Name: 細胞移動を測定するためのカスタマイズ可能な商工会議所 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 学ぶカスタマイズ可能な微小チャンバーを用いた細胞移動測定法。傷治癒や化学走性因子の効果を研究するための簡便な手法で、あらゆるスキルレベルの研究者が利用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

著者は、このプロジェクトのための資金を提供するためのクレムソン大学のクリエイティブ照会プログラムとNSF CBET1254609を認めます。

1.濃度勾配を作成するためにマイクロチャンネル発生室<ol><li> アクリル成形型部品を切削 <ol><li>所望の幅のアクリルの一部を取得します。典型的には、1/16インチ厚のアクリルシートを使用。より厚いシートは、それらが処理中に破損したり、ワープさせ、必要な機械的強度を持っていないだけでなく、非常に薄いシートをカットすることは困難です。 </li><li>ポリジメチルシロキサン（PDMS）内に空洞を生成するためにアクリル片の所望の形状のCADファイルを作成します。個々の実験プロトコルに関連する目的の勾配を達成するために、チャネル幅と長さを調整します。 <ol><li> 0.127センチメートル広いチャネル（0.254センチメートル長い）（ 図1）によって接続された2つの正方形（のx 0.254センチメートル0.254センチメートル）：ここでは、以下の寸法のアクリル作品を使用しています。 </li></ol></li><li>レーザー切断装置にCADファイルをインポートし、マヌーに応じてレーザーカッターでアクリルピースを配置facturerのプロトコル。 注：別の方法として、CAD設計から作品を3D-印刷します。この方法の利点は、代替材料が金型に使用することができることです。しかしながら、分解能および再現性は、レーザー切断に比べて三次元印刷に減少させることができます。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig1.jpg" /> 図1：マイクロチャンネル商工会議所のコンピュータ支援設計（CAD）表現。この画像は、マイクロチャネルのチャンバを作成するために必要なアクリルインサートのCAD図面を示します。 1 A）CAD図面、1B）インチに寸法とCAD図面の側面図、 図1C）インチに寸法とCAD図面の上面図の上面図<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55264/55264fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="2"><li&gt;は、ポリジメチルシロキサン（PDMS）を注ぎます <ol><li>計量ボートでは、商業用エラストマー硬化剤（ 例えば 、シルガード194）1重量部で商業エラストマーベース（ 例えば 、シルガード184）10重量部を混合します。一般的に、エラストマー硬化剤の1グラムにエラストマーベースの10グラムを混ぜます。 </li><li> 5分間、マイクロピペットを用いて塩基及び硬化剤を組み合わせることかき混ぜます。 </li><li>真空ベルを設定し、閉じ込められた気泡を除去するために30分間真空中でPDMSと計量ボートを配置します。 </li><li>真空の電源を切り、計量ボートを削除します。小さなペトリ皿にアクリルカットアウトの上にPDMSを注ぎます。 PDMSが完全に挿入をカバーしていることを確認してください。 </li><li> PDMSは、室温で一晩（少なくとも18時間）を硬化させます。 </li></ol></li><li> PDMSからの挿入を削除します <ol><li> PDMSを硬化させた後、慎重にメスでアクリル作品の周りにPDMSを切断することにより、インサートを取り外します。 </li></ol&gt; </li></ol> 2.マイクロチャネルチャンバー内の細胞をプレーティング<ol><li> 細胞をプレーティングするためのチャンバを殺菌します。 注：PDMSは、エチレンオキシドまたは他の技術を用いて滅菌することができるが、迅速なUV処理は、迅速、安価、および細胞培養研究のために十分です。短いUV処理時間はPDMS片の構造又は機械的完全性を損ないませんでした。 <ol><li>標準的な細胞培養キャビネット内に、完全に70％エタノールを用いてチャンバを覆います。 </li><li>蓋をオフにして、層流フード内でペトリ皿を置きます。 </li><li>フードを終了し、UV光をオンにします。 1〜2時間UV光にさらします。 </li><li>層流フードを開き、流れを再確立するために15分を待ちます。 </li><li> 70％エタノールを削除します。 </li><li>滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回チャンバを洗浄します。各洗浄のために1mLのPBSを使用してください。 PBSを削除し、室は蓋をオフにして一晩乾燥させます。 注：別の方法として、代わりに1が利用可能な場合、層流フードを使用しての、滅菌のためにUVチャンバーボックスを使用します。アルミホイルを敷いた段ボール箱の裏面にUV光源を配置することによって、UVボックスを作成します。アルミ箔は、サンプルの均一な照明を可能にするために光を反射します。 </li></ol></li><li> チャンバー内の細胞をプレーティング <ol><li>トリパンブルーと血球計数器を用いて細胞を数えます。 <ol><li> 0.4％トリパンブルーの400μLに100μLの細胞懸濁液を加え、穏やかに混合。静かにカバーガラスの下で両室を充填することにより、血球計数器に、この溶液100μLを適用します。 </li><li>血球計数器上のグリッドに注力して10X対物レンズで顕微鏡を使用してください。血球計数器上の16の正方形の1セット内生非染色細胞をカウントするために手の数取器を使用してください。 </li><li> 16の正方形のすべての4組のセルをカウントします。 16の正方形の4セットからの平均細胞数を取り、5×10 4を掛け。この最後の番号はnumbeです細胞懸濁液中の細胞/ mLのR。 </li></ol></li><li>各チャンバ内の1つのウェルに2,500細胞を追加します。これは〜3万/ cm 2の近コンフルエント細胞密度に変換されます。 </li><li>細胞は培地（ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシン）を加える前に、60分間室内に座ってできるようにします。 </li></ol></li></ol> 3.デキストラン浸しアガロースブロック<ol><li> アガロースブロックを作成します <ol><li> 3Dプリントモールド（2ミリメートル×2ミリメートル×2ミリメートル）にアガロース3％を注ぎます。 </li><li>アガロースは、任意の気泡を除去するために30分間、真空チャンバー内に固化することができます。 </li><li>金型からアガロースブロックを削除します。 注：別の方法として、2ミリメートルの厚さで小さなペトリ皿にアガロース3％を注ぎます。メスまたは他の切削工具を使用して、2ミリメートル×2ミリメートル×2ミリメートルのブロックをカット。これは、金型システムのように正確ではありませんが、それを行うのは少し楽にすることができます。 </li></ol></li><li>完全submerg走化性因子の所望の濃度の溶液中での電子アガロースブロック。濃度勾配の形成を評価するために、蛍光デキストランで第一室をフラッシュします。デキストランの濃度および分子量は、目的の可溶性因子または薬物のそれと一致する必要があります。 </li><li>アガロースブロック一夜を浸します。 </li></ol>可溶性因子の濃度勾配を評価するために、デキストラン拡散の4タイムラプス<ol><li>マイクロチャネル室の小さな正方形のウェルにデキストラン浸したアガロースブロックを配置します。 </li><li>セルイメージングシステム内のマイクロチャネル室を配置したり、タイムラプス機能を備えた別の蛍光顕微鏡を使用しています。製造元の指示に従ってタイムラプスを開始します。 注：示された結果は、GFPフィルター、50％の光、4月10日のpH、および4倍の倍率で撮影されています。 </li></ol>細胞増殖の5タイムラプス<ol><li>の一端にマイクロチャネルチャンバー内板細胞チャンバー。ここでは、3T3線維芽細胞を使用しています。マイクロチャネルチャンバー内で1つのウェルに2,500細胞を追加します。 2.2.1で説明したように、細胞をカウントします。 <ol><li>細胞は培地（ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシン）を加える前に、60分間室内に座ってできるようにします。 5％CO 2中37℃で播種した細胞とマイクロチャンネル室を保管してください。チャネルを介して細胞遊走を顕微鏡で見ることができます。 </li><li>マーカーを追加または距離セルフロントの動きを定量化するための出発点として機能するために、マーカーとしてチャンバ内の微小欠陥を使用します。 </li></ol></li><li>マイクロチャネルの一方の端部に集中し、成長因子、化学誘引物質、薬物、または他の因子が試験される（ここで、40％FBSを例として使用されている）を含むアガロースゲル（8 mm 3でブロック）を配置することによって勾配を確立しますチャンバー。 </li><li>移動セルフロントのタイムラプス画像を撮影します。ここでは、結果があちこちセルの画像を表示しますNTイメージングシステムを用いて12時間ごとに採取したもの。 </li><li>細胞増殖速度を定量化するために、セルの前面の写真を使用してください。最初のセルのフロント、チャネル壁、及び基準マーカによって定義される多角形のマスクを作成する（roipoly）MATLABの関数polyfitを使用して、増殖速度を計算します。このマスクの寸法は、平均セルフロント速度が算出されたフロントの移動距離をもたらします。他の研究では、同様の方法8を利用しています。 注：同じ距離で可溶性因子の濃度になるように、各フレーム上の細胞増殖前面の縁を比較してください。可溶性因子の濃度勾配は、1次元拡散モデルの近似を用いて計算されます。 </li><li>ファロイジンおよびDAPI染色を用いて細胞の蛍光画像を撮ります。 <ol><li>ファロイジンで染色する前に細胞を固定。 <ol><li> 37℃で温め、4％パラホルムアルデヒド。 </li><li>セルをカバーするのに十分な4％パラホルムアルデヒドを加えます。で細胞を保ちます10分間パラホルムアルデヒド。 </li><li> 15分間、PBSで2回、それぞれの時間をすすぎます。セルをカバーするのに十分なPBSを使用してください。 </li></ol></li><li>細胞からPBSを除去し、細胞をカバーするのに十分な透過化溶液（PBS中0.1％トリトンX-100）を追加します。 10分間この溶液を残します。 </li><li>毎回5分間、PBSで2回洗浄します。セルをカバーするのに十分なPBSを使用してください。 </li><li>細胞からPBSを除去し、20分間溶液（PBS中の1％ウシ血清アルブミン）でブロッキング加えます。 </li><li>ブロッキング溶液を除去し、5分間PBSで各回2回洗浄します。セルをカバーするのに十分なPBSを使用してください。 </li><li>使用されていない場合、この時点から、アルミニウム箔で光から細胞を保護します。細胞からPBSを削除し、1時間、PBSで希釈したファロイジン488 1:50に追加します。 </li><li>各洗浄のための5分間、PBS中で2回洗浄します。セルをカバーするのに十分なPBSを使用してください。次に、細胞からPBSを削除します。 </li><li> 15分間、細胞をPBS 1,000：DAPI（4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）を追加し、1に希釈しました。 </li><li> DAPIを削除し、各洗浄のための5分間PBSで2回細胞を洗浄します。 </li><li>最後の洗浄を削除し、セルをカバーするのに十分なPBSを追加します。細胞は、現在、蛍光顕微鏡で画像化することができます。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+fabricated+in+poly+%28dimethylsiloxane%29+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li>
<li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dynamic+temporal+and+spatial+concentration+gradients+using+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices.</a> Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).</li>
<li>Darby, I., Hewitson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Differentiation+in+Wound+Healing+and+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis.</a> Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).</li>
<li>Thampatty, B. P., Wang, J. H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+study+fibroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskel%22%5BJournal%5D)">A new approach to study fibroblast migration.</a> Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).</li>
<li>Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+Factors%2C+Matrices%2C+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324, 1673-1677 (2009).</li>
<li>Zengel, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21592329">µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies.</a> BMC Cell Biol. , (2011).</li>
<li>Chen, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576901">Boyden Chamber Assay.</a> Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).</li>
<li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+revised%3A+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models%5BTitle%5D)+AND+%22JCB%22%5BJournal%5D)">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models.</a> JCB. 203 (4), 691-709 (2013).</li>
<li>Saadi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+concentration+gradients+in+2D+and+3D+environments+using+a+microfluidic+ladder+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber.</a> Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).</li>
<li>Cammer, M., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+Responses+by+Macrophages+to+a+Directional+Source+of+a+Cytokine+Delivered+by+a+Micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette.</a> Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).</li>
<li>Wells, C. M., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+migration+using+the+Dunn+chemotaxis+chamber+and+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+migration+chip+for+chemotaxis-based+microfluidic+selection+of+heterogeneous+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Wright, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+open+microfluidic+devices+for+chemotaxis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies.</a> Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).</li>
<li>Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+with+arbitrary+shapes+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+devices%3A+New+tools+for+studying+cancer+and+cancer+stem+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration.</a> Biomicrofluidics. 5 (1), 013412(2011).</li>
<li>Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chambers+for+cell+migration+and+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Tech%3A+Rev+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research.</a> Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).</li>
<li>Tang, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTang%2C+SK+%22Basic+microfluidic+and+soft+lithographic+techniques.+Optofluidics%3A+Fundamentals%2C+Devices+and+Applications%22">Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications</a>. Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. , McGraw-Hill, 2010. (2010).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+multicompartment+device+for+neuroscience+research%29%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microfluidic multicompartment device for neuroscience research).</a> Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).</li>
<li>Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Device+for+Studying+Multiple+Distinct+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains.</a> JoVE. (69), (2012).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々のマイクロチャネル室は、成長因子及び化学誘引物質に応答した細胞遊走の速度を決定し、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を測定することを含む、目的の多数のために使用することができます。細胞を増殖し、チャンバの一端に化学誘引物質を配置するために我々のマイクロチャネル室を利用することが可能です。細胞は、化学誘引物質に応答して成長し、細胞遊走、細胞移動速度を決定するために分析することができるタイムラプス画像を撮影することによって定量することができます。この方法の代表的な結果は、成長速度は、MATLAB関数polyfitを使用して13.4ミクロン/時間であると決定された、図3に示されています。 我々のマイクロチャネル室の別の使用は、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を測定することです。関心対象の薬剤と同様の分子量の蛍光タグ付けされたデキストランはDRUの拡散をモデル化するために使用することができます興味のあるグラム。サンプルは、勾配を崩壊させるだろう対流の大量として慎重に取り扱わなければならないことに留意することが重要です。この方法の代表的な結...

創傷治癒、免疫応答、胚発生などの重要な過程が起こるためには、細胞の移動が起こらなければなりません。細胞遊走には、細胞と隣接する細胞との間の相互作用、細胞外マトリックス、および可溶性の化学的手がかり(誘引剤または忌避剤)が含まれます。一例として、創傷治癒の過程で、線維芽細胞は線維形成と創傷収縮に不可欠な役割を果たし、細胞が損傷部位に動員されてコラーゲンを合成し、細胞外マトリックス3を形成します。線維芽細胞の創傷部位への移動の背後にある多くのメカニズムが研究されており、それらにはさまざまな機械的、物理的、電気的、走化性因子が含まれます4。線維芽細胞は、成長因子のさまざまな濃度勾配に特によく反応します。これらの異なる成長因子は、組織の再生を最適化するために連携して働きます5。成長因子濃度に対する線維芽細胞の走化性応答を観察しながら、線維芽細胞の方向性移動のパターンと、線維芽細胞が目的地に到達するために物理的な障害物の周りをどのように向き付けるかを研究することができます。したがって、この研究の目標は、最初に、物理的な障壁によるガイダンスの下で線維芽細胞の成長を追跡できるシステムを開発し、次に、システム内を移動する線維芽細胞の成長をモデル化することでした。
現在、ボイデンチャンバーアッセイは、細胞の移動を測定するために最も広く使用されているシステムです6。ボイデンチャンバーは、2チャンバーのマルチウェルプレートで構成されており、各ウェルには化学誘引剤の有無にかかわらず培地が含まれている場合があります7。フィルターメンブレンは、各ウェルの2つのチャンバー間に多孔質の界面を提供します。これにより、セルがアクティブ移動によって行われない限り、セルが通過できないようにバリアが作成されます。通常、ボイデンチャンバーでは、化学誘引剤が下部チャンバーに追加され、システムが平衡化して上部と下部のウェルの間に勾配が形成されます4。ボイデンチャンバーアッセイの問題点の1つは、メンブレンの表面と垂直な1つの軸に沿って急勾配が形成されることです。これにより、上部ウェルと下部ウェルの間の走化性物質濃度の差は、当初の予想よりも小さくなります。この制約により、ボイデンチャンバーアッセイでは、特定の細胞応答と特定のグラジエント特性(傾きや濃度差など)を相関させることが難しくなります。これらの測定がなければ、マルチグラジエント信号の積分を研究することは困難です。
従来のボイデンチャンバーアッセイの制約の一部に対処するために、マイクロ流体アッセイが開発され、カスタマイズ可能な濃度勾配を形成しました1。マイクロ流体システムを作成するための標準的な方法では、リソグラフィー技術のためのクリーンルームが必要です。これらのテクニックは、特に標準的な教室の環境では習得するのが難しい場合があります。そこで、クリーンルームを使わずに細胞移動を測定するためのチャンバーシステムを設計しました。当社のシステムを使用すると、アッセイのウェルを好みのサイズに調整でき、カスタマイズされた傾きの線形濃度勾配を生成できます。これにより、ランダムな動きから走化性を正確に測定することができます。この設計は、さまざまな化学刺激に応答した細胞増殖をモデル化するための安価で使いやすいシステムです。

<table><tbody><tr><td>シルガード 184 シリコーン エラストマー キット</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>761036</td><td>ポリ (ジメチルシロキサン) 2 部構成キット シリコーン エラストマー ベースとシリコーン エラストマー硬化剤を含む</td></tr><tr><td>アクリル シート</td><td>US プラスチック</td><td>44200</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てペトリ皿&nbsp;</td><td>ファルコン&nbsp;</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート&ndash;デキストラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20s-100MG</td><td></td></tr><tr><td>アガロース、I型、低EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013-100G</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルス培地 フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>11965092</td><td>細胞培地の成分</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児</td>血清 <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>16000036</td><td>細胞培地の成分</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140148</td><td>細胞培地の成分</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24384</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Cell Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AME3300</td><td>Time-lapse imagesの撮影に使用される機器</td></tr><tr><td>Versa Laser</td><td>Universal Laser Systems, Inc.&nbsp;</td><td>モデル番号VLS2.30</td><td>プラスチックの切断に使用されるレーザーカッター</td></tr></tbody></table>

細胞移動を測定するためのカスタマイズ可能な商工会議所

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

細胞遊走は免疫応答、成長、および創傷治癒の重要な一部です。細胞遊走は、細胞外マトリックス、および可溶性および非水溶性の化学的因子（ 例えば 、化学誘引物質）との間の相互作用が関与する複雑なプロセスです。このようなボイデンチャンバーアッセイ、分周器のいずれかの側に細胞を計数することにより、作業のような細胞の遊走を測定するための標準的な方法。これらの技術は、使いやすいです。しかし、彼らは、異なるアプリケーションのために少しの幾何学的修正を提供しています。対照的に、マイクロ流体デバイスは、可溶性因子1、2のカスタマイズ可能な濃度勾配を有する細胞遊走を観察するために使用することができます。しかし、マイクロ流体ベースのアッセイを作製するための方法は、学ぶことは困難な場合があります。 ここでは、化学物質の濃度勾配に応答して細胞遊走を測定するための細胞培養チャンバを作成するための容易な方法を記載します。私たちの細胞マイルグレーションチャンバー法は、様々な用途のための細胞移動を研究するために、別の直線濃度勾配を作成することができます。この方法は、使用が比較的容易であり、典型的には学部学生によって行われます。 マイクロチャンネル室はよくペトリ皿に、最終的なマイクロ流路室の形状のアクリルインサートを配置することによって作成されました。この後、ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）は、インサートの上に注ぎました。 PDMSを硬化させ、次いで、インサートを除去しました。これは、任意の所望の形状や大きさのウェルの作成を可能にしました。細胞は続いてマイクロチャネルチャンバーに添加することができる、可溶性薬剤は、所望の薬剤にアガロースブロックを浸漬することによってウェルのいずれかに添加することができます。アガロースブロックをウェルのいずれかに添加し、タイムラプス画像は、細胞遊走を定量するために、マイクロチャネル室を撮影することができます。この方法のバリエーションは、このメソッドのHIGを作り、所与の用途のために作ることができますHLYカスタマイズ可能。

図2は、細胞がメッキされているところから、チャネルの反対側の端部に配置されたウシ胎児血清の勾配に応じて、チャネル全体のセルフロントの動きを示しています。細胞フロント48時間（ 図2A）、72時間（ 図2B）、96時間（ 図2C）、および120時間（ 図2D）ポストプレーティングで示されています。セルフロントの移動は、これらのタイムラプス画像で追跡し、移動距離と成長率は、MATLABの関数polyfitによって計算しました。このことから、平均セルフロント速度が13.4ミクロン/時（ 図3）であることが見出されました。 図4は、チャネルの一端にデキストラン浸したアガロースブロックを配置し、デキストランは、12時間のためのチャネルを通って拡散することを可能にすることによって確立された蛍光勾配を示しています。タイムラプス画像は、毎時間で撮影した...

このプロトコルはまた、ポリマーマトリックスからの薬物の拡散速度を決定するために使用される化学誘引物質に応答した細胞遊走を測定するためのカスタマイズ可能な方法を詳述します。

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

この手順の全体的な目的は、化学走性剤および化学反発剤が細胞遊走に及ぼす影響を研究するための簡便な方法を提供することです。この手法は、異なる増殖因子が創傷治癒に及ぼす影響など、細胞相互作用分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本技術の主な利点は、さまざまな用途に合わせて容易にカスタマイズでき、あらゆる習熟度の研究者が簡単に使用できることです。本手順の実演は、学部生のAniqa Chowdhuryと、私の研究室の大学院生であるTyler Harveyが行います。まず、マイクロチャネルの希望する形状でCADファイルを作成します。必要な勾配を得るために、チャネルの幅と長さを調整してください。ここでは、2.254 cm四方の正方形が幅0.127 cmのチャネルで接続されています。次に、マイクロチャネルに適切な深さを出すため、希望の厚さのアクリル板を用意します。厚すぎるシートは切断が困難であり、薄すぎるシートは工程中に破損または歪む可能性があるため、アクリルシートの幅は約1/16インチが理想的です。CADファイルをレーザー切断装置にインポートし、アクリル板を切断面に配置します。次に、メーカーのプロトコルに従ってチャンバーを切断します。切断したばかりのバーベル形状のアクリル切り出し片を小型のシャーレに入れ、使用するまでカバーをかけて保管します。秤量皿にエラストマーベースを10部、硬化剤を1部加え、マイクロピペットを用いて5分間攪拌します。混合物を真空チャンバーに移し、30分間真空引きしてPDMS内の気泡を除去します。完了後、真空を解除し、秤量皿を取り出します。脱気したPDMSを、小型ペトリ皿に入れたバーベル状のアクリル製カットアウトの上に注ぎます。PDMSがインサートを完全に覆っていることを確認してください。PDMSを室温で少なくとも18時間硬化させ、その後、メスでアクリル片の周囲のPDMSを慎重に切り取り、インサートを取り出します。標準的なセルカルチャーキャビネット内で、マイクロチャネルチャンバーをシャーレに入れ、機能面を上にして70% ethanolで完全に覆います。その後、フードを閉じてUVライトを点灯させ、チャンバーを1〜2時間UV照射します。曝露後、ラミナーフローフードを開け、気流が安定するまで15分間待ちます。次に、70%ethanolを取り除き、チャンバーを滅菌PBSで2回洗浄します。洗浄1回につき1 mLのPBSを使用してください。最終洗浄後、PBSを除去し、蓋を開けたままにしてチャンバーを一晩乾燥させます。テストする細胞種を回収し、0.4% trypan blue 400 µLに細胞懸濁液 100 µLを加えて、穏やかに混合します。この溶液 100 µLをヘモサイトメーターに適用し、ガラスカバーガラスの下にある両方のチャンバーをゆっくりと満たします

a-customizable-chamber-for-measuring-cell-migration

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

がん幹細胞の移動を調査するための区分するマイクロ流体デバイスが記載されている。この小説のプラットフォームは、生存細胞の微小環境を作成し、生細胞運動の微視的な可視化を可能にします。非常に運動性のがん細胞は、潜在的に、より効果的な将来の治療法につながる積極的な浸潤の分子メカニズムを研究するために隔離されています。...

区分するマイクロ流体デバイスとライブセルイメージングを使用した癌幹細胞の移行の評価

phagokinetic運動追跡アッセイは、細胞の動きを評価するために使用される方法です。具体的には、アッセイは、定量的な方法で時間をかけてケモキネシス（ランダム細胞の運動性）を測定します。アッセイは、コロイド金でコーティングされたカバースリップ上で彼らの動きの測定可能なトラックを作成する細胞の能力を活用しています。...

Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価

生細胞遊走試験のための顕微鏡検査室における接着剤および可溶性勾配のアセンブリのための方法が記載されている。エンジニアリング環境は、ソリューションの勾配と防汚表面と接着剤のトラックを結合し、したがって1つは、指導の手がかりの相対的な重要度を決定することができます。...

蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

一次元閉じ込められた微小環境における細胞の自発的な遊走を研究するための定量的方法が記載されている。この方法は、微細加工されたチャネルを利用し、単一の実験では、異なる条件下で多数の細胞の遊走を研​​究するために使用することができる。...

微細加工チャネルにおける細胞移動の研究

特定の疾患の病態生理学を理解し、治療介入のための新しい戦略を特定するために、早期の内皮細胞(EEC)の移動の調査が重要です。次のプロトコルは、EECの調査に適応した細胞遊走を評価する技術について説明しています。...

有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

細胞浸潤と移行の解析のための 2 つの方法の事例分析: ボイデン室アッセイと体外ビデオ顕微鏡を用いた創傷治癒アッセイ。これらの 2...

細胞浸潤および移行プロセスの評価: ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチの比較創傷アッセイと boyden 教授区域の試金

このプロトコルでは、細胞の微小環境を維持しながら三次元の設定のセルの移行と侵略の機能を定量化に使用できる反転垂直浸潤能の測定法について説明します。この試金は稀および/または敏感な細胞に適しています。...

上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル

現在のプロトコルでは、がん細胞の遊走とリアルタイムで単一のプラットフォームに侵略を調査、細胞の移動と形態の勉強を簡単に再現できると時間効率の良いオプションを提供する統合的な手法について説明します。...

自動生細胞固体撮像素子を使用して単純な移行/侵略ワークフロー

ここでは、粒状ハイドロゲルの界面内および界面への3D細胞遊走を定量的に評価するためのプロトコールを紹介します。...

粒状ハイドロゲル生体材料内および粒状ハイドロゲル生体材料内への三次元細胞移動の定量化

小胞放出の動態を測定する能力は、神経伝達の基本のいくつかの洞察を提供することができます。ここでは、海馬ニューロン培養における前シナプス小胞の放出速度を測定するために赤色蛍光色素FM...

FMラベリングを用いた神経細胞の測定エキソサイトーシス

学ぶカスタマイズ可能な微小チャンバーを用いた細胞移動測定法。傷治癒や化学走性因子の効果を研究するための簡便な手法で、あらゆるスキルレベルの研究者が利用可能です。

細胞移動を測定するためのカスタマイズ可能な商工会議所

さらに動画を探す