細胞移動を測定するためのカスタマイズ可能な商工会議所

この手順の全体的な目標は、走化性物質とケモパルス剤が細胞遊走に及ぼす影響を研究する簡単な方法を提供することです。この方法は、さまざまな成長因子が創傷治癒に及ぼす影響など、細胞相互作用分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、さまざまなアプリケーションに合わせて簡単にカスタマイズでき、あらゆるスキルレベルの研究者が簡単に使用できることです。

この手順を実演するのは、私の研究室の学部生であるAniqa Chowdhuryと大学院生のTyler Harveyです。まず、マイクロチャネルの目的の形状でCADファイルを作成します。チャネルの幅と長さを調整して、必要なグラデーションを実現します。

ここでは、2.254センチメートルの正方形が0.127センチ幅のチャネルで接続されています。次に、マイクロチャネルの適切な深さを作成するために、目的の厚さのアクリル片を入手します。アクリルシートの幅は約16分の1インチで、厚いシートはカットが難しく、非常に薄いシートはプロセス中に壊れたり反ったりする可能性があるため、理想的です。

CADをインポートします file レーザー切断装置に、アクリル片を切断面に置きます。次に、製造元のプロトコルに従ってチャンバーを切り取ります。切りたてのバーベル型のアクリルカットアウトを小さなペトリ皿に入れ、必要になるまで覆います。

計量ボートで、エラストマーベースの10部と硬化剤の一部を追加し、マイクロピペットを使用して5分間攪拌します。混合物を真空チャンバーに移し、真空を30分間引っ張って、PDMSから閉じ込められた気泡を取り除きます。終了したら、バキュームをオフにし、計量ボートを取り外します。

脱気したPDMSを、小さなシャーレのバーベル型のアクリルカットアウトの上に注ぎます。PDMSがインサートを完全に覆っていることを確認します。PDMSを室温で少なくとも18時間硬化させた後、メスでアクリル片の周りのPDMSを慎重に切断し、インサートを取り外します。

標準的な細胞培養キャビネットで、マイクロチャネルチャンバーをフィーチャー面を上にして、70%エタノールで完全に覆うシャーレにマイクロチャネルチャンバーを置きます。次に、ボンネットを閉めてUVライトをオンにします。チャンバーをUVライトに1〜2時間さらします。

露光後、層流フードを開き、フローフードが流れを再確立するまで15分間待ちます。次に、70%エタノールを除去し、滅菌PBSでチャンバーを2回洗浄します。洗濯ごとに1ミリリットルのPBSを使用してください。

最終洗浄後、PBSを取り出し、蓋を外した状態でチャンバーを一晩乾燥させます。試験する細胞タイプを収穫し、100マイクロリットルの細胞懸濁液を400マイクロリットルの0.4%トリパンブルーに加え、穏やかに混合します。この溶液の100マイクロリットルを血球計算盤に適用し、ガラスカバースリップの下の両方のチャンバーを静かに満たします。

10倍対物レンズを備えた顕微鏡を使用して、血球計算盤のグリッドに焦点を合わせます。次に、ハンドタリーカウンターを使用して、血球計算盤の16マスの4つのセットすべて内の生きた持続していない細胞をカウントします。総セル数を4で割り、この数に50, 000を掛けて、セル懸濁液のミリリットルあたりのセル数を求めます。

この計算に基づいて、2500個の細胞と100マイクロリットルの培地を各チャンバーの1つのウェルに加えます。細胞をチャンバー内に60分間置いてから、培地を追加します。まず、アガロースを水に加え、電子レンジで溶液を1分間、またはアガロースが完全に溶解して溶液が透明になるまで加熱します。

溶液を15〜30秒間冷ましてから、ペトリ皿に注ぎます。気泡を取り除くには、ペトリ皿を真空チャンバーに入れ、真空下で30分間アガロースを固化させます。固まったら、ペトリ皿からメスで2ミリメートル×2ミリメートル×2ミリメートルのアガロースの立方体を切り取ります。

所望の濃度のケモタクティクス因子を含む溶液にキューブを完全に沈め、アガロースブロックを室温で一晩浸します。次に、化学戦術因子を含むアガロースブロックをマイクロチャネルチャンバーの遠端に配置します。ポリスチレンマイクロビーズなどのマーカーやチャンバー内の微細な欠陥を利用します。

セルの相対的な開始位置を特定するため。イメージングソフトウェアを使用して、12時間ごとに移動する細胞前面のタイムラプス画像を撮影します。ここに示す一連の画像は、チャネルの反対側の端に配置されたウシ胎児血清の勾配に応答して、チャネルを横切る細胞前面の動きを示しています。

移行距離は、デバイスの微視的欠陥からの成長フロントまでの距離に基づいて測定されました。これらの測定から、平均細胞前面速度は毎時13.4マイクロメートルであることがわかりました。この手法を習得すると、4時間で完了し、PDMSの治癒にはさらに18時間の待ち時間、タイムラプスイメージングにはさらに12時間の待ち時間が必要です。

開発後、この技術は、実験室の経験がほとんどない学部生を含む、さまざまなスキルレベルの研究者が、in vitroで創傷治癒と細胞移動を簡単に探索できる道を開きました。この手順を試行する際は、マイクロチャネルチャンバーを正常に製造するために、アクリルインサートをPDMS型から慎重に取り外すことを忘れないでください。このビデオを見れば、さまざまな化学的手がかりに応答した細胞移動を研究するためのシンプルなマイクロチャネルチャンバーの作り方を十分に理解できるはずです。

この手順に続いて、複数の可溶性化学勾配、基質、流体のシアー、電場などの他の手がかりを研究して、それらが細胞移動に及ぼす影響を研究することができます。レーザーカッターでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、適切なトレーニングを受けたり、個人用保護具を使用したりするなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。