Name: ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 学ぶSPLASH法によるin vivoでのゲノム規模RNA-RNA相互作用マッピング。ビオチン化ソラレン架橋と高通量シーケンスを用いて、酵母やヒト細胞など多様な生物におけるRNA相互作用動態を網羅的に解析する手法です。

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私たちはWanラボとNagarajanラボのメンバーに有益な議論をしてくれたことに感謝します。 N.NagarajanはA * STARからの資金提供を受けています。 Y.WanはA * STARとSociety of Science-Branco Weiss Fellowshipからの資金援助を受けています。

<ol><li>Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+transcriptome+through+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">Understanding the transcriptome through RNA structure.</a> Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).</li>
<li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Measurement+of+RNA+Folding+Energies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies.</a> Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).</li>
<li>Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+RNA+structure+using+nuclease+digestion+and+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing.</a> Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).</li>
<li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li>
<li>Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking%2C+ligation%2C+and+sequencing+of+hybrids+reveals+RNA-RNA+interactions+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).</li>
<li>Sugimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hiCLIP+reveals+the+in+vivo+atlas+of+mRNA+secondary+structures+recognized+by+Staufen+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1.</a> Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).</li>
<li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-RNA+interactions+enable+specific+targeting+of+noncoding+RNAs+to+nascent+Pre-mRNAs+and+chromatin+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites.</a> Cell. 159 (1), 188-199 (2014).</li>
<li>Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+determination+of+RNA+structure+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation.</a> Nat.Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Duplex+Map+in+Living+Cells+Reveals+Higher-Order+Transcriptome+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure.</a> Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).</li>
<li>Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Mapping+of+Human+RNA-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions.</a> Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).</li>
<li>Aw, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Mapping+of+Eukaryotic+RNA+Interactomes+Reveals+Principles+of+Higher-Order+Organization+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation.</a> Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).</li>
</ol>

著者は競合する金銭的利益を有していない。

ここでは、我々は、ゲノムワイドの方法でペアワイズRNA相互作用を同定することを可能にする方法であるSPLASHの実験的および計算的ワークフローを詳細に記述する。我々は、細菌、酵母およびヒトの培養物においてSPLASHを首尾よく利用し、この戦略が異なる細胞状態下の多様な生物に広く適用され得ることを予測する。プロトコールの重要なステップの1つは、下流のプロセスに適した材料を得るために少なくとも20μgの架橋RNAで開始することです。次いで、RNAを100塩基に断片化し、PAGEサイズ選択する。これらの工程は、ライブラリー生成プロセス中のモノマーではなく、連結キメラを優先的に濃縮するために重要である。我々は、典型的には、断片化および最初のサイズ選択の後に、約1.5μgのRNAを回収し、次いでSPLASHワーク​​フローに従ってRNAをcDNAライブラリーに変換する。我々は、RNAのこの量は、我々がh15サイクル未満のPCR増幅を用いたハイスループット配列決定。 PCRサイクルの増加に伴ってPCR複製事象の数が劇的に増加するにつれて、増幅サイクル数を低く保つことは、下流分析において有用でユニークなキメラを抽出することが不可欠である。 <...

巨大分子が互いにどのように折り重なり相互作用するかを研究することは、細胞内の遺伝子調節を理解するための鍵である。 DNAおよびタンパク質がどのようにして遺伝子調節に寄与するかを理解することに多くの努力が集中してきたが、遺伝子発現の転写後調節については比較的少ない。 RNAは、その直鎖配列およびその二次および三次構造の両方で情報を運ぶ。 インビボでのその機能にとって、それ自体および他のものと塩基対形成するその能力は重要である。ハイスループットRNAの二次構造のプロービングにおける最近の進歩は、トランスクリプトーム2,3,4,5,6,7,8、howeにおける二本鎖および一本鎖領域の位置についての貴重な洞察を提供しているペアリング対話パートナーに関するver情報はまだほとんど失われています。どのRNA配列がトランスクリプトーム内の別のRNA領域と相互作用しているかを決定するために、我々は全体的なペアワイズ情報を必要とする。 グローバルで偏りのない方法でペアワイズRNA相互作用をマッピングすることは、伝統的に大きな課題でした。これらの技術は、CLASH9、hiCLIP10およびRAP11のような従来のアプローチが大規模な方法でRNA相互作用を同定するために使用されるが、典型的には、特定のタンパク質またはRNA種と相互作用するRNAのサブセットについてRNA塩基対をマッピングする。包括的なRNA相互作用を研究する最近の進展には、 インビボで RNA相互作用を安定化させず、したがってインビボ相互作用のサブセットのみを捕捉する方法RPL12が含まれる。これらの課題を克服するために、我々と他の研究者は、p RNAインターロイムをインビボで使用することにより、架橋ソラレン13,14,15の修飾バージョンを使用した。このプロトコールでは、 インビボで塩基対形成RNAを架橋するためにビオチン化ソラレンを使用し、続いて近接ライゲーションおよびハイスループット配列決定を行うP soralen架橋、ライゲート、およびS選択HYBRIDES（SLH）のS equencingを行うための詳細を記載する。ゲノムワイドのRNA塩基対形成パートナーを同定する（ 図1 ） 15 。 この原稿では、我々は培養接着細胞、この場合はHeLa細胞を使用してSPLASHを実行するための手順を説明します。同じプロトコールは、懸濁哺乳動物細胞および酵母および細菌細胞に容易に適合させることができる。簡単に述べると、HeLa細胞をビオチン化ソラレンで処理し、インビボで相互作用するRNA塩基対を架橋するために365nmで照射する。次いでRNAを細胞から抽出し、断片化し、ストレプトアビジンビーズを用いて架橋領域を豊富にする。次いで、相互作用するRNA断片を近接ライゲーションを用いて一緒にライゲーションし、深い配列決定のためのcDNAライブラリーに作製する。配列決定の際に、キメラRNAをトランスクリプトーム/ゲノムにマッピングして、互いに対形成するRNA相互作用領域を同定する。我々は、snoRNAs、lncRNAsおよびmRNAなどのRNAの多様なクラスにおける分子内および分子間RNA塩基対形成、構造の組織化および相互作用パターンを俯瞰するなど、酵母および異なるヒト細胞におけるインビボでの何千ものRNA相互作用を同定するためにSPLASHを首尾よく利用した細胞内のRNAの量。

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10787026</td><td>DNA ladder</td></tr><tr><td>10 bp DNA ladder</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10821-015</td><td>DNA ladder</td></tr><tr><td>20% SDS solution</td><td>First BASE</td><td>BUF-2052-1L&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>ファーストベース</td><td>BUF-3050-20X1L</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M酢酸ナトリウム溶液</td><td>ファーストベース</td><td>BUF-1151-1L-pH5.2&nbsp;&nbsp;</td><td>核酸沈殿に必要</td></tr><tr><td>40% アクリルアミド/Bis 溶液、19:1</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610145</td><td>TBE 尿素ゲル成分</td></tr><tr><td>Ambion Buffer Kit Life</td><td>Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム、分子グレード&nbsp;&nbsp;</td><td>プロメガ</td><td>V3131&nbsp;</td><td>TBE尿素ゲル成分</td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>メルク</td><td>1.02445.1000</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>一本鎖DNAリガーゼ</td><td>エピセンター</td><td>CL9025K</td><td>CircLigase II ssDNAリガーゼ</td></tr><tr><td>遠心分離管フィルター</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8160-96EA</td><td>Costar Spin-X遠心分離管フィルター</td></tr><tr><td>D5628-1G ジギトニン結晶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628-1G</td><td>細胞治療用</td></tr><tr><td>Dark Reader トランスイルミネーター&nbsp;</td><td>クレアケミカルリサーチ</td><td>ダークリーダーDR89Xトランスイルミネーター</td><td>青色光トランスイルミネーターDNA</td></tr><tr><td>ゲルローディング染料(6x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>R0611</td>ア<td>ガロースゲルエレクトロポレーションに必要</td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム</td><td>パンバイオテクノロジーP04-03500</td><td></td>ヘ<td>ラ細胞培養</td></tr><tr><td>用ストレプトアビジン磁気ビーズ</td><td>ライフテクノロジーズホールディングスPte Ltd</td><td>65002</td><td>ダイナビーズMyOneストレプトアビジンC1&nbsp;</td></tr><tr><td>15用マグネットスタンド&nbsp;mLチューブ</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12301D</td><td>DynaMag-15</td></tr><tr><td>15用マグネットスタンド&nbsp;mL</td>チューブ <td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000.015</td><td>Eppendorf ThermoMixer&nbsp;C</td></tr><tr><td>ビオチン化ソラレン</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>29986</td><td>EZ-Link ソラレン-PEG3-ビオチン</td></tr><tr><td>F8T5/BL&nbsp;</td><td>日立</td><td>F8T5/BL&nbsp;</td><td>365 nm UV電球</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10270106&nbsp;&nbsp;</td><td>ヘラミディアムのコンポーネント</td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>プロメガ</td><td>H5052&nbsp;&nbsp;</td><td>ハイブリダイゼーションバッファーの成分</td></tr><tr><td>G8T5</td><td>三共電機</td><td>G8T5</td><td>254 nm UV 電球</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10814010</td><td>核酸沈殿に必要</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Life Technologies Pte Ltd</td><td>Nanodrop 2000</td><td>核酸定量用分光光度計</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水&nbsp;</td><td>ファーストベース</td><td>BUF-1180-500ml&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン&nbsp;&nbsp;</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15140122&nbsp;&nbsp;</td><td>ヘラミディアムのコンポーネント</td></tr><tr><td>ハイフィデリティDNAポリメラーゼ(2倍)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>F531L&nbsp;</td><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) (英語)</td></tr><tr><td>プライマーセット1</td>ニュー<td>イングランドバイオラボ</td><td>E7335L&nbsp;</td><td>PCRプライマー</td></tr><tr><td>DNAゲル抽出キット</td><td>QIAgen</td><td>28106</td><td>QIAquickゲル抽出キット</td></tr><tr><td>蛍光定量キット</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Q32854</td><td>Qubit dsDNA HSアッセイキット</td></tr><tr><td>RNAクリーンアップキット</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNeasyミニキット シリカ膜カラム</td></tr><tr><td>Rnase阻害剤</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM2696</td><td>SUPERase In</td></tr><tr><td>逆転写酵素</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>18080400</td><td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix</td></tr><tr><td>Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>S11494</td><td>SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL</td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>End repair enzyme</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td>酵素近接ライゲーション</td></tr><tr><td>T4 RNA リガーゼ 2, 切断 KQ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0373L</td><td>アダプターライゲーション用酵素</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>TBE 尿素ゲル成分</td></tr><tr><td>グアニジニウム チオシアン酸フェノール-クロロホルム</td><td>Life Technologies Pte Ltd</td><td>15596018</td><td>TRIzol&reg;RNA抽出用</td></tr><tr><td>試薬 尿素</td><td>First Base</td><td>BIO-2070-5kg&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>UVクロスリンカー</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>UV Stratalinker 1800</td></tr><tr><td>UVトランスイルミネーター</td><td>UVP</td><td>95-0417-01</td><td>バンドの視覚化用</td></tr><tr><td>キシレンシアノールFF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>DNAクリーンアップ それ</td><td>Zymo Research&nbsp;</td><td>D4004</td><td>ザイモDNA濃縮器-5&nbsp;</td></tr><tr><td>必要なソフトウェアのリスト</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastQCソフトウェア</td><td>0.11.4</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td></tr> <tr><td>SeqPrepソフトウェア</td><td>1.0.7</td><td>https://github.com/jstjohn/SeqPrep</td><td></td></tr><tr><td>BWAソフトウェア</td><td>0.7.12</td><td>http://bio-bwa.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>SAMTOOLSソフトウェア</td><td>1.2.1</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr> <tr><td>PULLSEQ ソフトウェア</td><td>1.0.2</td><td>https://github.com/bcthomas/pullseq</td><td></td></tr><tr><td>STAR ソフトウェア</td><td>2.5.0c</td><td>https://github.com/alexdobin/STAR</td><td></td></tr><tr><td>rem_dups.py PYTHON スクリプト</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>find_chimeras.py PYTHON スクリプト</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td></td><td></td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</tr><tr><td>pickJunctionReads.awk AWK スクリプト</td><td>AWK GNU 4.1.2</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>Buffer composition</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elution buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.3 M sodium acetate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>ビーズ<td></td><td></td><td></td>を<td>洗う場合を除き、使用前に必ずスーパーアーゼインを新鮮に添加</td></tr><tr><td>Proteinase K Buffer&nbsp;</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>750 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15% ホルムアミド (暗所 4 °C;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>使用</td><td></td><td></td><td></td>前に必ずSuperase-inを新鮮に添加</tr><tr><td>してください2x SSC Wash Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x NaClおよびクエン酸ナトリウム(SSC)(20x SSC Invitrogenストックから希釈)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x RNAフラグメンテーションバッファー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM Tris-Cl pH 8.3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x RNA loading Dye</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% Formamide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.02% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.02% ブロモフェノールブルー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.01% キシレンシアノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4">3' RNA アダプター配列: 
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC</td></tr><tr><td colspan="4">RTプライマー配列: 
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCCTATTATTGATGGTGCCTACAG</td></tr></tbody></table>

ビオチン化ソラレンを用いたrna-rna相互作用のマッピング

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

RNAがどのように相互作用するかを知ることは、細胞内のRNAベースの遺伝子調節を理解する上で重要です。マイクロRNA-mRNA相互作用のようなRNA-RNA相互作用の例は、遺伝子発現を調節することが示されているが、細胞内でRNA相互作用が起こる全範囲は未だ不明である。 RNA相互作用を研究する以前の方法は、主として、特定のタンパク質またはRNA種と相互作用するRNAのサブセットに焦点を当てていた。ここでは、 in vivoでのRNA相互作用のゲノムワイドな捕獲を可能にする、 P soralen架橋、 L鎖、およびS選択H鎖のS equencingと呼ばれる方法を詳述します（SPLASH）。 SPLASHは、インビボでの架橋、近接ライゲーション、ハイスループットシーケンシングを利用して、分子内および分子間のRNA塩基対形成パートナーを世界的に同定します。 SPLASHは、細菌、酵母およびヒト細胞を含む様々な生物に適用することができ、同様に多様な細胞の状況下でのRNA構成のダイナミクスの理解を促進するための多様な細胞条件を提供する。実験的SPLASHプロトコル全体は完了までに約5日間かかり、計算ワークフローは完了するまでに約7日間かかります。

図1に、SPLASHワーク​​フローの図を示します。 0.01％ジギトニンの存在下でビオチン化ソラレンを添加し、UV架橋すると、全RNAが細胞から抽出され、RNAにビオチン化された架橋が効率的に起こったことを確実にするためにドットブロットが行われる（ 図2 ）。本発明者らは、細胞に添加するビオチン化ソラレンの量を滴定するための陽性対照としてビオチン化20塩基オリゴを使用し、150塩基ごとに約1個が架橋されるようにする。 より多くのPCR複製事象がPCR増幅サイクルの増加に伴って生じる傾向があるので、我々は、深刻な配列決定に十分な物質を提供する増幅サイクルの最低数を決定するために、異なるPCRサイクルを用いて小規模PCR増幅を行う。効率的な図書館の準備プロセスでは、15サイク...

ここでは、 in vivoでの分子内および分子間のRNA-RNA相互作用のゲノムワイドなマッピングを可能にする、 P soralen架橋、 L鎖およびS選択H鎖のS equencingの方法を詳述します（SPLASH）。 SPLASHは、酵母、細菌およびヒトを含む生物のRNA相互作用を研究するために適用することができる。

ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

このビデオの全体的な目的は、ゲノムワイドにペアごとのin vivo RNA-RNA相互作用をマッピングする、psoralen架橋ライゲーションおよび選択ハイブリッドシーケンシング（SPLASH）の手法について説明することです。この技術は、in vivoでのRNA相互作用をマッピングするためのシンプルでハイスループットな手法です。この手法は、単一のRNA鎖に沿った異なる領域間、あるいは異なるRNA鎖間でどのように相互作用しているかなど、RNAゲノミクス分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法は酵母やヒト細胞に関する知見を得るのに有用ですが、細菌や細胞膜を含む他の現代的な生物の研究にも適用可能です。私たちは、分子間相互作用をマッピングする方法を考案したいと考えた際に、最初にこの手法を思いつきました。なお、以下の手順にはいくつかの停止ポイントが含まれていますのでご注意ください。このタイミングで、実験を短時間または無期限に一時停止することができます。詳細は付属のテキストをご参照ください。まず、HeLa細胞を5 mLのPBSで2回洗浄し、本手順を開始します。ディッシュを垂直に1分間保持し、余分なPBSを完全に切り出します。次に、200 µMのビオチン化ソラレンと、細胞透過性を高める0.01% digitoninを含むPBSを1 mL加えます。溶液を細胞表面に均一に加えるように注意してください。37 °Cで5分間インキュベートします。インキュベーション後、ディッシュの蓋を取り外し、UVクロスリンカー内のUVランプから3 cm離れた位置に、氷上に配置します。365 nmのUVを20分間照射します。20分後、ディッシュをクロスリンカーから取り出し、付属文書の指示に従ってHeLa細胞からフラグメントを単離し、RNAを沈殿させます。変性ラダーとRNAサンプルを8.6 cm四方の6% TBE-ureaゲルにロードします。180 Vで40分間電気泳動を行い、サイズ分画します。核酸ゲル染色剤を1:10,000に希釈したTBEバッファー10 millilitersを用いて、ゲルを暗所で5分間染色します。ゲルの染色中に、24ゲージの針を使用して、清潔な0.6 milliliterマイクロフュージチューブの底に穴を開けます。それを2 milliliterマイクロフュージチューブに入れます。トランスイルミネーターを用いて、染色後のゲルのバンドを可視化し、90〜110ヌクレオチドに相当するゲル slice を切り出します。このゲル slice を、2 mL マイクロফিউージチューブ内にある穴の開いた 0.6 mL マイクロফিউージチューブに移します。サイズセレクションを行うことで、キメラ断片の最小長を設定し、後でライゲーション産物と非ライゲーション産物を区別することが可能になります。室温で12,000 ×gにて2分間遠心分離し、ゲルスライスを破砕して2 mLマイクロフュージチューブに回収します。遠心後、空の0.6 mLマイクロフュージチューブを廃棄します。破砕したゲルスライスに、700 µLの溶出バッファーを加えます。サンプルがバッファーに拡散するように、4 °Cで一晩、一定の回転を加えてインキュベートします。ゲルスライスと溶出バッファーを遠心チューブフィルターに移し、20,000 ×gで20分間遠心分離します。遠心後、ゲルスライスはフィルターの上部コンパートメントに留まるため、これを廃棄して構いません。付属文書に記載されている方法に従って、RNAを沈殿させ定量します。RNAを液体窒素で急速冷凍し、使用時まで-80°Cで保存します。RNAクロスリンク領域を濃縮するために、まずマイクロ遠心チューブ内のストレプトアビジンコート磁性ビーズを洗浄するため、RNaseインヒビターを含む溶解バッファー100 µLを加えます。15 mLのコニカル遠心チューブに、調製直後のハイブリダイゼーションバッファー2 mL、サプリメント添加溶解バッファー1 mL、サイズ分画済みRNA 1.5 µg、および再懸濁したビーズ100 µLを加えます。チューブを軽くボルテックスします。エンドツーエンド回転させながら、37 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、あらかじめ加温しておいた洗浄バッファーでビーズを5回洗浄します。5回目の洗浄後、ビーズを含むマイクロ遠心チューブをマグネットスタンドに1分間置き、洗浄バッファーを除去します。洗浄したビーズに、冷やしたT4ポリヌクレオチドキナーゼバッファーを1 mL加えます。ビーズを4°Cで5分間、エンドツーエンド回転させながらインキュベートします。ビーズの入ったマイクロ遠心チューブをマグネットストリップ上に置きます。1分後、緩やかにバッファーを除去します。この工程を計2回の洗浄が完了するまで繰り返し、最後の洗浄後にバッファーを除去します。次に、付属文書の指示に従って、5'末端と3'末端をライゲーション可能な状態に変換し、近接ライゲーションを行います。洗浄後、ビーズに100 microlitersのRNA PK bufferを加え、ピペッティングにより再懸濁させます。ヒートブロックを用いて、サンプルを95 °Cで10分間加熱します。次に、サンプルを氷上で1分間冷却します。サンプルに500 µLのグアニジニウムチオシアネート-フェノール-クロロホルムを加えます。ボルテックスで10秒間激しく混合します。混合物を室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、キットを用いてRNAを沈殿させ、精製および回収します。その際、低分子RNAまで確実に回収されるようにしてください。RNAを100 µLのヌクレアーゼフリー水で溶出します。溶出したサンプル100 µLを、氷上の24ウェルプレートのウェルに移します。サンプルを氷上で保持したまま、254 nmのUV照射を5分間行います。逆架橋したサンプルを清潔なマイクロ遠心チューブに移します。酢酸ナトリウム 10 µL、グリコーゲン 1 µL、および 100% エタノール 300 µL を加えます。-20 °C で少なくとも 1 時間おいて、RNA を沈殿させます。RNAを回収するため、沈殿したRNAを4°C、20,000 ×gで30分間遠心分離します。遠心後、上清を除去し、RNAペレットを洗浄するために1 mLの70%冷エタノールを加えます。洗浄したペレットを4°C、20,000 ×gで15分間遠心分離します。洗浄バッファーを除去し、4.25 µL のヌクレアーゼフリー水を加えて RNA を再懸濁させます。RNA を 0.2 mL PCR チューブに移します。最後に、付属文書の指示に従って、cDNA の逆転写、環状化、および増幅を行います。この概略図はSPLASHのワークフローを示しています。0.01% digitonin存在下でビオチン化ソラレンを添加し、UV架橋を行った後、細胞から全RNAを抽出し、ドットブロット法によって架橋が効率的に行われたことを確認します。次に、ビオチン化20塩基オリゴをポジティブコントロールとして用い、約150塩基に1塩基が架橋されるように、細胞に添加するビオチン化ソラレンの量を調整します。次に、ディープシーケンシングに必要な最小サイクル数を決定するため、PCRサイクル数を増やしながら小規模なPCR増幅を行います。効率的なライブラリ調製プロセスでは、サイズセレクション後のRNAを1.5 µg投入することで、15サイクル未満のPCR増幅でcDNAシーケンシングライブラリを増幅させることが可能です。その後、ハイスループットシーケンサーを用いて、150 bpのペアエンドリードでライブラリをシーケンシングします。その後、シーケンシングリードを計算パイプラインに従って処理します。最終的な結果として、トランスクリプトームにおける分子内および分子間のRNA-RNA相互作用の両方を含む、フィルター済みのキメラ相互作用のリストが得られます。この手順を行う際は、新しい生物種にSPLASHを適用する場合、ビオチン化プソラレンが取り込まれているかを確認することが重要です。本手法の開発により、RNA生物学分野の研究者が多様な生物におけるRNA相互作用を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、細胞内におけるペアワイズのRNA相互作用をグローバルに捉えるシーケンシングライブラリの作製方法について、十分に理解することができるはずです。

mapping-rna-rna-interactions-globally-using-biotinylated-psoralen

Research

JoVE Journal

Genetics

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学ぶSPLASH法によるin vivoでのゲノム規模RNA-RNA相互作用マッピング。ビオチン化ソラレン架橋と高通量シーケンスを用いて、酵母やヒト細胞など多様な生物におけるRNA相互作用動態を網羅的に解析する手法です。

ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

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