Name: NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化 +膵臓前駆細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶ、ヒト多能性幹細胞からNKX6.1陽性膵臓前駆細胞を効率的に誘導する4段階分化プロトコル。糖尿病治療や薬剤開発のための細胞モデル構築に応用可能です。

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この原稿は、トロント一般と西洋財団とバンティング＆ベスト糖尿病センター、大学健康ネットワーク大学院賞からの資金によってサポートされていました。

ソリューションとメディアの作製注：無菌環境での細胞培養のためのすべてのメディアを準備します。媒体を作製し、直ちに使用しなければなりません。試薬の詳細は材料表で提供されます。 <ol><li> 分化培地 <ol><li> 1％グルタミンを含むRPMI中、2μMCHIR 99021、100ng / mlのアクチビンA、10 4 M MTG：0日分化メディアを準備します。 </li><li> 1％グルタミン、100ng / mlのアクチビンA、10 4 M MTG、5 ngの/ mlのbFGF、50μg/ mlのアスコルビン酸を含むRPMI培地：日1-2分化のメディアを準備します。 </li><li> 1％グルタミン、1％のB27、10 4 M MTG、0.75μMドルソモルフィン、50 ngの/ mlのFGF10を含むRPMI培地：日3-5分化のメディアを準備します。 </li><li>日6-7分化メディアを準備しますDMEMを1％グルタミン、1％のB27、50μg/ mlのアスコルビン酸、50 ngの/ mlのFGF10、0.25μMのSANT-1、2μMレチノイン酸、50 ngの/ mlのノギンで。 注：レチノイン酸は、最後の培地に添加されるべきであり、メディアが酸化分解15を防止するために、光から保護されるべきです。 </li><li>日8-12分化メディアを準備しますDMEMを1％グルタミン、1％のB27、50μg/ mlのアスコルビン酸、50 ngの/ mlのノギン、100ng / mlののhEGF、10 mMのニコチンアミドと。 </li></ol></li><li> PBS中10％FBS、マイナスカルシウムとマグネシウム：FACS緩衝液を準備します。 </li></ol> 2. HESC分化注：HESC、解凍継代およびbFGF 16を補充しKOSRベースのメディアの存在下で照射したマウス胚性線維芽細胞上で展開されます。細胞は、80から95までパーセントの集密度に達したときのhESCは、分化の準備ができています。この時点でコロニーが定義された境界線と&#39;domelike」構造（ 図1A）との大きさであるべきです。すべての細胞培養は、平底、0.1％ゼラチンでコーティングした組織培養処理プレート中で行われます。典型的に、細胞は6で増殖させますかそれぞれ2ミリリットルまたは1ミリリットルのメディアボリュームで12ウェルプレート、。 <ol><li> 0日目に、0日目の分化メディアでKOSRベースのメディアを交換することによって分化を始めます。 </li><li> 1日目および2日目に、静かに吸引する前に、単層から任意の死んだ細胞を除去するためにプレートを振ります。日1-2分化のメディアと交換してください。 </li><li> 3日目に、フローサイトメトリーのための収穫細胞。細胞が90％以上CXCR4 + / CD117 +を発現した場合は、2.4に進みます。 </li><li> 3日目および5日目に、静かに前吸引に単分子層から任意の死んだ細胞を除去するためにプレートを振ります。日3-5分化のメディアと交換してください。 </li><li>日6および7に、日6-7分化のメディアと交換してください。 </li><li> 8日、10と12日、日8-12分化のメディアと交換してください。 </li><li> 13日目に、フローサイトメトリーのための収穫細胞は、PDX1とNKX6-1式を決定します。 </li></ol>フローサイトメトリー分析のため3.収穫細胞<ol><li>で細胞を解離1X商業トリプシン溶液を製造業者のプロトコールに従って、3分間37℃でインキュベートします。 </li><li> 30μlのDNアーゼIと千μlのFACS緩衝液中で単一細胞を商業トリプシン溶液を除去し、再懸濁</li><li>マイクロチューブに35μmのナイロンメッシュセルストレーナーと転送を使用してフィルタ細胞。 </li><li> 5分間、455×gで遠心分離した細胞。ライブまたは固定のいずれかの染色のための細胞を準備します。 </li></ol>フローサイトメトリー用4.染色<ol><li> 3日目のライブ染色のための準備を流れます <ol><li>千μlのFACSバッファーで細胞を再懸濁し。 （未染色および染色された両方のサンプル用）96ウェルプレートの2ウェルに200μlの（約1-3×10 5細胞）を転送。 </li><li> 2分間931×gでプレートを遠心。プレートを反転させ、上清を除去します。 </li><li> APC及びCD117：PE（Mは表をaterials参照）3用の一次結合抗体、CXCR4とステイン光から保護し、室温で0分。 </li><li> 2分間931×gでプレートを遠心。プレートを反転させ、上清を除去します。 </li><li> 100μlのFACS緩衝液中に再懸濁サンプル。 </li><li> 2分間931×gでプレートを遠心。プレートを反転させ、上清を除去します。 </li><li> 1ミリリットルマイクロ試験管または5ミリリットル丸底チューブに300〜500μlのFACSバッファーの全体積で各サンプル、転送を再懸濁します。 </li><li> 17フローサイトメーター上で実行したサンプル。サンプルはすぐに実行することができない場合は、4°Cで保存光から保護します。 </li></ol></li><li> 13日目に固定された染色のための準備を流れます <ol><li> 4℃で24時間、商業固定/透過処理溶液中の細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> 5分間、455×gでサンプルを遠心。 400μlのパーマ/洗浄溶液中に再懸濁します。 </li><li> TWにサンプル（約0.5〜1×10 6細胞）の200μLを移します（IgGコントロールとPDX1 / NKX6-1染色用）を、96ウェルプレートのウェルO。 2分間931×gで遠心分離します。 </li><li>抗PDX1および抗NKX6-1プライマリまたはアイソタイプ対照抗体を含有する100μlのパーマ/洗浄溶液中で細胞ペレットを再懸濁（ 材料表を参照してください）。 4℃で一晩インキュベートします。 </li><li> 2分間931×gでプレートを遠心。プレートを反転させ、上清を除去します。 100μlのパーマ/洗浄溶液中に再懸濁サンプル。 </li><li> 2分間931×gでプレートを遠心。プレートを反転させ、上清を除去します。 </li><li>光から保護し、室温で1時間、二次抗体を含有する100μlのパーマ/洗浄でサンプルを再懸濁します。 </li><li> 2分間931×gでプレートを遠心。プレートを反転させ、上清を除去します。 </li><li> 100μlのパーマ/洗浄溶液中に再懸濁サンプル。 </li><li> 2分間931×gでプレートを遠心。プレートを反転させ、上清を除去します。 </li><li>代表ステップ4.2.9と4.2.10を食べます。 </li><li> 1ミリリットルマイクロ試験管または5ミリリットル丸底チューブに300〜500μlのFACSバッファーの全体積で各サンプル、転送を再懸濁します。 </li><li> 17フローサイトメーター上で実行したサンプル。サンプルはすぐに実行することができない場合は、4°Cで保存光から保護します。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Canadian Diabetes Association. , Available from:
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<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
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<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+progenitor+domain+guides+pancreatic+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis.</a> Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).</li>
<li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li>
<li>Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+stability+in+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid stability in stem cell cultures.</a> Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).</li>
<li>Korytnikov, R., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+polyhormonal+and+multipotent+pancreatic+progenitor+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells.</a> Methods. , 56-64 (2016).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37004(2012).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

成功し、in vitroで hPSCsからNKX6-1 +膵臓前駆細胞を生成する膵臓の開発中にキーの発達段階を管理する特定のシグナル伝達経路の正確なレギュレーションを伴うhPSCsの高品質の文化と向かう分化の使用に依存しています。このプロトコルは、以下の考慮がなされるべきである効率的なNKX6-1生成を確実にするために、先に示したように3 HPSC線の多様にわたってNKX6-1の強い発現を誘導するために使用することができます。すべての細胞培養および培地製剤は、汚染を防止するために、無菌環境で行われることが重要です。 hESCコロニーは、適切なコンフルエントに達していると分化前の0日目を開始するに区別するために開始していないことが重要です。最適ではないヒトES細胞と分化を開始すると、非効率的な胚体内胚葉の誘導および進行の開発につながることができますアル・ステージ。胚体内胚葉の効率的な誘導を確保するために、フローサイトメトリーによって3日目に細胞を分析することが重要である理由です。 3日目に二重陽性CXCR4 + CD117 <su...

糖尿病の有病率は増加しており、カナダ糖尿病協会によると、1型糖尿病（T1D）1を持つこれらの個体5〜10％の、カナダで1100万人が糖尿病または前糖尿病であると推定されています。 T1Dは、ランゲルハンス島の中に配置されているインスリン産生β細胞の破壊により引き起こされる自己免疫疾患です。現在、T1Dとの生活の個人は、インスリン2の外因性の源を必要とします。インスリン療法の進歩にもかかわらず、T1D患者は、血糖値を調節する困難な時期を持っており、ハイポや高血糖の両方を苦しみ続けるために続けています。 T1Dにおいて正常血糖を回復させる治療の有望な形は、in vivoおよびin vitro 3 の両方で β細胞のインスリン産生の無制限の供給を生成するために使用することができるヒト胚性幹細胞（hESC）の使用であります<sクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 4、5、6、7アップ。 β様する細胞は、それが可能なin vitroで糖尿病を研究することを可能にする2型糖尿病のための新たな治療標的の同定を可能にし、T1D患者への移植用の細胞を提供することができるヒトES細胞を分化。 in vitroでのヒトES細胞からのインスリン産生細胞の生成で最も成功した試みは、膵臓の開発4、5中に発生する胚のイベントを再現することです。これは、正確に開発膵臓の主要な段階をモデル化するための明確なシグナル伝達経路の操作を必要とします。膵臓の開発は、CXCR4およびCD117（C-KIT）8、9の発現によって特徴付けられる胚体内胚葉の誘導で始まります。 definitの正確なレギュレーションアイブ内胚葉組織は、その後、前方対後方と腹側背パターニングを受け、腸管の形成のために必要とされます。背側と腹側膵臓芽は、膵臓の開発10のために必要である膵臓および十二指腸ホメオボックス遺伝子（ のPdx1）を発現する後部前腸の領域から出てきます。背側と腹側芽ヒューズはその後、大規模な上皮再構築および展開11を受ける膵臓を形成します。内分泌と外分泌系統へのコミットメントを表明多能性前駆細胞（MPCは）の生成を伴っている、とりわけ、転写ははPdx1、NKX6.1およびPtf1a 12、13因子 。内分泌および導管細胞になるだろうMPCがPtf1a発現を減少させながらNkx6-1を発現し続けます。これに反して、外分泌系統細胞はexpressioを失うことになりますNkx6-1のnおよびPtf1a式 12を維持します 。 転写因子Nkx6-1、特にβ細胞する内分泌前駆細胞の分化の間に、膵臓の発達において重要な役割を有しています。前述のように、Nkx6-1の欠失は、膵臓の発達14中β細胞の障害の形成をもたらします。したがって、 インビトロおよびインビボの両方において 、インスリン産生β細胞を生成するNkx6-1の効率的な誘導を必要とします。 我々は最近、効率的にhPSCsからPDX1 + / NKX6-1 +膵臓前駆細胞を生成するためのプロトコルを開発しました。これらのHPSC由来の膵臓前駆細胞は、免疫不全マウス3への移植の際に成熟β細胞を生成します。 1）胚体内胚葉誘導：分化プロトコルは、特徴的な4段階に分けることができます、2）後部前腸パターニング、3）膵臓仕様および4）NKX6-1誘導。ここでは、有向分化の各ステップの詳細な説明を提供します。

<table><tbody><tr><td><ストロング>培地およびサイトカイン</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-チオグリセロール(MTG)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>アクチビンA</td><td>R&D</td><td>338-AC/CF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27サプリメント</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Buffer</td><td>BD Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>BD Perm/Wash バッファー、1x</td><td>BD Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>CHIR990210</td><td>トクリス</td><td>4423a</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ's モディファイド イーグル ミディアム (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>VWR</td><td>80510-412&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ドルソモルフィン</td><td>Σ</td><td>P5499</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Wisent</td><td>88150</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R&D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>豚皮ゼラチン</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Σ</td><td>NO636</td><td></td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>R&D</td><td>3344-NG</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Tocris</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>フローサイトメトリー用抗体(ワーキング希釈)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD117 PE (1:100)</td><td>Life Technologies</td><td>CD11705</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4 APC (1:50)</td><td>BD&nbsp;バイオサイエンス</td><td>551966</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗マウス IgG (H+L), Alexa Fluor 647 コンジュゲート (1:400)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A-31571</td><td></td></tr><tr><td>ロバ 抗ヤギ IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)&nbsp;</td><td>ジャクソン免疫研究所</td><td>705-546-147</td><td></td></tr>アイソ<tr><td>タイプコントロールマウスIgG&nbsp;</td><td>ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ&nbsp;</td><td>015-000-003</td><td></td></tr>アイソ<tr><td>タイプコントロールヤギIgG</td><td>R&D&nbsp;&nbsp;</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>NKX6-1 (1:2,000)</td><td>DSHB</td><td>F55A10</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (1:100)</td><td>R&ダ</td><td>AF2419</td><td></td></tr></tbody></table>

nkx6-1への多能性幹細胞の効率的分化<sup&gt; +</sup&gt;膵臓前駆細胞

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

多能性幹細胞は、自己に更新し、それらの研究および糖尿病の将来の治療のために使用することができる膵臓前駆細胞の生成のための魅力的なソース作り、複数の系統に分化する能力を有します。この記事では、ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）から膵臓前駆細胞を生成するように設計された4段階の分化プロトコルの概要を説明します。このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞（HPSC）行数に適用することができます。膵臓前駆細胞を生成するために取られたアプローチは、正確に膵臓発生の主要な段階をモデル化するためにヒトES細胞を区別することです。これは、アクチビンA、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）およびCHIR990210の存在下で細胞を培養することによって達成される胚体内胚葉の誘導で始まります。線維芽細胞増殖因子10（FGF10）とドルソモルフィンとのさらなる分化とパターニングは、後部前腸に似た細胞を生成します。レチンの追加OIC酸、ノギンは、SANT-1およびFGF10は膵臓内胚葉に特徴的な細胞内に後部前腸細胞を区別します。最後に、上皮成長因子（EGF）の組合せは、ニコチンアミドとノギンは、PDX1 + / NKX6-1 +細胞の効率的な生成につながります。フローサイトメトリーは、膵臓の発達の重要な段階に特異的なマーカーの発現を確認するために行われます。ステージ4の終わりにPDX1 + / NKX6-1 +膵臓前駆細胞は、免疫不全マウスへの移植時に、成熟β細胞を生成することができ、さらに、インビトロでのインスリン産生細胞を生成するように分化させることができます。それは、in vitroでヒト膵臓の開発を研究するためのプラットフォームを提供し、に分化する能力を有する細胞の供給源を提供するようしたがって、このプロトコルで示されているようにPDX1 + / NKX6-1 +膵臓前駆細胞の効率的な生成は、非常に重要ですEVができβ細胞entually糖尿病の治療のために使用されます。

図1（a）の模式的に示したように、膵臓前駆細胞を効率的に生成するには、分化プロトコル中に特定のシグナル伝達分子の正確加え、続いて未分化細胞の適切な成長および維持に依存しています。 0日目に、未分化細胞は、80から95パーセントのコンフルエントであるべきであり、コロニーは、定義されたエッジ（ 図1A）を持っている必要があります。細胞死は、この段階では非常に一般的ですので、ステージ1の間に、メディアはおそらく曇って表示されます。ステージ1の終わりまでに、細胞は90％（ 図1B）よりも高い割合で、胚体内胚葉マーカー、CXCR4およびCD117を共発現する必要があります。 細胞は、4段のプロトコルを通じて区別するように、細長い楕円状の外観から、それらの形態の変化は（ステージ1で観察され、2）より小さな、丸い細胞に（段階3で見として4）（ <stチョロン&gt...

ここでは、in vitroで NKX6-1 +膵臓前駆細胞にヒト胚性幹細胞を区別するために4段階のプロトコルを記述します。このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞株の多様に適用することができます。

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化<sup&gt; +</sup&gt;膵臓前駆細胞

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

この手順の全体的な目的は、ヒト多能性幹細胞を膵臓開発の4つの主要な段階を経て分化させることにより、NKX6.1を発現する膵前駆細胞をin vitroで効率的に生成することです。ヒト多能性幹細胞を膵臓開発の4つの主要な段階を通じて分化させることで、本プロトコルはヒト膵臓開発をin vitroで研究するためのモデルを提供します。既存のプロトコルに対する本手法の主な利点は、多様なヒト多能性幹細胞株を用いて、高比率のNKX6.1陽性膵前駆細胞を生成できることです。膵前駆細胞はインスリン産生ベータ様細胞を生成する能力を有しているため、本手法を用いることで、糖尿病治療、創薬、および疾患モデリングのための細胞を開発することが可能になります。0日目に、KnockOut血清代替培地を0日目分化培地に置換して分化を開始させます。その後、1日目と2日目には、培地を吸引する前にプレートを静かに振って、単層から死細胞を除去します。その後、1〜2日目の分化培地に交換します。3日目に、フローサイトメトリー用に細胞を回収します。細胞のCXCR4およびCD117の発現率が90%を超えていれば、効率に達したことになります。次に、吸引前にプレートを静かに揺らして単層から死細胞を除去し、分化3〜5日目の分化培地と交換します。フローサイトメトリーによって、3日目までに定型内胚葉が効率的に誘導されていることを確認することが重要です。CXCR4とCD117の両方を発現している細胞の割合が90%未満である場合、膵前駆細胞への分化が損なわれる可能性があります。6日目と7日目には、培地を6～7日目分化培地へと交換します。8日目、10日目、および12日目には、培地を8～12日目分化培地へと交換します。その後、13日目に、PDX1およびNKX6.1の発現を判定するため、フローサイトメトリー用に細胞を回収します。フローサイトメトリー解析用に細胞を回収するため、メーカーのプロトコルに従って市販のTrypsin溶液で細胞を解離させ、37 °Cで3分間インキュベートします。3分後、Trypsin溶液を除去し、単一細胞を30 µLのDNA Oneを含む1,000 µLのfax bufferに再懸濁します。その後、35 µmのナイロンメッシュセルストレーナーを用いて細胞をろ過し、マイクロ遠心チューブに移します。生細胞または固定細胞の染色の準備を行う前に、細胞を 455 ×g で5分間遠心分離します。次に、細胞を 1,000 µL の FACS バッファーに再懸濁します。未染色および染色サンプルの両方について、96ウェルプレートの2つのウェルに 200 µL ずつ分注します。その後、プレートを931 ×gで2分間遠心分離し、プレートを反転させて上清を除去します。次に、最終容量100 µLの一次結合抗体を用いて細胞を染色し、室温・遮光条件下で30分間静置します。続いて、プレートを931 ×gで2分間遠心分離し、2分後にプレートを反転させて上清を除去します。最後に、サンプルを100 µLのfax bufferに再懸濁します。次に、プレートを931 ×gで2分間遠心分離します。プレートを反転させて上清を除去してください。続いて、サンプルを300〜500 µLのfaxバッファーで再懸濁し、1 mLマイクロテストチューブまたは5 mLラウンドボトムチューブに移し、フローサイトメーターで分析します。サンプルをすぐに解析できない場合は、4 °Cで遮光保存してください。本手順では、細胞ペレットを市販の固定・透過化溶液に再懸濁し、4 °Cで24時間静置します。24時間後、サンプルを455 ×gで5分間遠心分離し、その後、400 µLの市販の透過洗浄溶液に再懸濁します。次に、96ウェルプレートの2つのウェルに、IgGコントロール用およびPDX1、NKX6.1染色のためのサンプルを200 µLずつ分注し、プレートを931 ×gで2分間遠心分離します。その後、抗PDX1および抗NKX6.1一次抗体またはアイソタイプコントロール抗体を含む市販のPerm Wash溶液100 µLで細胞ペレットを再懸濁します。これらを4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、プレートを 931 ×g で2分間遠心分離し、プレートを反転させて上清を除去した後、100 µL の市販の perm wash solution でサンプルを再懸濁します。次に、プレートを 931 ×g で2分間遠心分離します。プレートを反転させて上清を除去します。次に、二次抗体を含む100 µLのperm wash solutionにサンプルを再懸濁し、室温で1時間、遮光して静置します。1時間後、プレートを931 ×gで2分間遠心分離し、プレートを反転させて上清を除去します。続いて、サンプルを100 µLの市販のperm wash solutionで再懸濁し、プレートを931 ×gで2分間遠心分離し、プレートを反転させて上清を除去します。その後、再度サンプルを100 µLの市販のperm wash solutionで再懸濁し、プレートを931 ×gで2分間遠心分離した後、上清を除去します。次に、サンプルを300から500 µLの FACSバッファーで再懸濁し、フローサイトメトリー分析用に個別の1 mL試験管または5 mLラウンドボトムチューブに移します。ここに、ヒト胚性幹細胞からの膵前駆細胞誘導の概略図を示します。これには、分化日数、発生段階、基本培地、および各段階で添加されるサイトカインが示されています。また、膵分化の主要な段階における位相差顕微鏡像をここに示します。H1細胞は、図示した4段階の分化プロトコルに従って分化させた。0日目に未分化ヒト胚性幹細胞、ステージ1に決定的な内胚葉、ステージ2に後方前腸、ステージ3に膵内胚葉、そしてステージ4にNKX6.1陽性の内胚葉由来膵前駆細胞とした。この図は、3日目におけるCXCR4 PEおよびCD117 APC抗体染色の代表的なフローサイトメトリープロットを示している。こちらが未染色のサンプル、そしてこちらが染色済みのサンプルです。また、この図は、NKX61およびPDX1を発現するステージ4由来の膵前駆細胞に関する、13日目の代表的なフローサイトメトリープロットを示しています。こちらがIgGコントロールで、こちらが染色済みのサンプルです。この手法に習熟すれば、13日間で完了させることができます。ただし、使用する細胞株によって異なる場合があります。本手順を行う際は、ロット間のばらつきがあるため、すべての試薬をテストすることが重要です。この手順に従った後、NKX6.1陽性の膵前駆細胞を、他の既報のプロトコルを用いてインスリン産生β様細胞へとさらに分化させることができます。これにより、in vitroでβ細胞の成熟と発生を研究するためのプラットフォームが提供されます。このビデオを視聴することで、細胞を発生の4つの主要段階を経由させ、ヒト多能性幹細胞を膵前駆細胞へと効率的に分化させる方法について深く理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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本プロトコルでは、ヒト多能性幹細胞からの神経節後交感神経ニューロンの生成に対する安定した、高効率な分化戦略を説明する。このモデルは、複数の自律神経障害の研究の使用のためにニューロンを利用可能にします.

フィーダーフリーおよび化学的に定義された培養条件下でのヒト多能性幹細胞を用いた後神経節系交感神経ニューロンの効率的な分化

本稿の目的は、多能性幹細胞からのヒト肝前駆物質分化を誘導する標準化されたアプローチを提供することです。すぐに使用できるメディア製剤を用いたこの手順の開発は、生物医学の研究と翻訳のためのヒト肝細胞を生成する容易なシステムをユーザーに提供する。...

定義された分化系を用いた多能性幹細胞からの肝前駆体仕様

本プロトコルは、平面単層におけるヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来する膵臓前駆細胞におけるPDX1およびNKX6.1転写因子の共発現を増加させるための増強された方法を記載する。これは、新鮮なマトリックスを補充し、細胞密度を操作し、内胚葉細胞を解離することによって達成される。...

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NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化

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