Name: 高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶ差動遠心分離による骨格筋ミトコンドリア単離と高解像度呼吸計測法。複合体I・II・IVの呼吸速度を測定し、神経疾患や加齢関連障害におけるミトコンドリア機能不全の理解に貢献します。

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この研究は、スイス国立科学財団（グラント32003B_127619）の支援を受けました。

大腿四頭筋生検は、ミトコンドリアを分画遠心分離によって分離されて、そこから麻酔したブタから採取されます。豚は別の実験のために後で使用されます。研究は、実験動物の管理と使用のためにとベルン、スイスの動物ケア委員会の承認を得て国立衛生研究所のガイドラインに従って行われます。 1.骨格筋の均質化とミトコンドリアの単離<ol><li> 消費税麻酔したブタ5〜10グラムの大腿四頭筋標本。本発明のアッセイでは、ブタの骨格筋を使用しています。このプロトコルは、他の種からミトコンドリアを単離することができる（ 例えば 、ラット、マウス、ヒト、 など ）。 注：この手順は、手術を専門とする医療専門家によって行われます。 <ol><li>筋肉内ケタミン（20 mgの/ kg）およびキシラジン（2 mgの/ kg）で鎮静ブタ、麻酔内で誘導される前静脈ミダゾラム（0.5ミリグラム/キログラム、プラスアトロピン0.02ミリグラム/キログラム）。手術中にプロポフォールの連続静脈内注入（1時間当たり4-8ミリグラム/キログラム）で麻酔し、フェンタニル（1時間当たり30μgの/キログラム）を維持。 </li></ol></li><li>直ちに氷冷ミトコンドリアの単離緩衝液（ 表1）の20 mLを含むビーカーに組織試料を浸します。 注：ホモジナイズし、遠心分離中に使用される緩衝液は、冷たい氷であると細胞質ゾルと互換性のイオン性及び浸透強度と生理的に適切なpHを有していなければなりません。 </li><li>分析風袋を計ったバランスのビーカー内の組織サンプルを秤量します。風袋分離バッファの20ミリリットルを入れたビーカーとのバランス。 </li><li>アイスバケットにビーカーを置きます。 注：アイスバケット温度で均質化の手順については、次の手順をすべて実行し、アイスバケットにすべてのバッファを保持します。 </li><li>ビーカーの中に骨格筋をみじん切り罰金scissを使用して3-4分間1〜2ミリメートル小片に（氷上で保持）ORS。 </li><li>氷冷分離バッファ（各20mL洗浄工程）で2回ビーカー内のみじん切り組織をすすいでください。 </li><li> 5 mgのプロテアーゼ/ g組織を含む組織重量（g）当たりの単離緩衝液の10体積の組織を一時停止します。 </li><li>マグネチックスターラー上で氷浴中でビーカーを置き、10分間攪拌します。 </li><li> 0.2％（重量/体積）の脱脂ウシ血清アルブミン（BSA）を補充した組織の重量（g）当り分離緩衝液の追加の10容量のビーカー中の懸濁液を希釈します。 </li><li> 0.2％BSAを補充した単離緩衝液のすべてをデカントし、0.2％BSA（20 mLを各洗浄工程）を補充した氷冷分離緩衝液で2回ビーカー中で組織をすすぎます。 </li><li>脱脂BSAと0.2％を補充した組織の重量（g）当り分離緩衝液の10体積の組織を再懸濁します。 </li><li>ゆったりと乳棒（10ストローク）で（氷上で保持）半自動ガラスホモジナイザーで組織をホモジナイズします。 注：Homogeniz同様に、常に電子組織（ストロークの同じ数、 例えば 、10ストローク）。ストローク数が多いほど、ミトコンドリアを損傷し、切り離すことができます。好ましくは、自動化されたホモジナイザーを用いて組織をホモジナイズします。手動で（および主観）ガラスホモジナイザーでホモジナイズした組織試料は、単離されたミトコンドリアの異なる品質を生成することができます。 </li><li>遠心分離機万×gで10分間4℃でホモジナイズした組織。 注：すべての遠心操作は固定角ローターと遠心機で実行されています。 </li><li> （10ミリリットル/ g組織）血清学的ピペットを用いて上清を捨て、BSAを補充した氷冷分離培地にペレットを再懸濁します。 </li><li>遠心分離機350×gで10分間4℃でサスペンション。 </li><li>血清学的ピペットを用いて上清を予約し、ペレット（細胞破片を）捨てます。 </li><li>細胞debrを除去するために、ガーゼの2層（17スレッド/ cm 2）を介して（氷上で保持）ビーカーに上清をフィルターです。 </li><li>遠心分離機7000×gで10分間4℃で懸濁液を濾過。 </li><li>上清を捨て、7000×gで10分間4℃で0.2％（重量/体積）BSAおよび遠心サスペンションを補充した単離緩衝液（5ミリリットル/ g組織）中の粗ミトコンドリアペレットを再懸濁。 </li><li>上清を捨て、洗浄緩衝液（表1）中の粗ミトコンドリアペレットを再懸濁。遠心分離機7000×gで10分間4℃で再びサスペンション。 </li><li>上清を捨て、7000 X gで10分間4℃で再び洗浄緩衝液および遠心分離中の懸濁液を、粗ミトコンドリアペレットを再懸濁。 </li><li>上清を捨て、洗浄緩衝液1.0mLの中の粗ミトコンドリアペレットを再懸濁。 </li><li>ミトコンドリア懸濁液のタンパク質濃度を決定し、氷上で濃厚ミトコンドリア懸濁液を保ちます。 注記：タンパク質濃度は、任意の標準的な方法を用いて測定することができます。 </li><li>直前アッセイ呼吸計測するために、0.4 mg / mlでミトコンドリアタンパク質の最終濃度に呼吸緩衝液中のミトコンドリア懸濁液を再懸濁します。 </li></ol> 2.高解像度の呼吸計測<ol><li>ピペット高解像度oxygraph室に呼吸緩衝液（ 表1）16の2.1 mL及び連続の安定した酸素フラックス信号まで1時間、37℃でチャンバ内に存在する磁気撹拌棒（700 rpm）を用いて緩衝液をかき混ぜますポーラログラフ酸素センサが得られます。 注：各oxygraph室内のポーラログラフ酸素電極は、酸素濃度を測定し、各チャンバー内の酸素消費量（フラックス）を計算します。酸素濃度と酸素消費速度（フラックス）は、データ収集および分析のためのソフトウェアを使用してコンピュータにオンラインでリアルタイムに表示されます。また、正確で信頼性のある結果を確保するために、楽器の酸素のバックグラウンド補正があるべきです製造業者の指示に従って行いました。 注：呼吸バッファの正確2.1 mLの栓を閉じた後、2.0 mLの最終チャンバ容積の較正のためのチャンバーに添加されます。 </li><li>製造業者のプロトコル17に従ってポーラログラフ酸素センサのエアキャリブレーションを実行します。 注意：空気校正の間、気相に存在して、メディアの酸素濃度は、15〜20分程度で平衡化します。温度、気圧、およびメディア - 酸素濃度の溶解度に応じて算出することができます。 </li><li>エアキャリブレーション後、oxygraph室から呼吸培地を吸引し、oxygraphのチャンバーにステップ1.24から単離されたミトコンドリア懸濁液（0.4 mg / mlでミトコンドリアタンパク質）の2.1 mLを加え。 注：呼吸バッファの容量が設定し、機器とメーカーによって異なります。高解像度の呼吸計測のために、呼吸府の2.1 mLのfferはストッパーを閉じた後、2.0 mLの最終チャンバ容積の較正のためのチャンバーに添加されます。 </li><li>ストッパーの挿入によってoxygraph室を閉じます。 </li><li>連続して37℃のチャンバ内に存在する磁気攪拌棒（700 rpm）を用いて、ミトコンドリア懸濁液を撹拌し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで、3〜5分間、ベースライン時に細胞呼吸を記録。 注：酸素濃度と酸素フラックス信号はデータ収集および分析17のためのソフトウェアを使用してコンピュータにオンラインでリアルタイムに表示されます。 </li><li>その後、以下の標準的なプロトコルを使用して、ストッパのチタン注入ポートを介してミトコンドリア呼吸の基質と阻害剤を注入します。 </li></ol> 3.複合体I-依存呼吸<ol><li>ステップ2.1から2.5に記載の手順に従って、単離されたミトコンドリア懸濁液（0.4ミリグラム/ ml）を含むoxygraph室を準備し、安定した信号を待ちます。 </li><li>チャンバーストッパーのチタン注入口から分離されたミトコンドリア懸濁液（0.4ミリグラム/ ml）を含むoxygraph室に0.8 Mリンゴ酸（5mMの最終濃度）の12.5μLと2 Mグルタミン酸（10mMの最終濃度）の10μLを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで、3〜5分間、細胞呼吸を記録。 注：以下の手順のすべての注射は注射器を使用してストッパーのチタン注入ポートを介して実行されます。 </li><li>チャンバーストッパーのチタン注入口からoxygraph室に0.05 M ADP（0.25ミリモル）の10μLを注入し、酸素フラックス信号が増加するまで、ミトコンドリア呼吸を記録し、その後減少し、安定化（3-5分）。 注：ADP添加後の呼吸の高原は、ADP濃度が高く、飽和したことを示しています。呼吸中に使用されるミトコンドリアの量に応じて、ADP濃度を滴定されるべきです安定した状態3の酸素消費量（最大呼吸）のために。ミトコンドリア懸濁液にADPの添加は、（状態3呼吸）を増加させる酸素消費量の増加及び酸素フラックスシグナルを誘発します。 ADPが消費された後、酸素フラックス信号は（状態4呼吸）が低くなります。 </li></ol> 4.複合体II依存の呼吸<ol><li>ステップ2.1から2.5に記載されており、安定した信号を待つ手順に従って、単離されたミトコンドリア懸濁液（0.4ミリグラム/ ml）を含むoxygraph室を準備します。 </li><li>注射器を用いてチャンバストッパーのチタン注入ポートを介してoxygraph室に0.2 mMのロテノン（0.2μM）「注意」の2μLを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで、3〜5分間、細胞呼吸を記録。 注：ロテノンは危険毒であり、ヒトの健康に重大な影響を有することができます。 </li><li> oxygraphのCHに1 Mコハク酸（10mMの）の20μLを注入アンバーと安定した酸素フラックス信号が達成されるまで、3〜5分間、ミトコンドリア呼吸を記録します。 </li><li>チャンバーストッパーのチタン注入口からoxygraph室に0.05 M ADP（0.25ミリモル）の10μLを注入し、酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録し、安定化、その後減少し、安定化（3-5分）。 注：ミトコンドリア懸濁液にADPの添加は、（状態3呼吸）を増加させる酸素消費量の増加及び酸素フラックスシグナルを誘発します。 ADPが消費された後、酸素フラックス信号は（状態4呼吸）が低くなります。 </li></ol> 5.複合体IV依存の呼吸<ol><li>手順プロトコルの2.5から2.1と安定した信号を待つに記載の手順に従って、単離されたミトコンドリア懸濁液を含むoxygraph室（0.4ミリグラム/ mL）を準備します。 </li><li>その後、0.8 mMのアスコルビン酸（1ミリモル）の2.5μLを注入。その直後に0.2の2.5μLを注入M TMPD（0.25ミリモル）および0.05 M ADP（0.25ミリモル）の10μLoxygraph室へと酸素フラックス信号が増加するまで、細胞呼吸を記録し、（3-5分）を安定化させます。 </li><li>最後にoxygraph室に1 Mアジ化ナトリウム（5 mM）の「警告」の10μLを注入し、酸素フラックス信号が減少するまで、細胞呼吸を記録し、安定化させます。 注：アジ化ナトリウムは危険毒であり、ヒトの健康に重大な影響を有することができます。 </li></ol> 6.チトクロームCテスト<ol><li>手順プロトコルの2.5から2.1と安定した信号を待つに記載の手順に従って、単離されたミトコンドリア懸濁液を含むoxygraph室（0.4ミリグラム/ mL）を準備します。 </li><li>チャンバーストッパーのチタン注入口から分離されたミトコンドリア懸濁液（0.4ミリグラム/ ml）を含むoxygraph室に0.8 Mリンゴ酸（5mMの最終濃度）の12.5μLと2 Mグルタミン酸（10mMの最終濃度）の10μLを注入し安定した酸素フラックス信号が達成されるまで、3〜5分間、細胞呼吸を記録。 </li><li>チャンバーストッパーのチタン注入口からoxygraph室に0.5 M ADP（2.5 mM）の10μLのを注入し、酸素フラックス信号が増加するまで、ミトコンドリア呼吸を記録し、その後減少し、安定化（3-5分）。 </li><li>最後に、oxygraph室に4mMのシトクロムc（10μM）の5μLを注入し、安定した酸素フラックス信号が達成されるまで5分間細胞呼吸を記録。 </li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

本研究において、我々は、無傷でしっかりこのような高解像度の呼吸計測等の機能的研究のために使用することができる差動遠心分離によって骨格筋のミトコンドリアを結合、高品質を単離するためのプロトコルを説明します。 無傷と密結合ミトコンドリアを単離するために、本プロトコル内で考慮すべきいくつかの重要なポイントがあります。骨格組織を採取した後、直ちに氷冷したミトコンドリアの単離緩衝液中に浸漬する必要があります。全ての遠心操作は4℃で行われるべきであり、ミトコンドリア懸濁液は、単離の間に氷の上に常に保たれるべきです。単離手順は、可能な限り迅速に行われるべきです。ホモジネートは、クリーン界面活性剤を含まない遠心管中で遠心分離されるべきです。手順の終わりに、ミトコンドリア懸濁液を濃縮保たれるべきであり、呼吸計測直前に希釈します。呼吸計測データは、第二のPEあたりピコモルとして表されているのでミトコンドリアタンパク質のRミリグラム、正確に分離した後、ミトコンドリアタンパク質の濃度を測定するために良好な技術を使用することが重要です。 いくつかのミト...

ミトコンドリア生体エネルギーと呼吸容量は透過性細胞または繊維ではなく、また、単離されたミトコンドリアだけでなく研究することができます。本研究では、高解像度の呼吸計測測定のために分画遠心法を用いて、無傷の骨格筋のミトコンドリアを単離するためのプロトコルを説明します。 呼吸計測のための完全なミトコンドリアを単離するために、組織が均質化され、ミトコンドリアは、従来の分画遠心法により単離されます。遠心分離法は、組織ホモジネートの連続遠心分離（増速の直列）に基づいて差は最初、ほぼ70年前に1 Palladeおよび共同研究者によって導入されました。組織は、最初にハサミを使って細かく刻み、ゆったり乳棒でガラスホモジナイザーで機械的に均質化されます。その後、ホモジネートを低速と切れ目のない組織が含まれている得られたペレットを、携帯で遠心分離され、破片および核は破棄されます。その後、上清を高速で数回遠心分離し、ミトコンドリア富化画分が回収されます。ミトコンドリアを単離するための差動遠心分離法の利点は、ということです：ⅰ）メソッドは高速であり、ミトコンドリアは（呼吸実験は可能な限り迅速として行われるべきである）1〜1.5時間以内に単離することができます。 ⅱ）それは安価です。そしてiii）それは非常に効率的であり、微分遠心分離によって得られたミトコンドリアは、呼吸計測分析のために十分に純粋です。ミトコンドリアを単離するための差動遠心分離法の欠点は、ⅰ）ミトコンドリアが均質化中に損傷し、非結合を受ける可能性があることです。 ⅱ）他の細胞成分とミトコンドリアの汚染は（）、さらに追加の遠心分離工程でミトコンドリアのペレットを洗浄することにより解決することができます。 ⅲ）差動遠心分離工程の間に、異なるミトコンドリア亜集団、 例えばを選択する可能性を、MIT下の密なとochondriaは7除外することができます。およびiv）ミトコンドリアの細胞周囲の不足しているとだけ理論的な最大の呼吸を測定することができます。呼吸計測分析のためにミトコンドリアを単離するための別の方法は、密度勾配遠心分離2です。この技術では、組織抽出物（遠心管の底部でのより高い密度を有する）スクロース溶液またはPercoll勾配の上に積層され、一定の速度で遠心分離し、ミトコンドリアが、それらに応じて、他の細胞成分から分離することを引き起こします密度。この方法は、多くの場合、シナプトソームから非常に低い汚染に脳ミトコンドリアを単離するために使用されます。しかしながら、密度勾配遠心分離によって単離されたラット肝ミトコンドリアは非常に他の細胞小器官3で汚染されています。この方法の制限の一つは、遠心分離管に存在するショ糖勾配がそう破裂かもしれないということです私ミトコンドリア（浸透圧ショック）。 組織の種類に応じ。差動遠心分離による無傷ミトコンドリアの単離のために考慮すべきいくつかの重要な要因があります。最初の必要性は穏やかな方法で組織を均質化することです。例えば、腎臓、脳や肝臓などの軟組織は、均質化の間に適用される穏やかな機械的な力を必要とします。これは、はるかに強い機械的な力を必要とし、心臓および骨格筋などの硬組織とは対照的です。細分化した組織は、通常、組織を柔らかくするために均質化前にプロテアーゼで処理されます。均質化および遠心分離の間に使用されるすべての緩衝液は、冷たい氷であると細胞質ゾル4、5と互換性のイオン性及び浸透強度と生理的に適切なpHを有していなければなりません。 分離されたミトコンドリアの生体エネルギーを研究する利点の一つは、細胞形質膜はpermeabiである必要はないということですこのようなミトコンドリア外膜の完全性を損なう可能性がありますジギトニンまたはサポニン4、6、などの界面活性剤とlized。単離ミトコンドリアの別の利点は、酸素消費量としてミトコンドリアの機能の分析を妨害し得る他のサイトゾル因子の欠如です。単離されたミトコンドリアを用いての欠点は、単離されたミトコンドリア7,8の良好な収率を得るために遠心分離工程中のあるミトコンドリアの集団の可能な選択、均質化の間にミトコンドリアの損傷、および生物学的サンプルの大量の要求です。 分離手順の後、ミトコンドリア複合体I、II-IV及び依存（状態2,3および4）の呼吸速度は、高解像度の呼吸計測を使用して決定されます。複合体I-駆動呼吸のために、グルタミン酸リンゴ酸は、アデノシン二リン酸（ADP）を加え、続いています。複合体II駆動型の呼吸のために、コハク酸は、ADPを添加し、続いています。複雑なIV-駆動呼吸については、アスコルビン酸及びtetramethylphenylendiamine（TMPD）はADP 9、10、11、12、続いて添加されます。状態2は、単独で、基質の存在下での酸素消費量を指します。状態3は、基板と、ADPの存在下での酸素消費量を指します。状態4は、ADPの枯渇後の酸素消費量を指します。呼吸調節比（RCR）は、酸素消費量のATP生産の結合の指標であり、状態3及び状態4 13、15との間の比として計算されます。 要約すると、我々は、差動遠心分離により、機能と無傷の骨格筋のミトコンドリアを単離し、これらの単離されたmitochonを使用するプロトコルを記述しますこのような高解像度の呼吸計測などの機能や生体エネルギー研究のためdria。

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>シグマ</td><td>A 4386</td><td>化学</td></tr><tr><td>アンチマイシンA</td><td>シグマ</td><td>A 8674</td><td>化学、エタノールに溶解</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>メルク</td><td>1.00127</td><td>化学</td></tr><tr><td>ATP</td><td>シグマ</td><td>A 7699</td><td>化学</td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ</td><td>A 6003</td><td>化学</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>フルーカ</td><td>3779</td><td>化学</td></tr><tr><td>グルタミン酸</td><td>シグマ、</td><td>G 1626</td><td>化学</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H 7523</td><td>化学</td></tr><tr><td>KCl</td><td>メルク</td><td>1.04936</td><td>化学</td></tr><tr><td>KH2PO4</sub</td><td>>Merck</td><td>1.04873</td><td>化学</td></tr><tr><td>K-ラクトビオネート</td><td>Σ</td><td>L 2398</td><td>化学</td></tr><tr><td>MgCl2</</td><td>sub>Sigma</td><td>M 9272</td><td>化学</td></tr><tr><td>モルホリノプロパンスルホン酸 (MOPS)</td><td>Merck</td><td>1.06129</td><td>化学</td></tr><tr><td>O2k-コア: Oxygraph-2k&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>高解像度呼吸測定器</td></tr><tr><td>プロテイナーゼ、細菌</td><td>Sigma</td><td>P 8038</td><td>化学</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S2002</td><td>化学</td></tr><tr><td>ロテノン</td><td></td><td>ΣR 8875</td><td>化学、エタノールに溶解</td></tr><tr><td>コハク酸</td><td>Σ S</td><td>2378</td><td>化学</td></tr><tr><td>Schuett homogen-plus半自動ホモジナイザー&nbsp;</td><td>schuett-biotec GmbH</td><td>3.201 011</td><td>組織ホモジナイザー</td></tr><tr><td>タウリン</td><td>Sigma T</td><td>8691</td><td>化学</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Σ T</td><td>3134</td><td>化学</td></tr></tbody></table>

高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

ミトコンドリアは細胞のエネルギー代謝に関与しており、酸素を使用してアデノシン三リン酸(ATP)の形でエネルギーを生成します。低速および高速の分画遠心分離は、組織や培養細胞からミトコンドリアを単離するために一般的に使用されます。示差遠心分離によって得られた粗ミトコンドリア画分は、呼吸測定に使用されます。示差遠心分離技術は、細胞小器官のサイズと沈降速度に応じた細胞小器官の分離に基づいています。ミトコンドリアの単離は、組織採取直後に行われます。組織を氷冷均質化培地に浸し、ハサミを使用してミンチにし、ゆるめの乳棒を備えたガラスホモジナイザーで均質化します。分画遠心分離技術は効率的、高速、安価であり、分画遠心分離によって得られるミトコンドリアは、呼吸測定アッセイに十分な純度です。分画遠心分離に基づく単離ミトコンドリアの限界と欠点のいくつかは、均質化および単離手順中にミトコンドリアが損傷を受ける可能性があること、およびミトコンドリアの単離に大量の組織生検または培養細胞が必要であることです。

複合体I-依存呼吸 単離されたミトコンドリア複合体I依存呼吸数（状態2、図3、図4）は、高解像度の呼吸計測（ 図1、代表的な図）を用いて決定されます。ミトコンドリア複合体I基板、グルタミン酸とリンゴ酸は、ADPを加え、続いています。状態2は、単独で、基質の存在下での酸素消費量を指します。状態3は、基板と、ADPの存在下での酸素消費量を指します。状態4は、ADPの枯渇後の酸素消費量を指します。 RCRはATP生産に酸素消費の結合の指標であり、 図1に示すように、状態3及び状態4の間の比として計算される、ADPを添加すると、直ちにミトコンドリア呼吸速度が上昇する（状態3呼吸）、およびその後、非常にsのレベルに（状態4呼吸）を減少させますこれは、高RCRを示し、ミトコンドリアの完全性がよく分離手順中に保存される状態2の場合とimilar。 ...

ここでは、麻酔をかけたブタから大腿四頭筋の標本を採取し、ミトコンドリアを分画遠心分離によって分離します。次に、ミトコンドリア呼吸鎖複合体I、II、およびIVの呼吸数を高解像度呼吸測定を使用して決定します。

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

本手順の全体的な目的は、差速遠心法を用いて骨格筋ミトコンドリアを単離し、ミトコンドリア呼吸鎖複合体I、IIおよびIVの呼吸速度を測定することです。この手法は、多様な神経疾患、敗血症、加齢に伴う疾患など、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患や症候群といった、ミトコンドリアバイオエナジェティクス分野における重要な課題の解明に寄与します。本技法の主な利点は、単離されたミトコンドリア調製物において、ミトコンドリア機能の解析を妨げる可能性のある細胞学的因子の大部分が排除されていることです。手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるSandra Nansozが行います。本手順を開始するために、テキストプロトコルに記載されている通り、骨格筋サンプルの入ったビーカーを用意します。ビーカーをアイスバケットに置きます。精密剪刀を用いて、筋肉を1〜2 mmのサイズに細かく刻みます。次に、刻んだ組織を氷冷した分離バッファーで2回、1回あたり20 millilitersを使用して洗浄します。洗浄した組織を組織1gあたり10 millilitersの分離バッファーに懸濁させ、さらに5 milligramsのprotease-G tissueを添加します。その後、ビーカーをマグネチックスターラーを備えた氷浴に入れ、10分間攪拌します。その後、組織1gあたり0.2%脱脂BSAを添加した単離緩衝液をさらに10ml加えて、懸濁液を希釈します。次に、ビーカーから単離緩衝液をすべて捨てます。0.2%BSAを添加した氷冷単離緩衝液を1回につき20ml使用し、組織を2回洗浄します。次に、組織1gあたり10 mLのBSA添加分離バッファーを用いて組織を再懸濁します。緩い適合のペッスルを備えた半自動ガラスホモジナイザーを使用して、組織をホモジナイズします。続いて、ホモジナイズ液を遠心管に移し、4°Cで10,000 ×gにて10分間遠心分離します。セロロジカルピペットを使用して、上清を除去します。組織1gあたり10mLの氷冷BSA添加分離培地を用いて、ペレットを再懸濁します。懸濁液を4°Cで350×g、10分間遠心分離します。その後、セロロジカルピペットを使用して上清を回収し、ペレットを廃棄します。回収した上清を、氷上に置いたビーカーに2層のガーゼを通してろ過します。ろ過した懸濁液を遠心チューブに移し、4 °Cで7,000 ×gで10分間遠心分離します。次に、上清を捨てます。粗ミトコンドリアペレットを、組織1gあたり5mLのBSA添加分離バッファーで再懸濁します。この懸濁液を4°Cで10分間、7,000×gで遠心分離します。次に、上清を捨て、ペレットを20 millilitersの洗浄緩衝液で再懸濁します。4 °Cで10分間、7,000 ×gで遠心分離します。この再懸濁および遠心分離の工程をもう一度繰り返します。その後、上清を捨て、ペレットを1 mLの洗浄バッファーで再懸濁します。標準的な方法を用いてタンパク質濃度を決定してください。その後、濃縮したミトコンドリア懸濁液を、呼吸能測定アッセイに用いるまで氷上で保持します。まず、ミトコンドリア濃縮液を呼吸バッファーで再懸濁し、ミトコンドリアタンパク質の最終濃度を0.4 mg/mLにします。次に、空気校正済みのオキシグラフチャンバーから呼吸培地を吸引除去します。ここに、単離したミトコンドリア懸濁液を2.1 mL加えます。ストッパーを挿入してオキシグラフチャンバーを密閉します。次に、ミトコンドリア懸濁液を37 °Cで700 RPMで連続的に撹拌します。安定した酸素フラックス信号が得られるまで、3〜5分間ベースラインの細胞呼吸を記録します。複合体I依存的な呼吸を開始させるため、分離したミトコンドリア懸濁液を調製したオキシグラフチャンバーに、ストッパーのチタン製注入ポートを通して0.8 molarのリンゴ酸を12.5 microliters注入します。次に、2 molarのグルタミン酸を10 microliters注入します。酸素フラックスの信号が安定するまで、3〜5分間細胞呼吸を記録します。その後、注入ポートを通じて0.05 molar ADPを10 µL注入します。酸素フラックスの信号が上昇し、その後低下して安定するまで、細胞呼吸を記録します。複合体II依存性呼吸については、単離ミトコンドリア懸濁液を調製したオキシグラフチャンバーに、0.2 millimolar rotenoneを2 µL注入します。安定した酸素フラックス信号が得られるまで、細胞呼吸を記録します。その後、1 Mコハク酸を20 µL注入します。さらに、安定した酸素フラックス信号が得られるまで細胞呼吸を記録します。その後、注入ポートを通じて0.05 molar ADPを10 µLチャンバー内に注入します。酸素フラックスのシグナルが上昇し、その後低下して安定するまで細胞呼吸を記録します。複合体IV依存性呼吸については、単離ミトコンドリア懸濁液を調製したオキシグラフチャンバーに0.8 millimolar アスコルビン酸を2.5 µL注入します。次に、0.2 MのTMPDを2.5 µL、0.05 MのADPを10 µL直ちに注入します。酸素フラックスの信号が安定するまで、細胞呼吸を記録します。その後、1 Mのアジ化ナトリウムを10 µL注入します。酸素フラックス信号が減少し、その後安定するまで細胞呼吸を記録します。本研究では、骨格筋から完全なミトコンドリアを単離します。その後、高解像度レスピロメトリーを用いて、複合体I依存的な呼吸速度を測定します。見ての通り、ADPの添加直後にミトコンドリアの呼吸速度が上昇します。ADPが枯渇すると、呼吸速度はADP添加前と同様のレベルまで低下します。これは、呼吸制御比（RCR）として知られる状態3と状態4の比が高いことを示しており、分離手順においてミトコンドリアの完全性が良好に維持されていることを意味します。次に、ロテノンを用いて複合体I依存的な呼吸を抑制し、複合体IIの基質であるコハク酸を注入することで、複合体II依存的な呼吸速度を観察します。その後、ADPを添加すると、呼吸速度が即座に上昇します。ADPが枯渇すると、呼吸速度はADP添加前と同様のレベルまで低下します。これはRCRが高いことを示しており、分画過程においてミトコンドリアの完全性が十分に保持されていることを意味します。アスコルビン酸、TMPD、およびADPを添加することで、複合体IV依存性の呼吸速度を測定します。次に、複合体IVを阻害するためにアジ化ナトリウムを添加します。アジ化ナトリウム添加前後の酸素消費量の差を、真の複合体IV呼吸として解釈します。ステート3において高い複合体IV依存性呼吸速度が観察されることは、分離手順中にミトコンドリアの完全性が良好に保持されていたことを示しています。この手法を習得すれば、適切に実施した場合、1時間半以内に完了させることができます。本手順を行う際は、ホモジナイズの前にあらかじめ酸素センサーの校正を行うことが重要です。本手順に続き、細胞内ADP量、ミトコンドリア膜電位、ATP合成酵素の酵素活性、基質レベルなどの測定といった他の手法を実施することで、呼吸速度の変化がミトコンドリア基質の不足、膜電位、あるいはATP合成酵素の酵素活性の低下によるものかといった追加の疑問を検証することが可能です。このビデオを視聴することで、分画遠心法を用いて骨格筋からミトコンドリアを単離する方法と、高解像度レスピロメトリーを用いてミトコンドリア複合体I、II、およびIVの呼吸速度を測定する方法について、十分に理解することができます。この技術の開発により、ミトコンドリアエネルギー代謝分野の研究者が、遺伝性ミトコンドリア疾患、ミオパチー、単離ミトコンドリアにおける虚血再灌流障害などの分野で、ミトコンドリアのエネルギー機能を探索することが可能になりました。アンチマイシンA、ロテノン、アジ化ナトリウム、およびFCCPを取り扱う際は、極めて危険であることに十分注意してください。また、本手順の実施中は、手袋や白衣の着用などの予防措置を常に講じる必要があります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、骨格筋から単離したミトコンドリアの呼吸を研究するための手順を説明します。このメソッドは、Scorranoから翻案されました...

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高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

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