します。その後、1 Mのアジ化ナトリウムを10 µL注入します。

酸素フラックス信号が減少し、その後安定するまで細胞呼吸を記録します。本研究では、骨格筋から完全なミトコンドリアを単離します。その後、高解像度レスピロメトリーを用いて、複合体I依存的な呼吸速度を測定します。

見ての通り、ADPの添加直後にミトコンドリアの呼吸速度が上昇します。ADPが枯渇すると、呼吸速度はADP添加前と同様のレベルまで低下します。これは、呼吸制御比（RCR）として知られる状態3と状態4の比が高いことを示しており、分離手順においてミトコンドリアの完全性が良好に維持されていることを意味します。

次に、ロテノンを用いて複合体I依存的な呼吸を抑制し、複合体IIの基質であるコハク酸を注入することで、複合体II依存的な呼吸速度を観察します。その後、ADPを添加すると、呼吸速度が即座に上昇します。ADPが枯渇すると、呼吸速度はADP添加前と同様のレベルまで低下します。これはRCRが高いことを示しており、分画過程においてミトコンドリアの完全性が十分に保持されていることを意味します。

アスコルビン酸、TMPD、およびADPを添加することで、複合体IV依存性の呼吸速度を測定します。次に、複合体IVを阻害するためにアジ化ナトリウムを添加します。アジ化ナトリウム添加前後の酸素消費量の差を、真の複合体IV呼吸として解釈します。ステート3において高い複合体IV依存性呼吸速度が観察されることは、分離手順中にミトコンドリアの完全性が良好に保持されていたことを示しています。

この手法を習得すれば、適切に実施した場合、1時間半以内に完了させることができます。本手順を行う際は、ホモジナイズの前にあらかじめ酸素センサーの校正を行うことが重要です。本手順に続き、細胞内ADP量、ミトコンドリア膜電位、ATP合成酵素の酵素活性、基質レベルなどの測定といった他の手法を実施することで、呼吸速度の変化がミトコンドリア基質の不足、膜電位、あるいはATP合成酵素の酵素活性の低下によるものかといった追加の疑問を検証することが可能です。

このビデオを視聴することで、分画遠心法を用いて骨格筋からミトコンドリアを単離する方法と、高解像度レスピロメトリーを用いてミトコンドリア複合体I、II、およびIVの呼吸速度を測定する方法について、十分に理解することができます。この技術の開発により、ミトコンドリアエネルギー代謝分野の研究者が、遺伝性ミトコンドリア疾患、ミオパチー、単離ミトコンドリアにおける虚血再灌流障害などの分野で、ミトコンドリアのエネルギー機能を探索することが可能になりました。アンチマイシンA、ロテノン、アジ化ナトリウム、およびFCCPを取り扱う際は、極めて危険であることに十分注意してください。

また、本手順の実施中は、手袋や白衣の着用などの予防措置を常に講じる必要があります。