Name: ターゲットを絞りましたその場で突然変異誘発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学ぶ、Saccharomyces cerevisiaeにおけるヒストン遺伝子のその場で標的突然変異誘発法。PCRと酵母遺伝学技術を用いて、クロマチン関連プロセスにおける特定のヒストン残基の役割を解明する手法です。

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この原稿の準備中に有益なコメントをいただいたReine Protacioに感謝します。全米科学財団(助成金番号1243680および1613754)とヘンドリックスカレッジオデッセイプログラムの資金援助に感謝の意を表します。

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

一倍体S.セレビシエ細胞における4つのコアヒストンタンパク質のそれぞれのコードは、具体的突然変異誘発のための2つの遺伝子のいずれかをターゲットにする研究者のための挑戦を表すことができる2つの非対立遺伝子間の配列相同性の高レベル。以前は頻繁に依存し、Delitto PERFETTO、サイト固有のゲノム（SSG）突然変異誘発、およびクローニングのないPCRに基づく対立遺伝子交換方法5、6、7、ならびにより最近の酵母CRISPRベースの技術15を含む、酵母の突然変異誘発法を説明少なくとも部分的には、最終的に最終的な変異対立遺伝子を生成するために、所望のゲノム部位への組換えまたは修理機械を募集する標的遺伝子のORF内の配列に。一方、ここで提示した戦略はhomologoを駆動するための標的ORFに隣接するDNA配列を利用します私たちの組換え事象変異の統合に必要な、そして、その結果...

4つのコアヒストンタンパク質H2A、H2B、H3、およびH4は、真核生物の染色体の締固め、組織、および機能において中心的な役割を果たしています。これらのヒストンのそれぞれの二組は、最終的にヌクレオソーム1の形成をもたらす、ヒストン八量体、自身の周囲のDNAの〜147塩基対の折り返しを指示する分子スプールを形成します。ヌクレオソームは、そのような遺伝子転写の調節および染色体全体のユークロマチンとヘテロクロマチンの形成と染色体ベースのプロセスの様々な積極的な参加者であり、そのように、過去数十年にわたって集中的な研究の焦点となっています。これらの機構は、ヒストン残基、ATP依存的ヌクレオソームのリモデリング、およびATP非依存性ヌクレオソーム再編成の翻訳後修飾を含む - の機構の数がヌクレオソームは、特定のプロセスの実行を容易にすることができる方法で操作することができるによって記載されています及び組立/分解2,3。 出芽酵母サッカロマイセス・セレビシエは、真核生物におけるヒストンの機能を理解するために、特に強力なモデル生物です。これは主に遺伝的および生化学的実験の様々なドメイン真核生物および酵母の従順を通して、ヒストンタンパク質の進化的保存の高度に帰することができる4に近づきます。酵母における逆遺伝的アプローチは広くクロマチン生物学のさまざまな側面に関する特定のヒストン変異の影響を研究するために使用されてきました。実験のこれらのタイプのためには、自律的なプラスミドからの発現は、ヒストンタンパク質の異常な細胞内レベルにつながることができますように（これは細胞内でのプラスミドの様々な数に）、変異型ヒストンが母国のゲノム遺伝子座から発現される細胞を使用することが好ましいことが多いとクロマチンアンの同時変更最終的には結果の解釈を混乱することができvironments、。 ここでは、ゲノム中の残りの外因性DNA配列せずに所望の変異（複数可）の生成にクローニングステップと結果を必要としないそれらの天然ゲノム位置でのヒストン遺伝子の標的突然変異誘発を可能にするPCRベースの技術が記載されています。この技術は、酵母内で効率的な相同組換え系を利用し、他のグループによって開発された他の同様の技術と共通のいくつかの機能があります-最も顕著Delitto PERFETTO、サイト固有のゲノム（SSG）突然変異誘発、およびクローニングのないPCRに基づく対立遺伝子を代替法5、6、7。しかし、私たちが説明する手法は、特にヒストン遺伝子の突然変異誘発のために非常に適しせる側面を持っています。半数体酵母細胞では、4つのコアヒストンの各々は、二つの非Aによりコードされますllelicと相同性の高い遺伝子は、たとえば、ヒストンH3はHHT1とHHT2遺伝子によってコードされ、そして2つの遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）は、シーケンス内の90％以上同一です。相同性のこの高度に特異的突然変異誘発のための2つのヒストンをコードする遺伝子のいずれかを標的とするように設計された実験を複雑にすることができます。上述の方法は、多くの場合、相同組換えを駆動するために、標的遺伝子のORF内の少なくともいくつかの配列の使用を必要とするのに対し、ここで説明する技術は、のために（非常に少ない配列相同性を共有する）ヒストン遺伝子のORFに隣接する配列を利用します組換え工程は、所望の遺伝子座に突然変異誘発の成功した標的化の可能性を高めます。また、再結合を駆動相同領域は、さらに効率的な標的相同組換えに貢献し、非常に広範であることができます。

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA ラダー (DNA スタンダード)</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5093-100G</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Sigma</td><td>B0394-500G</td><td></td></tr><tr><td>dNTP ミックス (各 10 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 溶液 (0.5 M、pH 8.0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>エタノール (200 プルーフ)</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-824</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物 (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E4884-500G</td><td></td></tr><tr><td>酢酸リチウム二水和物</td><td>Sigma</td><td>L6883-250G</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール) (PEG)</td><td>Sigma</td><td>P3640-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS DNA Polymerase(high fidelity DNA polymerase)&nbsp; and 5x buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-443-960</td><td></td></tr><tr><td>サーモン精子DNA溶液</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15632-011</td><td></td></tr>シ<tr><td>グマ7-9(トリスベース、粉末状)</td><td>シグマ</td><td>T1378-1KG</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム三水和物</td><td>シグマ</td><td>236500-500G</td><td></td></tr><tr><td>スープラふるいGPGアガロース(低計量温度アガロース)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00985-00100</td><td></td></tr><tr><td>Taqポリメラーゼおよび10xバッファー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0273X</td><td></td></tr><tr><td>つまようじフィ</td><td>ッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>S67859</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M、pH 8.0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB14043-01000</td><td></td></tr><tr><td>A-D(+)-グルコース</td><td>フィッシャー サイエンティフィック サイエンティ</td><td>フィック ダイエン</td><td></td></tr>ティフィック AC170080025 酵母<tr>培地用<td>寒天</td><td>フィッシャー サイエンティ</td>フィック <td>DF0140-01-0</td><td>酵母 培</td></tr>地用 <tr><td>ペプトン</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>DF0118-07-2</td><td>YPD中用</td></tr>酵母<tr><td>エキス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>DF0127-17-9YPD</td><td>中用</td></tr>4<tr><td>-アミノ安息香酸</td><td>シグマ</td><td>A9878-100G</td><td>完全な最小ドロップアウト培地&nbsp;</td></tr><tr><td>アデニン</td><td>シグマ</td><td>A8626-100G</td><td>は、完全な最小ドロップアウト媒体です&nbsp;</td></tr><tr><td>塩酸グリシン</td><td>Sigma</td><td>G2879-100G</td><td>、完全な最小ドロップアウト培地&nbsp;</td></tr><tr><td>L-アラニン</td><td>シグマ</td><td>A7627-100G</td><td>完全最小ドロップアウト媒体&nbsp;</td></tr><tr><td>L-アルギニン一塩酸塩</td><td>シグマ</td><td>A5131-100G</td><td>、完全な最小ドロップアウト媒体&nbsp;</td></tr><tr><td>L-アスパラギン一水和物</td><td>シグマ</td><td>A8381-100G</td><td>、完全な最小ドロップアウト培地&nbsp;</td></tr><tr><td>L-アスパラギン酸ナトリウム塩一水和物</td><td>Sigma</td><td>A6683-100G</td><td>、完全な最小ドロップアウト媒体&nbsp;</td></tr><tr><td>L-システイン塩酸塩一水和物</td><td>Sigma</td><td>C7880-100G</td><td>、完全最小ドロップアウト培地&nbsp;</td></tr><tr><td>L-グルタミン酸塩酸塩</td><td>Sigma</td><td>G2128-100G</td><td>、完全最小ドロップアウト培地&nbsp;</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Σ</td><td>G3126-100G</td><td>完全低ドロップアウト培地&nbsp;</td></tr><tr><td>L-ヒスチジン一塩酸塩一水和物</td><td>シグマ</td><td>H8125-100G</td><td>の完全な最小ドロップアウト培地&nbsp;</td></tr><tr><td>L-イソロイシン</td><td>Sigma</td><td>I2752-100G</td><td>完全最小ドロップアウト媒体用&nbsp;</td></tr><tr><td>L-ロイシン</td><td>Sigma</td><td>L8000-100G</td><td>完全最小ドロップアウト媒体&nbsp;</td></tr><tr><td>L-リジン一塩酸塩</td><td>Sigma</td><td>L5626-100G</td><td>、完全最小ドロップアウト培地用&nbsp;</td></tr><tr><td>L-メチオニン</td><td>シグマ</td><td>M9625-100G</td><td>完全最小ドロップアウト培地用&nbsp;</td></tr><tr><td>L-フェニルアラニン</td><td>Σ</td><td>P2126-100G</td><td>完全低ドロップアウト培地用&nbsp;</td></tr><tr><td>L-プロリン</td><td>Sigma</td><td>P0380-100G</td><td>完全最小ドロップアウト媒体用&nbsp;</td></tr><tr><td>L-セリン</td><td>Sigma</td><td>S4500-100G</td><td>完全最小ドロップアウト媒体用&nbsp;</td></tr><tr><td>L-スレオニン</td><td>シグマ</td><td>T8625-100G</td><td>完全最小ドロップアウト培地用&nbsp;</td></tr><tr><td>L-トリプトファン</td><td>Σ</td><td>T0254-100G</td><td>完全低ドロップアウト培地用&nbsp;</td></tr><tr><td>L-チロシン</td><td>シグマ</td><td>T3754-100G</td><td>完全最小ドロップアウト媒体用&nbsp;</td></tr><tr><td>L-バリン</td><td>シグマ</td><td>V0500-100G</td><td>は完全な最小ドロップアウト媒体用&nbsp;</td></tr><tr><td>myo-イノシトール</td><td>Sigma</td><td>I5125-100G</td><td>(完全な最小ドロップアウト媒体用)&nbsp;</td></tr><tr><td>ウラシル</td><td>シグマ</td><td>U0750-100G</td><td>の完全な最小ドロップアウト媒体&nbsp;</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A702-500</td><td>の完全な最小ドロップアウト培地&nbsp;</td></tr><tr><td>酵母窒素ベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>DF0919-07-3</td><td>完全最小ドロップアウト培地用&nbsp;</td></tr><tr><td>5-フルオロロチン酸(5-FOA)</td><td>AmericanBio</td><td>AB04067-00005</td><td>for&nbsp; 5-FOAミディアム</td></tr></tbody></table>

ターゲットを絞りました<em&gt;その場で</em出芽酵母におけるヒストン遺伝子の&gt;突然変異誘発

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

私たちは、出芽酵母細胞のヒストン遺伝子に標的変異を生成するためのPCRおよび相同組換えベースのシステムについて説明します。結果として生じる変異対立遺伝子は、その内因性ゲノム部位に存在し、処置後、ゲノムに外因性DNA配列は残されません。一倍体酵母細胞では、4つのコアヒストンタンパク質のそれぞれが、高度に相同なオープンリーディングフレーム(ORF)を持つ2つの非対立遺伝子によってコードされているため、特定のヒストンタンパク質をコードする2つの遺伝子のうちの1つを特異的に標的とする突然変異誘発が問題となる可能性があります。ここで説明する戦略は、相同組換えステップのために標的遺伝子のORFの内部ではなく外部の配列を利用することにより、この問題を回避します。このシステムのもう一つの特徴は、相同組換えステップを駆動するDNAの領域を非常に広範囲にすることができ、したがって、統合イベントが成功する可能性を高めることができることです。これらの特徴により、この戦略はヒストン遺伝子の突然変異誘発に特に適していますが、酵母ゲノムの他の遺伝子の突然変異誘発にも適応できます。

私たちは、 その場での突然変異誘発戦略において標的の代表例として、グルタミン酸（H3-R53E変異体）にアルギニンから53位での置換を保有するヒストンH3変異体タンパク質を発現するhht2対立遺伝子の発生を記載しています。 私たちは、HHT2のORF全体がURA3遺伝子（プロトコールのステップ1を参照）に置換された菌株を生成しました。この株は、yAAD156は、また、細胞がヒスチジンに対して栄養要求性であることが原因とhis3Δ200対立遺伝子を、保有します。プロトコルのステップ2に示された手順に従い、我々はその後HHT2の2つの部分的に重複するフラグメントを生成しました。フォワードプライマー（OAD20）：5 &#39;GCGTTCATTATCGCCCAATGTG 3&#39;及びリバースプライマー（R53E...

Saccharomyces cerevisiaeの内因性位置でヒストン遺伝子の突然変異を生成するための戦略が提示されます。

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

本手順の総合的な目的は、出芽酵母細胞において、ヒストン遺伝子の内因性染色体上の部位に特異的な変異を導入することです。この手法は、DNA転写などのクロマチンを基質とする様々なプロセスにおいて、特定のヒストン残基がどのように寄与しているかを決定するために利用できます。この手法の主な利点は、酵母では各ヒストンタンパク質が2つの相同性の高い非対立遺伝子によってコードされているにもかかわらず、特定のヒストン遺伝子を標的にして変異導入ができる点にあります。標的ヒストン遺伝子をノックアウトし、URA3で置換した酵母株を作製した後、遺伝子の前半部分について以下の反応系を構築し、標的ヒストン遺伝子の部分的に重複する2つの断片のPCR産物を生成します。遺伝子の後半部分についても、異なるプライマーを用いて同様のPCR反応を構築してください。反応液をサーマルサイクラーにセットし、以下のプログラムを設定します。TBEバッファーを用いた0.9%低融点アガロースゲルに、PCR反応液を20～50 µL分ロードして電気泳動を行います。次に、清潔なカミソリの刃を用いてゲルからPCR産物を切り出し、各セクションを1.5 mLチューブに移します。アガロースの断片は、使用するまで20 °Cで保存してください。フルサイズのPCR産物を生成するためのPCR反応用テンプレートDNAを調製するには、アガロースセクションをヒートブロックを用いて65 °Cで5分間融解させます。融解を促進するため、1〜2分ごとにチューブをボルテックスします。各サンプルから一定量ずつ融解したアガロースを1本のマイクロ遠心チューブに移し、ボルテックスして混合します。これをフュージョンPCRのテンプレートとして使用し、使用時まで20°Cで保存してください。フルサイズのPCR産物を大量に増幅させるには、以下の試薬を用いてPCR反応を6セット準備します。チューブをサーマルサイクラーにセットし、以下の設定で反応を行います。沈殿法によってPCR産物を濃縮し、テキストプロトコルに従ってバックボーンプラスミドとともに共形質転換に使用します。PCR産物の組み込みによるURA3遺伝子の消失をスクリーニングするため、プレート1から20のプレート蓋を取り外し、コロニーが含まれるプレートを滅菌済みベルベットに押し付けて、細胞をレプリカプレートします。ベルベットに付着した細胞を、5-FOAプレートをベルベットに押し付けることで転写します。プレートを30°Cで2日間インキュベートします。その後、プレートに増殖が見られるか注意深く確認してください。テキストのプロトコルに従って候補コロニーをYPDプレートにストリークしてインキュベートした後、各YPD精製プレートから、新しいYPDプレート、URA3遺伝子の脱落を確認するためのウラシル欠損ドロップアウトプレート、およ

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

酵母の遺伝学的研究は、細胞のDNA代謝におけるヒト遺伝子の分子や細胞機能を調べるために用いることができる。メソッドは、人間の遺伝的特性に記載されている...

人間のDNA修復タンパク質の遺伝的研究は、モデルシステムとして酵母を使用

HOエンドヌクレアーゼの形成の定量と分析でアニーリングシングルストランドによる染色体転座を刺激サッカロマイセスセレビシエ</em

出典:Bennett, S. A., et al., 酵母神経変性タンパク質症モデルにおけるヒストン翻訳後修飾変化の特徴付け.J. Vis. Exp.

神経変性タンパク質の過剰発現を伴う酵母細胞におけるヒストン修飾の検出

遺伝的にコードされたヒストンminiSOGは、青色光依存的にゲノムワイドな遺伝変異を誘発します。この突然変異誘発法は、高速で、単純な有毒化学物質の自由、およびフォワード遺伝子スクリーニングおよび導入遺伝子組込みに適しています。...

でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発<em&gt; C。エレガンス</em

ここでは、出芽酵母酵母から変更されたヒストンのクロマチン免疫沈降のためのプロトコルについて述べる。沈澱 DNA はその後量的な PCR...

酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

この資料では、分裂酵母のターゲット遺伝子のランダム突然変異誘発のための詳細な方法論について説明します。たとえば、ターゲットrpt4 +、19 s...

分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

リボヌクレオチドは真核生物の核 DNA 複製時にゲノムに組み込む最も豊富な非正規のヌクレオチドです。正しくない削除、DNA 損傷と突然変異誘発リボヌクレオチドが発生します。リボヌクレオチド混入 DNA とその変異原性効果の豊かさを評価するために使用される 2...

勉強リボヌクレオチド定款: 酵母ゲノムとリボヌクレオチド誘発突然変異を測定のリボヌクレオチド鎖特異的検出

ここでは、ヒトP53トランス活性化の可能性、その様々な癌関連変異の影響、共発現相互作用タンパク質、および酵母サッカロマイセスセレビシエレポーター株を構築し、利用するための4つのプロトコルを示します。特定の低分子の効果。...

ヒトP53を研究する機能アッセイを開発するシャーシとしての酵母

酵母分裂簡便なサプレッサー スクリーンのプロトコルを提案します。この方法は、効率的な変異原無料、頻繁に単一の genomic 位置で起こる突然変異の選択です。...

分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面

タイムラプス顕微鏡は、出芽酵母の減数分裂を研究するための貴重なツールです。このプロトコルでは、細胞周期同期、タイムラプス顕微鏡、および標的タンパク質の条件付き枯渇を組み合わせて、減数分裂染色体分配中の特定のタンパク質の機能を研究する方法を実証する方法について説明しています。...

S. cerevisiaeの減数分裂を研究するためのタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇の使用

タンパク質関連新生DNAの濃縮およびシーケンス(eSPAN)は、2本の複製DNA鎖におけるクロマチン関連タンパク質の相対的な存在比を検出するために開発され、クロマチン複製およびその結合過程に関する分子的知見を明らかにしました。このプロトコルは、酵母およびマウスの胚性幹細胞(ES)細胞におけるeSPAN手技を記述しています。...

タンパク質関連新生DNA法の濃縮およびシーケンスによる複製DNA鎖におけるタンパク質の鎖特異的解析

学ぶ、Saccharomyces cerevisiaeにおけるヒストン遺伝子のその場で標的突然変異誘発法。PCRと酵母遺伝学技術を用いて、クロマチン関連プロセスにおける特定のヒストン残基の役割を解明する手法です。

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