MALDIイメージングマススペクトロメトリーのためのラット脳組織におけるガングリオシドの検出と可視化のためのDANマトリックスの昇華

この昇華プロトコルの全体的な目標は、MALDIイメージング質量分析実験におけるガングリオシドの検出のために、詳細でわかりやすいサンプル調製プロセスを提供することです。この方法は、健康な脳と脳の病理学の両方におけるガングリオシドの解剖学的分布と機能など、神経生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、多くの脂質種の高品質なイメージングに適合させることができ、プロトコルの変更が少ないことです。

この手順を開始するには、ラットから脳組織を抽出し、テキストプロトコルに記載されているようにクライオスタットの準備をします。次に、組織をクライオスタットに配置します。組織を目的の解剖学的位置まで切片

切断厚さが8〜12ミクロンであることを確認してください。クライオスタットのアンチロールバーを使用して、平らにした組織切片をゆっくりと切片化します。ティッシュに穴やマーキングができるのは、ロールバーの配置が間違っていたり、ブレードが鈍い場合です。

きれいなペイントブラシを使用して、ティッシュをスライスプラットフォームの中央に移動します。組織をマッピングするには、導電性スライドまたは金属プレートをスライスしながらクライオスタットに配置して凍結します。スライドが完全に凍結したら、清潔なペイントブラシを使用して、切片組織をスライドの導電性サービスに慎重に移動します。

すべての組織切片がスライド上に正しく配置されたら、組織の反対側のスライドの下に指を置き、切片が溶けるまで押します。次に、ティッシュを入れたスライドをデシケーターに5〜10分間置きます。または、温かいスライドを使用して、導電性側を下にして、平らにした組織切片に軽く押し付けます。

ヒュームフードで作業し、アルミニウム容器に入った砂浴をホットプレートの上に置きます。ホットプレートは、適切な表面積の金属製のシザーリフト上にある必要があります。ホットプレートの電源を入れ、温度を摂氏140度に設定します。

温度フィードバックプローブを使用して、実験全体を通して砂の温度を監視し、温度の一貫性を確保します。次に、昇華装置の底面に300ミリグラムのDANマトリックスを置きます。装置の中央に均一な層にマトリックスを広げ、昇華されるスライドのおおよその幅と長さに広げます。

装置の内面に金属プレートを置き、プレートがコンデンサーの底部に直接接触します。ブランクのテストスライドを金属板の表面を斜めに横切ってテープで固定し、スライドの外縁にテープを貼ります。装置の上部と下部を中央のゴム製Oリングで接続して、完全に密閉します。

装置の中央に金属製のUジョイントを配置し、装置の上半分と下半分がしっかりと密閉されるまでバイスを締めます。次に、装置を砂浴の周りの金属製Oリングに配置します。次に、一握りの砕いた氷をコンデンサーに入れます。

コンデンサーの4分の1から半分を冷水で満たして、氷のスラッシュを作ります。氷のスラッシュは、装置の内側の金属板を冷却し、続いてスライドがそれに付着します。温度が安定した状態に達するまで、少なくとも 5 分待ちます。

次に、コールドトラップ容器に300mLのメタノールを注ぎ、ガラス器具を容器に入れます。真空ポンプをゴムチューブを使用してコールドトラップ出力に接続します。別のゴムチューブを使用して、コールドトラップ入力を昇華装置に接続します。

チューブが金属クランプを使用してしっかりと固定されていることを確認してください。真空ポンプを使用して、30〜50ミリトーの真空を供給します。圧力平衡化のために、ポンプを少なくとも5分間稼働させます。

コールドトラップコンテナの底にあるエタノールにドライアイスの2〜3個の小片を落とします。コールドトラップは、マトリックス粒子が真空ポンプに蓄積するのを防ぐのに役立ちます。昇華装置のUリングのバイスは、装置内の圧力が低下したため、真空ポンプをオンにした後、締める必要がある場合があります。

砂浴の温度が摂氏140度で安定していることを確認します。また、バキュームがオンになっていること、および装置がすべてのチューブが接続された状態で砂浴の上の金属製Oリングに固定されていることを確認してください。タイマーを 7 分に設定しますが、タイマーは開始しないでください。

昇華器のUジョイントが金属製のOリングのかなり上に来るまで、シザーリフトと砂浴を昇華装置までゆっくりと上げます。この余分なスペースにより、砂の上で装置を調整することができます。昇華器を砂の表面にそっと押して、装置が砂の上に均等に座っていることを確認します。

そして、すぐにタイマーを開始します。タイマーが鳴ったら、真空ポンプをオフにし、昇華器が砂浴に触れなくなり、金属製のOリングにしっかりと座るまで、シザーリフトを慎重に下げます。マイクロベントバルブをゆっくりと緩めて、装置内の圧力を解放します。

昇華装置のゴムチューブの周りの金属クランプを緩め、ゆっくりとチューブを緩め始めます。ゴムチューブを少し緩めたら、チューブを片側に曲げて残留圧力を逃がします。周囲圧力が戻ったら、昇華装置からゴムチューブを慎重に取り外します。

次に、装置のUジョイントの万力を緩めて取り外します。昇華装置の2つの半分を慎重に分離し、内側のガラス器具の上部からスライドを引き抜きます。スライドを調べて、マトリックスの分布が均一であることを確認します。

昇華するマトリックスの分布と量が十分な場合は、昇華器の内側に組織を含む新しいスライドをテープで貼り付け、昇華プロセスを繰り返します。テキストプロトコルで説明されているように、イメージングと分析の実行に進みます。質量スペクトルは、1000〜2000の質量範囲内のイオン性の存在量を示す陽極質を示します。

主要なAシリーズガングリオシドは、スペクトルに沿ってラベル付けされています。ここに示されているのは、ラットの脳内のガングリオシドの対応する分子像です。分子画像は、ImageJソフトウェアを使用してオーバーレイおよび疑似着色された色分けを通じて、いくつかのガングリオシド種の解剖学的分布を示しています。

一般に、この方法に不慣れな人は、サンプル調製プロセスに多くの変数があり、IMSの結果の品質に影響を与える可能性があり、報告されたプロトコルからは除外されることが多いため、苦労する可能性があります。この手順を試行する際は、各実験後に昇華されるマトリックスの量を監視し、スライドに応じて昇華時間を変更することを忘れないでください。その開発後、この技術は、研究者が脳損傷、ネルジョン病、および自然な老化プロセス後のガングリオシドなどの膜脂質の役割を探求する道を開きました。

この方法は、脳内の脂質の存在量と解剖学的分布についての洞察を提供するだけでなく、脳外の組織や植物や昆虫のモデルなど、他のシステムにも適用できます。損傷した根での作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、手袋、マスク、目の保護具などの予防策を常に講じる必要があります。