ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

このビデオの全体的な目標は、ペアワイズin vivo RNA-RNA相互作用がゲノムワイドにマッピングされるソラレン架橋ライゲーションおよび選択ハイブリッドまたはSPLASHのシーケンシング方法を説明することです。この手法は、in vivoでRNA相互作用をマッピングするためのシンプルでハイスループットな方法です。この方法は、RNAの1本鎖に沿ったさまざまな領域や、異なるRNA鎖間のさまざまな領域が互いにどのように相互作用するかなど、RNAゲノミクス分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この方法は、酵母やヒトの細胞に関する洞察を得ることができますが、細菌や細胞内の膜など、他の現代の生物の研究にも適用できます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、相互作用を分子的にマッピングする方法を考え出したいと思ったときでした。次の手順には、いくつかの停止ポイントが含まれていることに注意してください。

このような場合、実験は短時間または無期限に一時停止できます。詳細については、付属のテキストをご覧ください。この手順は、HeLa細胞を5ミリリットルのPBSで2回洗浄することから始めます。

皿を1分間垂直に置き、余分なPBSを完全に排出します。次に、200マイクロモルのビオチン化ソラレンと細胞透過性を高める0.01%ジギトニンを含むPBSを1ミリリットル加えます。溶液を細胞の表面に均等に加えるように注意してください。

摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、ディッシュの蓋を外し、UV電球から3cmのところにあるUVクロスリンカー内の氷の上に置きます。365ナノメートルのUVを20分間照射します。

20分後、クロスリンカーからディッシュを取り出し、添付の文書の指示に従ってHeLa細胞からフラグメントを分離し、RNAを沈殿させます。変性させたラダーとRNAサンプルを8.6cm角の6%TBE-尿素ゲルにロードします。180ボルトで40分間電気泳動することにより、サイズ分画します。

1:10, 000希釈の核酸ゲル染色液を含む10ミリリットルのTBEバッファーでゲルを暗所で5分間染色します。ゲルが染色されている間に、24ゲージの針を使用して、底部にある清潔な0.6ミリリットルのマイクロチューブに穴を開けます。2ミリリットルのマイクロチューブに入れます。

トランスイルミネーターを使用して、染色後のゲル上のバンドを視覚化し、90〜110ヌクレオチドに対応するゲルスライスをカットします。ゲルスライスを、2ミリリットルのマイクロチューブ内の穴を開けた0.6ミリリットルのマイクロチューブに移します。サイズを選択することで、キメラフラグメントの最小長を設定し、後でライゲーションされた製品と非ライゲーションされた製品を区別することができます。

ゲルスライスを室温で12, 000倍gで2分間遠心分離し、ゲルスライスを細断し、2ミリリットルのマイクロフュージチューブに集めます。スピン後、空の0.6ミリリットルマイクロチューブを廃棄します。細断したゲルスライスに、700マイクロリットルの溶出緩衝液を加えます。

摂氏4度で一晩インキュベートし、一定の回転でサンプルをバッファーに拡散させます。ゲルスライスと溶出バッファーを遠心分離チューブフィルターに移し、20,000倍gで20分間遠心分離します。スピン後、ゲルスライスはフィルターの上部コンパートメントに閉じ込められ、廃棄される可能性があります。

添付の文書に記載されているように、RNAを沈殿させ、定量します。RNAを液体窒素中にマイナス80°Cで急速凍結し、使用するまで保存します。RNA架橋領域を濃縮するには、まずRNase阻害剤を含む100マイクロリットルの溶解緩衝液を添加し、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズをマイクロフュージチューブで洗浄します。

15ミリリットルの円錐形遠心チューブに、新たに調製したハイブリダイゼーションバッファー2ミリリットル、補充した溶解バッファー1ミリリットル、サイズ分画RNA1.5マイクログラム、および再懸濁ビーズ100マイクロリットルを加えます。チューブを優しく渦巻きます。摂氏37度で30分間インキュベートし、エンドツーエンドで回転させます。

インキュベーション後、あらかじめ温めた洗浄バッファーでビーズを5回洗浄します。5回目の洗浄が終わったら、ビーズの入ったマイクロチューブをマグネットスタンドに1分間置き、洗浄バッファーを取り出します。洗浄したビーズに1ミリリットルの冷たいT4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液を加えます。

ビーズを摂氏4度で5分間インキュベートし、端から端まで回転させます。ビーズが入ったマイクロチューブを磁気ストリップに置きます。1分後、バッファーをそっと取り外します。

この手順を合計2回の洗浄で繰り返し、最後の洗浄後にバッファーを取り出します。次に、添付ドキュメントの指示に従って、5つのプライムエンドと3つのプライムエンドをライゲーション適合するように変換し、近接ライゲーションを実行します。洗浄後、100マイクロリットルのRNA PKバッファーをビーズに加え、ピペッティングで上下させて再懸濁します。

サンプルをヒートブロックで摂氏95度で10分間加熱します。次に、サンプルを氷の上で1分間冷やします。500マイクロリットルのグアニジンチオシアン酸フェノールクロロホルムをサンプルに加えます。

10秒間激しくボルテックスして混ぜます。混合物を室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、キットを使用してRNAを沈殿、クリーンアップ、および回収し、小さなRNAも保持されるようにします。

100マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水でRNAを溶出します。溶出したサンプルの100マイクロリットルをniceの24ウェルプレートのウェルに移します。サンプルを氷上に保持し、254ナノメートルで5分間UV照射します。

逆架橋サンプルを清潔なマイクロチューブに移します。10マイクロリットルの酢酸ナトリウム、1マイクロリットルのグリコーゲン、および300マイクロリットルの100%エタノールを追加します。RNAをマイナス20°Cで少なくとも1時間沈殿させます。

RNAを回収するには、沈殿したRNAを20, 000倍gで摂氏4度で30分間遠心分離します。スピン後、上清を取り除き、70%冷たいエタノールを1ミリリットル加えてRNAペレットを洗浄します。洗浄したペレットを20, 000倍gで摂氏4度で15分間遠心分離します。

洗浄バッファーを取り外し、4.25マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えてRNAを再懸濁します。RNAを0.2ミリリットルのPCRチューブに移します。最後に、添付の文書の指示に従ってcDNAを逆転写、環状化、増幅します。

この回路図は、SPLASHワークフローを示しています。0.01%ジギトニンの存在下でビオチン化ソラレンを添加し、UV架橋すると、細胞から全RNAが抽出され、ドットブロットが行われて架橋が効率的であることを確認しました。次に、ビオチン化20塩基オリゴをポジティブコントロールとして使用して、細胞に添加するビオチン化ソラレンの量を滴定し、約150塩基に1塩基が架橋されるようにします。

次に、PCRサイクル数を増やして小規模PCR増幅を行い、ディープシーケンシングに必要な最小サイクル数を決定します。効率的なライブラリ調製プロセスでは、1.5 μgのサイズの選択されたRNAインプットからcDNAシーケンシングライブラリを15サイクル未満のPCR増幅で増幅できます。次に、ライブラリは、ハイスルーシーケンシングマシンで2つの150塩基ペアリードを使用してシーケンシングされます。

その後、シーケンシングリードは計算パイプラインに従って処理されます。最終結果は、トランスクリプトーム内の分子内および分子間RNA-RNA相互作用の両方を含む、フィルタリングされたキメラ相互作用のリストです。この手順を試行する際、新しい生物にSPLASHを使用する際には、ビオチン化ソラレンの取り込みを確認することを忘れないでください。

その開発後、この技術は、RNA生物学の分野の研究者が多様な生物におけるRNA相互作用を探求する道を開きました。このビデオを見れば、細胞内のペアワイズRNA相互作用をグローバルに捕捉するシーケンシングライブラリの作り方を十分に理解できるはずです。