Name: 細胞内染色およびフローサイトメトリーは、高血圧のモデルにおけるマウス大動脈、腎臓及びリンパ節内のリンパ球サブセットを識別するために、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶ細胞内染色とフローサイトメトリーを用いて、高血圧モデルマウスの大動脈、腎臓、リンパ節から単一細胞懸濁液を調製し、リンパ球サブセットを同定・定量化する方法。この技術は心血管疾患における免疫応答の研究に有用である。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、フロリダ州に米国心臓協会フェローシップ賞（16POST29950007）、健康（NIH T32 HL069765）BLD、MAサレハにアメリカ心臓協会フェローシップ賞（14POST20420025）の国立研究所からの訓練助成金、およびNIHによってサポートされていましたMSMにK08賞（HL121671）。 MSMはまた、ギリアド・サイエンシズ社から研究助成金によってサポートされています

ヴァンダービルト大学の施設内動物管理使用委員会は、本明細書に記載される手順を承認しました。マウスは、飼育し、実験動物の管理と使用に関する指針に従って世話されている（国立アカデミープレス。改訂2010）。 マウスからの大動脈水切りリンパ節、腎臓および大動脈の1の単離<ol><li> CO 2吸入によりマウスを安楽死させます。 70％エタノールで胸をスプレーし、慎重に心臓を露出するためにハサミで皮膚や胸壁を開きます。 </li><li>血管系を灌流するには、右心房に小さな切開を行い、着実に21または23 G針を使用して、左心室の頂点に冷PBS（約1ミリリットル/秒）の少なくとも10ミリリットルを注入。すべての臓器は湯通しするまで灌流します。心臓が最初に白く。肝臓の白化は、灌流が十分に行われていることを示しています。 </li><li>小さな鉗子と細かいハサミを使用して、静かにカットし、腸を引き出し、胃、脾臓、膵臓および肝臓はより良い大動脈を可視化しました。 注：この手順は、胃腸管の損傷、汚染を誘発することができるように非常に正確に行う必要があります。 </li><li>切り出し、ハサミで各肺を削除します。無針注射器を用いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて胸腔をすすぎます。滅菌ガーゼを使用して、余分な血液や体液を削除します。 </li><li>細かい解剖ピンセットを用いて腹部大動脈流入領域リンパ節を削除してください。カプセルを破裂させないことを確認してください。解剖鉗子で各リンパ節の表面上の残りの脂肪を取り除きます。細かいハサミを持つ2つの腎臓を切り取ります。 </li><li>罰金、湾曲したハサミで大動脈全体（胸部と腹部大動脈）を解剖。心のレベルで開始し、慎重に離れて食道および大動脈に取り付けられ、周囲の血管周囲脂肪を維持することを確認すること腸骨分岐のレベルまでの椎骨から解剖。 注：REMOする大動脈のさらなる解剖周囲の構造は、顕微鏡下で行うことができまし。具体的には、動脈枝（頸動脈、鎖骨下動脈、腹腔動脈、腸間膜、および腎動脈）とリンパ節を削除します。これは多くの炎症細胞が高血圧の設定に存在するサイトであるため、各大動脈の周りの血管周囲脂肪の一貫性のある層を保つようにしてください。冷PBSを含む別々のチューブ内の各組織を置きます。 </li></ol>各組織からの単一細胞懸濁液の2世代<ol><li> 腎臓 注：腎臓は、機械的解離に加えて、酵素消化を組み合わせることにより、単一細胞懸濁液中に解離させることができます。 <ol><li> （5％ウシ胎児血清（FBS）を補充した）RPMI1640培地へのコラゲナーゼD（2mg / ml）を添加し、DNアーゼI（100μg/ mlの）によって腎消化溶液を調製します。腎臓サンプルあたり10ミリリットルを準備します。 </li><li>腎臓ダイジェストの10ミリリットルを含む解離チューブに2腎臓を転送するために鉗子を使用して、イオン溶液。 </li><li>製造業者の指示に従って、半自動化された解離装置を用いた機械的解離を行います。 </li><li>機械的解離後、デバイスからチューブを切り離し、酵素消化を行います。連続回転下37ºCで20分間サンプルをインキュベートします。すぐに、5％FBSを補充した冷たいRPMI 1640培地を加えることによって、酵素消化を停止します。 </li><li> 40μmのストレーナーを通して濾過した後、50ミリリットルコニカルチューブにピペッティングすることにより溶液を転送します。 1mlシリンジのプランジャーで押して離れて残りの組織をいじめます。細胞（500×gで、8分、4ºC）をペレット化。 </li><li> 36％の密度勾配遠心分離媒体を3mlの中にペレットを再懸濁します。 15ミリリットルコニカルチューブにサスペンションを転送します。静かに中断することなく、3ミリリットル36％の細胞懸濁液の下に72％密度勾配遠心分離培地の3ミリリットルを追加します。遠心分離（ブレーキなし千×gで、20分、4℃）。&lt;/李&gt; <li>免疫細胞は、界面に位置します。細胞破片を含む最上位の黄色がかった層を除去した後、冷PBSを使用して15ミリリットルにボリュームを起動します。内訳によく勾配を振ります。細胞（300×gで、8分、4℃）をスピンし、5％FBSを含むRPMI 3mlにペレットを再懸濁。トリパンブルー排除を用いて、血球計数器で生細胞数をカウントします。 </li></ol></li><li> 大動脈 <ol><li> （5％FBSを補充した）RPMI1640培地へのコラゲナーゼA（1mg / mlの）、コラゲナーゼB（1 mg / mlで）、およびDNアーゼI（100μg/ ml）を添加することによって、大動脈消化溶液を調製します。 </li><li>微細な鉗子を使用して、大動脈消化溶液1 mlを含む2mLの管に大動脈を移します。 1ミリリットル消化液中の微細なハサミで非常に小さな断片に全体の大動脈をみじん切りに。氷の上に保管してください。連続回転下、37℃で30分間、サンプルをインキュベートします。 </li><li>組織培養皿にソリューションを移し、enzymaを停止5％FBSで5回コールドRPMIのボリュームを追加することによってチック消化。 </li><li> 40μmのストレーナーを通して濾過した後、50ミリリットルコニカルチューブにピペッティングすることにより溶液を転送します。 1mlシリンジのプランジャーで押すことにより、単一細胞懸濁液に離れて残りの組織をいじめます。ストレーナーをフラッシュし、細胞（300×gで、8分、4ºC）をペレット化。 </li><li> 5％FBSを含むRPMIの10ミリリットルを追加することにより、ペレットを洗浄。細胞（300×gで、8分、4℃）をスピンし、5％FBSを含むRPMI 3mlにペレットを再懸濁。トリパンブルー排除を用いて、血球計数器で生細胞数をカウントします。 </li></ol></li><li> 大動脈流入領域リンパ節 <ol><li>組織培養皿（60ミリメートル×15 mm）の中で40μmのストレーナーを配置します。ストレーナ上のリンパ節を配置し、1mlシリンジのプランジャーで押すことにより、単一細胞懸濁液中にそれらを離れていじめます。 5％FBSを含むRPMIの2ミリリットルでストレーナーを洗浄します。シャーレ内の細胞を収集します。 </li><li>移転15ミリリットルファルコンチューブに細胞と細胞（300×gで、8分、4ºC）をペレット化。 5％FBSを含むRPMI500μlのペレットを再懸濁。トリパンブルー排除を用いて、血球計数器で生細胞数をカウントします。 </li></ol></li></ol>フローサイトメトリーによるサイトカイン検出のため3. 生体外刺激<ol><li> 5％FBS、非必須アミノ酸、0.1ミリモル、50μMのβメルカプトエタノールおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI：細胞培養培地を準備します。 </li><li>遠心分離機腎臓、大動脈およびリンパ節（300×gで8分間、4ºC）から得られた各細胞懸濁液。 1mlあたり1×10 6細胞の濃度で細胞培養培地で各ペレットを再懸濁します。 </li><li>細胞培養の1個毎mlのため（ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）、カルシウムイオノフォアのイオノマイシンを含む、およびゴルジ阻害剤ブレフェルジンA）細胞活性化カクテルを2μlを加えることによって細胞を刺激します。 注：最終濃度各コンポーネントのsがある：PMAおよびイオノマイシンとPMAの81 nMの、イオノマイシンの1.33μMおよびブレフェルジンA.治療を5μg/ mlのは、サイトカインを産生する細胞を活性化します。サイトカインは、検出される細胞内で捕捉されなければならない分泌タンパク質です。ブレフェルジンAは、小胞体とゴルジ装置で正常に分泌タンパク質の蓄積を引き起こします。したがって、ここで説明する技術は、フローサイトメトリーによるサイトカイン産生リンパ球の検出能を向上させます。 </li><li> 12ウェル2万個の細胞（大動脈または腎臓）または24ウェル（リンパ節）、低付着プレートにプレート1。 3時間、37℃の加湿CO 2インキュベーターでプレートを置きます。 注：播種した細胞の数は、対照マウスからのリンパ節に低くてもよいです。また、刺激の時間は、実験的に研究された各細胞集団とサイトカインのために決定されなければなりません。大動脈、腎臓またはリンパ節から単離されたT細胞のケースでは、3〜4時間の刺激をお勧めします。長く刺激ワット病気のサイトカイン分泌を増大させ、CD3、CD4およびCD8のようないくつかのT細胞表面マーカーのさらなるダウンレギュレーションを誘導するわけではありません。 （でも、3-4時間の刺激はこれらのマーカーのいくつかのダウンレギュレーションを誘導することに注意してください。） </li></ol> 4.表面染色<ol><li>ポリスチレンFACSチューブ遠心（300×gで、8分、4℃）に細胞を移します。 （FACS緩衝液で2回（ の Ca 2+およびMg +フリーPBS 4％FBS及び2mMのEDTAを含む）に細胞を洗浄し、所望の抗体パネルの数と必要な制御管の数に基づいて、異なるFACSチューブに均等に細胞懸濁液を分割下記参照）。 </li><li>各パネルの補償を行うために、各組織型および抗体パネルのために染色していない対照チューブと、単一の染色されたチューブを準備します。また、全てが、抗体の一つを添加することにより、各抗体パネルの蛍光マイナス1（FMO）対照チューブを準備します。 </li><li> FACSで2ミリリットルに各チューブの音量を調整しますバッファ。遠心分離機は、細胞懸濁液（300×gで、8分、4℃）、氷上で10分間万個の細胞あたりの抗CD16 / CD32抗体0.5μgので細胞をインキュベートすることにより上清とブロックのFc受容体を除去します。 注：CD16は、低親和性のIgG Fc受容体III（FcRでIII）であり、CD32は、FcRでIIです。 CD16 / CD32は、顆粒球、マスト細胞、単球/マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、B細胞、樹状細胞およびいくつかの活性化された成熟したT細胞上で発現されます。 </li><li>生存性染色を実行します。1×PBS 1,000μlの1×PBS、遠心分離（300×gで、8分、4℃）し、再懸濁して細胞を洗浄。細胞非透過性アミン反応性色素（生存能力染色）の1μLを加えます。光から保護して4℃で15分間インキュベートします。 </li><li>インキュベーションの間、FACS緩衝液の適切な量で（表面染色のための）抗体のカクテルを用意。 FACS緩衝液1-2 mlの細胞を2回洗浄し、遠心分離（300×gで、8分、4℃）し、100μlの各ペレットを再懸濁抗体混合物。光から保護して4℃で30分間インキュベートします。 注：抗体サイトメトリー各フローのために、用量滴定曲線を実行することによって、必要とされる抗体の最適量を決定するために有用です。 </li><li>細胞（300×gで、8分、4℃）をFACS緩衝液2mlで細胞を2回洗浄し、ペレット。 </li></ol> 5.固定、透過処理および細胞内染色<ol><li>製造元の指示に従うことによって、適切な緩衝液を含む固定および透過処理キットで細胞内染色を実行します。適切なバッファに再懸濁することにより細胞を固定し、透過処理。光から保護して4℃で40分間サンプルをインキュベートします。 </li><li> 1倍の透過性の1ミリリットルを追加し、固定し、透過性細胞に直接洗浄緩衝液。遠心分離（500×gで、8分、4℃）、上清を除去します。 1×洗浄緩衝液2mlでペレットを再懸濁します。 </li><li> antibの混合物を準備します1×洗浄バッファー（チューブあたり通常100μl）を、適切な体積でodies（細胞内染色の場合のみ）。 注：上記のように、最適な抗体濃度は、パネル中の各抗体について決定する必要があります。例えば、IL-17AまたはIL-17Fに対する抗体について、私たちは、1：30の希釈率を使用しますが、IFNγとのT-betに対する抗体について、我々は1の希釈係数を使用します。100。 </li><li>細胞を遠心（500×gで、8分、4℃）および抗体混合物100μlの各ペレットを再懸濁。光から保護して4℃で40分間インキュベートします。 </li><li>細胞（500×gで、8分、4℃）を1×洗浄緩衝液2mlで細胞を2回洗浄し、ペレット。 1×300μlの洗浄緩衝液でペレットを再懸濁し、適切なフィルタを用いて、フローサイトメーターで分析します。 </li><li>組織サンプルあたりの細胞の総数の定量化のために、計数ビーズを使用します。買収に先立ち、各チューブに計数ビーズの推奨量/数を追加します。 </li></ol> 6.報酬、ゲーティング、正規化、およびヒント<ol><li> 補償とゲーティング <ol><li>スペクトルの重なりを調整するための補償のために染色されていないと、単一の染色された対照試験管を実行します。 注：補償ビーズではなく、セルベースの報酬コントロールの使用は、試料中の対象または細胞集団の抗原が補償用いて、細胞は困難であろうこのような低レベルで存在する場合に必要です。タンデム染料を使用した場合、タンデム色素がロットロットにし、毎日で変わるので、またノートの、各実験のための補償を準備することをお勧めします。 </li><li>新しい多色実験を開始するときに、蛍光マイナスパネル内のすべてのフルオロフォアのための1つのコントロール（のFMO）を実行します。 注：FMOのコントロールは、1以外のパネルですべての抗体を含むサンプルです。これらのコントロールは正しくadjusに省略抗体のための負のシグナル対正の正確な識別を可能にしますゲートをtは。これらのコントロールは、発現レベルは、標的集団の分離が悪い場合、または（例えば、標的は、サイトカインまたは転写因子である）、低い場合に特に重要です。必ずしも必要ではないが、いくつかの場合において、アイソタイプ対照は、FMOの代わりに好まれ得るそれらは抗原の特異性なし抗体アイソタイプとフルオロフォアコンジュゲートのための適切な補償を提供するように制御します。 </li><li>第一のゲートを設定します。白血球集団を検出するために、前方散乱面積（FSC-A）および側方散乱エリア（SSC-A）の電圧を調整します。 </li><li>死細胞を除外します。 注：生存率汚れが表面と細胞の内部の両方に存在する遊離のアミンと反応します。細胞を生きるとは対照的に、（損なわれた膜を有する）死んだ細胞は、タンパク質標識の量を増加させる、色素が細胞質に入ることを可能にします。このように、死んだ細胞が容易に識別を可能にする生きた細胞よりも明るくなります。ライブ上のゲート細胞。 注：大動脈および腎臓からの細胞懸濁液の生存率は、追加の消化工程にリンパ節からの細胞懸濁液の生存率よりも低くてもよいです。 </li><li>プロット前方散乱面積（FSC-A）[Y軸]と前方散乱高さ（FSC-H）[x軸]。シングレットは、このドットプロット上の対角線として表示されます。ダブレットを除外するには、この対角線上のゲート。そして、SSC-【y軸]およびCD45 [x軸]をプロットします。 </li><li> CD45 +白血球集団を容易に識別することができます。この集団上のゲート。その後の集団は、この集団から識別することができます。 </li></ol></li><li> 細胞数の正常化 <ol><li>カウントビーズは、低FSCおよび高いSSCになる特性を有しています。 50,000ビーズを単一細胞懸濁液を300μlに添加する場合、例えば、以下のように、チューブあたり任意の所与の細胞型の絶対数を計算するための式です。 細胞数p計数した細胞の小胞体管=（フローサイトメーターによって計数ビーズの50,000 /数）x個。 この計算を使用して、チューブ当たり任意の細胞型の絶対数を決定することができます。各器官から生成されたどのように多くのチューブに基づいて、器官あたりの細胞数を算出することができます。 注：プロトコル中4℃で全ての細胞および試薬を保管してください。それは、細胞に損傷を与えることができるので、激しくボルテックスを避けてください。細胞をペレットに最小限の力を使用してください。それは、細胞死を沈殿させることができるため、FACSチューブに気泡を避けます。ペレットは、いつでも乾くせてはいけません。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+adaptor+protein+LNK+deficiency+exacerbates+hypertension+and+end-organ+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).</li>
<li>Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+17+promotes+angiotensin+II-induced+hypertension+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction.</a> Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).</li>
<li>Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+Cells+Promote+the+Transition+From+Hypertrophy+to+Heart+Failure+During+Chronic+Pressure+Overload%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload.</a> Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).</li>
<li>Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+T+cell+in+the+genesis+of+angiotensin+II+induced+hypertension+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction.</a> J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).</li>
<li>Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+Response+of+T+and+B+Cells+in+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis.</a> Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).</li>
<li>McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation%2C+Immunity%2C+and+Hypertensive+End-Organ+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage.</a> Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).</li>
<li>Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+Cells%3A+Differentiation+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+T Cells: Differentiation and Functions.</a> Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).</li>
<li>Mittrücker, H. -W., Visekruna, A., Huber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+differentiation+and+function+of+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Immunol+Ther+Exp+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).</li>
<li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Microbiol+Immunol+%28Bp%29%22%5BJournal%5D)">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).</li>
<li>Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+Flow+Cytometry+Immunophenotyping+Analysis+from+the+Human+ImmunoPhenotyping+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium.</a> Sci Rep. 6, 20686(2016).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+future+of+the+fluorescence+activated+cell+sorter+and+flow+cytometry%3A+a+view+from+Stanford%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford.</a> Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).</li>
<li>Hrvatin, S., Deng, F., O'Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARIS%3A+method+for+analyzing+RNA+following+intracellular+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting.</a> PLoS One. 9 (3), 89459(2014).</li>
<li>Kalisky, T., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell genomics.</a> Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).</li>
<li>Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry%3A+Today%27s+technology+and+tomorrow%27s+horizons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cytometry: Today's technology and tomorrow's horizons.</a> Methods. 57 (3), 251-258 (2012).</li>
<li>Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+progression+of+cell+death+and+the+disassembly+of+dying+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry.</a> Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).</li>
<li>Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dectin-1+activation+unlocks+IL12A+expression+and+reveals+the+TH1+potency+of+neonatal+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).</li>
<li>Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Genomics+Unveils+Critical+Regulators+of+Th17+Cell+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity.</a> Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).</li>
</ol>

MSMは、ギリアド心臓血管科学からの助成金によってサポートされています。

本明細書に記載されているプロトコルは、マウスの腎臓、大動脈およびリンパ節内に存在するT細胞サブセットを適切に同定するように最適化されている。このプロトコルは、Bリンパ球や自然免疫細胞などの他の免疫細胞サブセットを調べるために容易に適応することができ、他の組織型を含めるように変更することができます。消化ステップは重要であり、組織ごとに変更および最適化する必要があります9。消化ステップの延長や不適切な酵素の使用は、抗原発現の安定性に影響を与える可能性があります。同様に、消化が不完全なと結果に影響を及ぼし、陽性細胞の数が減少する可能性があります。さらに、細胞毒性を最小限に抑えて最適な刺激を可能にするために、細胞型/サイトカインごとに ex vivo 刺激の時間を慎重に調整する必要があります。 
フローサイトメトリー分析と組み合わせた細胞内染色は、血液や組織の細胞レベルで免疫プロセスを分析するための最も強力な方法の 1 つですが、この技術には限界があります。これらの制限には、心血管および腎臓組織における免疫細胞の数が比較的少ないことが含まれます。した...

最近の証拠は、適応免疫系、特にTリンパ球は、いくつかの心血管疾患1,2,3,4,5の発症に重要な役割を果たしていることを示しています。例えば、アンギオテンシンII誘発性高血圧モデルでは、マウスの血管および腎臓におけるT細胞の蓄積を6に記載されています。血管の蓄積は、外膜と血管周囲脂肪に主にあります。腎臓では、T細胞は、髄質及び腎皮質の両方に蓄積します。関与するサブセットに応じて、これらのT細胞は、血管および腎臓の機能に影響を及ぼし、病理の発達をもたらすことができる別のサイトカインを生じる（マクマスターら 6で概説）。 その機能と署名インサイトに基づいてTヘルパー1（Th1）、Th2を、TH9、Th17細胞、TH22、T調節（Treg細胞）細胞、およびT濾胞ヘルパー（TFH）細胞：CD4 + Tヘルパーリンパ球は、複数のサブセットに分割することができますkines 7。同様に、CD8 +細胞傷害性T細胞はTc1は、Tc2を、TC17またはTC9 8のように分類することができます。ダブルネガティブT細胞（CD4またはCD8 T細胞マーカーを発現しない、すなわち細胞）もあります。これらの細胞のサブセットは、代替ガンマデルタT細胞受容体（の代わりに古典的なαおよびβ受容体）を有し、したがって、ガンマデルタT細胞と呼ばれます。表面マーカー、サイトカインおよび転写因子のフローサイトメトリーによるマルチパラメータ分析は、これらの細胞を同定するための最適なアプローチを構成しています。この方法は、広く免疫学の分野で使用されるが、それはあまり固形臓器および心血管疾患の設定に記載されています。 歴史的には、組織中のリンパ球の同定は、免疫組織化学またはRT-PCRの手法に限定されていました。免疫組織化学および免疫蛍光は、int型の抗原の組織分布を決定するための強力な方法であるが、erest、彼らは表現型関連するサブセットを特定するには不十分です。 RT-PCR分析は、抗原、サイトカインまたは転写因子のmRNA発現を検出するのに有用であるがまた、それは、個々の細胞のレベルで、同時に複数のタンパク質の検出を可能にしません。 サイトカインおよび転写因子を検出するために、細胞内染色と組み合わせて、特にフローサイトメトリーの出現は、固形臓器における免疫細胞サブセットの単一細胞レベルでの同定および定量を可能にする強力な技術を持つ研究者を提供します。私たちは、アンジオテンシンII高血圧のモデルにおけるマウスの腎臓、大動脈および大動脈流入領域リンパ節内に存在する主要なT細胞サブセットをフローサイトメトリーによって識別するための細胞内染色アッセイを最適化しました。各ステップの最適化：組織消化、ex vivoでの活性化、透過処理、および表面および細胞内染色結果、高度で再他の心血管および腎疾患モデルに適用することができる製造可能検定。

<table><tbody><tr><td>コラゲナーゼ D</td><td>ROCHE</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ A</td><td>ロシュ</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ B</td><td>ロシュ</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>ロシュ</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>1x 赤血球溶解バッファー</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1614 1x</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>カルシウムとマグネシウムを含まないDPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5445-02</td><td>密度勾配遠心分離用</td></tr><tr><td>GentleMACS&trade;Cチューブ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS 解離装置</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>プログラムを使用</td></tr><tr><td>SPLEEN_04 細胞活性化カクテル (ブレフェルジンA付き)</td> <td>Biolegend</td><td>423303</td><td></td></tr><tr><td>抗CD16/32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td>希釈 1:100</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit</td><td>Life Technologies</td><td>L34955</td><td></td></tr><tr><td>転写因子バッファーセット</td><td>BD Pharmingen</td><td>562725</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>123 count eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45 AmCyan (クローン 30-F11)</td><td>BioLegend</td><td>103138</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5 (クローン 17A2)BioLegend</td><td></td> <td>100218</td><td></td></tr><tr><td>IL-17A FITC (クローン TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506910</td><td></td></tr><tr><td>IL-17F APC (クローン 9D3.1C8)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>517004</tr><tr><td>CD4 APC-Cy7 (クローンGK1.5)</td><td>BD Biosciences</td><td>560181</td><td></td></tr><tr><td>CD8 APC (クローン 53-67)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>T-bet PE-Cy7 (クローン 4B10)</td><td>BioLegend</td><td>644823</td><td></td></tr><tr><td>IFN&gamma;FITC(クローンXMG1.2)</td><td>BDバイオサイエンス557724</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

細胞内染色およびフローサイトメトリーは、高血圧のモデルにおけるマウス大動脈、腎臓及びリンパ節内のリンパ球サブセットを識別するために、

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Tリンパ球がいくつかの心血管疾患の発症に重要な役割を果たすことは、現在よく知られています1,2,3,4,5。例えば、私たちのグループの研究では、高血圧は実験的高血圧症の発症中に血管や腎臓にT細胞が過剰に蓄積することと関連していることが示されています6。これらの組織に入ると、T細胞は血管機能と腎機能の両方に影響を与えるいくつかのサイトカインを産生し、血管収縮とナトリウムと水分の貯留を引き起こします1,2。T細胞が心血管疾患や腎疾患を引き起こす仕組みを完全に理解するためには、これらの組織に存在する特定のT細胞サブセットを同定し、定量化できることが重要です。T細胞サブセットは、表面マーカー、それらが分泌するサイトカイン、およびそれらが発現する転写因子の組み合わせによって定義されます。T細胞集団は複雑であるため、フローサイトメトリーと細胞内染色は、組織に存在するリンパ球の表現型を解剖するための非常に貴重な技術となっています。ここでは、アンジオテンシンII誘発性高血圧のモデルでマウスの腎臓、大動脈および大動脈ドレナージリンパ節から単離されたT細胞の表面および細胞内マーカー(サイトカインおよび転写因子)を同定するための詳細なプロトコルを提供します。以下のステップが詳細に説明されています:組織の単離、単一細胞懸濁液の生成、ex vivo刺激、固定、透過化および染色。さらに、適切なコントロールや適切なゲーティング戦略の選択など、フローサイトメトリー解析のいくつかの基本原則についても説明します。

プロトコルは、許可をアンジオテンシンII誘発性高血圧モデルにおいて、マウス腎臓、大動脈および大動脈流入領域リンパ節から単離したT細胞における表面および細胞内マーカーの同定を記載しました。代表的な結果を以下に示します。 図1は、高血圧を誘導するために、アンジオテンシンIIを注入したWTマウスの大動脈から調製した単一細胞懸濁液中のT細胞集団を同定するために使用されるゲーティング戦略を示しています。同様の戦略は、腎臓およびリンパ節で使用されています。前方散乱面積（FSC-A）および側方散乱領域（SSC-A）の電圧は、白血球集団（G1）を検出し、破片を除外するように調整しました。生細胞（G2）は、太平洋青と結合した生存能力のマーカーについて陰性です。生細胞は、その後のみにゲートに前方散乱高さ（FSC-H）と前方散乱面積（FSC-A）でゲートしました一集団（G3）。白血球は、その後SSC-AおよびCD45（G4）にゲーティング...

この記事では、識別し、細胞内染色によって、マウス腎臓、大動脈およびリンパ節内に存在する機能性Tリンパ球サブセットを定量化し、フローサイトメトリーするための詳細な方法論を提供します。アンジオテンシンII高血圧のモデルは、説明ステップバイステップ、手順、およびフローサイトメトリーの基本的原則及び細胞内染色に選ばれました。

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

本プロトコルの総合的な目的は、アンジオテンシンII誘発性高血圧モデルにおいて、マウスの大動脈、腎臓、およびリンパ節から単一細胞懸濁液を調製し、免疫細胞を定量および特性解析することです。この手法は、どの2つのリンパ球サブセットが高血圧の発症を促進するかなど、心血管疾患分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。本手法の主な利点は、固形臓器内の免疫細胞サブセットを単一細胞レベルで同定および定量できることです。手順を開始する前に、マウスの胸部を70%エタノールで消毒します。次に、はさみを使用して皮膚と胸壁を慎重に開き、心臓を露出させます。血管を灌流させるため、右心房に小さな切開を加え、冷PBSを少なくとも10 milliliters、毎秒約1 milliliterの速度で左心室の心尖部に定常的に注入します。すべての臓器が白濁したら、微細解剖用ピンセットを使用して、被膜を破らないように注意しながら腹部大動脈ドレナージリンパ節を取り除きます。解剖顕微鏡下で、微細剪刀を用いて両方の腎臓を除去します。次に、微細曲剪刀を用いて、心臓から腸骨分岐点まで、周囲の血管周囲脂肪が大動脈に付着したままになるように注意しながら、胸部および腹部大動脈全体を切り出します。次に、腎臓を10 millilitersの腎臓消化液が入った解離チューブに移し、半自動解離装置を用いて、製造元の指示に従い腎組織を機械的に分散させます。解離後、サンプルを37 degrees Celsiusで連続回転させながらインキュベートします。20分後、5% FBSを添加した冷RPMI 1640培地を用いて酵素消化を直ちに停止させ、得られた組織スラリーを40-micronストレーナーでろ過し、50-milliliterコニカルチューブに回収します。1 mLシリンジのプランジャーを使用して、残った組織をほぐします。次に、遠心分離によって細胞をペレット化します。ペレットを 3 mL の 36%密度勾配培地で再懸濁し、細胞を 15 mL コニカルチューブに移します。72%密度勾配培地3 mLを、層を乱さないように注意しながら細胞の下に静かに重ね、遠心分離によって細胞を分離させます。免疫細胞は界面に位置します。細胞 debris を含む最上層の黄色い層を取り除き、その後、冷PBSを用いて液量を15 mLまで合わせます。よく振盪してグラジエントを解消した後、遠心分離により細胞を洗浄します。大動脈免疫細胞を単離するために、氷上で調製したばかりの大動脈消化液1 mLを含む2 mLチューブに大動脈を移し、細い鋏を用いて大動脈全体を細かく刻みます。その後、破片を37 °Cで30分間、連続回転させながらインキュベートします。消化終了後、消化液の5倍量の5% FBS添加冷RPMIを加え、得られた組織スラリーを40µmストレーナーでろ過する。その後、遠心分離によって単一細胞懸濁液を回収し、FBS含有の新鮮なRPMIでペレットを再懸濁させる。大動脈ドレナージリンパ節から単一細胞懸濁液を作製する場合は、リンパ節を60×15mm組織培養ディッシュ上の40µmストレーナーに移し、1mLシリンジのプランジャーを用いて組織を分散させる。次に、RPMIおよびFBSを用いてストレーナーを2 mLで洗浄し、回収した細胞を15 mLコニカルチューブに移します。細胞を刺激するために、まず各細胞懸濁液を細胞培養培地で1×10⁶ cells/mLの濃度に調整します。その後、培地1 mLあたり2 µLの細胞活性化カクテルを各細胞群に添加します。次に、1ウェルあたり1〜2×10⁶個の大動脈または腎臓細胞を12ウェルプレートに、1ウェルあたり1〜2×10⁶個のリンパ節細胞を24ウェルプレートに移します。プレートを37 °Cの加湿二酸化炭素インキュベーターに3時間置きます。その後、細胞を適切なポリスチレン製FACSチューブに移し、遠心分離によって細胞をペレット化します。同一の遠心分離条件で新鮮なFACSバッファーを用いて細胞を2回洗浄した後、FCブロックを用いて非特異的な表面結合をブロックし、PBSで細胞を洗浄します。ペレットを1 mLの新鮮なPBSに再懸濁し、細胞透過性のないアミン反応性生存率染色試薬1 µLを用いて、4 °Cで遮光下、15分間細胞を染色します。インキュベーション終了後、1～2 mLのFACSバッファーで細胞をさらに2回洗浄し、ペレットを100 µLの適切な細胞表面染色抗体カクテルに再懸濁します。4°Cで遮光した状態で30分間静置した後、新鮮なFACSバッファー 2 mLで細胞をさらに2回洗浄し、固定・透過化キットを用いてメーカーの指示に従い細胞を固定および透過化させます。次に、目的の細胞内抗体カクテルで細胞を標識し、再度FACSバッファーで細胞を洗浄します。刺激後の細胞内サイトカイン産生のフローサイトメトリー分析では、まず、スペクトルの重なりを補正するために未染色および単染色コントロールチューブを測定し、続いてパネル内の各蛍光色素についてFMO（fluorescence-minus-one）コントロールを測定します。基本的な蛍光解析パラメータを設定した後、前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）のエリアプロットを用いて、白血球集団検出のためのプライマリゲートを設定し、続いて生存率染色で陰性を示す死細胞を除外するためのゲーティングを行います。前方散乱光エリアを前方散乱光高さに対してプロットし、ダブレットを除外するようにゲートを設定します。その後、CD45の発現によって白血球を同定できます。マウスの腎臓または大動脈におけるIL-17AまたはIL-17F産生T細胞の存在を判定するために、各サイトカインのFMO（fluorescence-minus-one）コントロール解析で示した通りに単細胞懸濁液を調製できます。予想通り、FMOコントロールではIL-17AまたはIL-17F陽性細胞が極めて少なく、陽性信号と陰性信号を正確に識別できるため、実験サンプル中のIL-17AまたはIL-17F陽性細胞を同定するためのゲートを適切に調整することが可能です。溶媒またはアンジオテンシンIIを投与した野生型マウスの腎臓および大動脈から単離したT細胞の代表的な細胞内染色の結果、両組織においてIL-17AまたはIL-17Fを発現するT細胞のサブセットが存在することが明らかになりました。さらに、大動脈ドレナージリンパ節由来のT細胞の細胞内染色により、アンジオテンシンII刺激後にCD8陽性T細胞がインターフェロンγおよびT-betを発現することが示されています。この手法を習得すれば、処理する組織の数に応じて6〜9時間で完了させることができます。本手順を実施する際は、細胞死を最小限に抑えるため、迅速かつ効率的に作業することが重要です。このビデオを視聴することで、マウスの腎臓、大動脈、およびリンパ節から単細胞懸濁液を調製し、これらの臓器から免疫細胞サブセットを特性評価および定量化する方法について十分に理解することができます。この手法を用いることで、心血管系および腎臓の生理学の研究者は、高血圧やその他の炎症性疾患に関与する可能性のある免疫細胞集団の変化を探索することが可能になります。

intracellular-staining-flow-cytometry-to-identify-lymphocyte-subsets

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

本論文では、大動脈の免疫成分を調査するために、フローサイトメトリーベースの方法を提示。本稿では、また別々に周囲の外膜と血管壁を調べることができる追加のテクニックを示しています。このメソッドは、大動脈白血球の表現型解析を実行し、アテローム性動脈硬化症の研究のためにいくつかの免疫学的アッセイを適用する可能性を開きます。...

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

大動脈洞と上行大動脈の精密切片化と組織化学的および免疫組織化学的分析を組み合わせて、マウスモデルのアテローム性動脈硬化病変を定量化し、特徴付ける手順について説明します。...

マウス大動脈洞におけるアテローム性動脈硬化症の病変の定量分析とキャラクタリゼーション

血管細胞機能は、細胞内メッセンジャーの活性に依存します。 ここで説明するのは、単離された大動脈の個々の内皮細胞および平滑筋細胞における生理学的および薬理学的刺激に応答した細胞内カルシウムおよび一酸化窒素レベルの測定を可能にするex vivo...

細胞内カルシウムの二光子イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;取扱い及び内皮における一酸化窒素産生および単離されたラット大動脈の平滑筋細胞

単球は、末梢動脈疾患のコンテキストでの arteriogenesis...

単球のホーミングと末梢動脈疾患のマウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡

この原稿は、トランスジェニック レポーター マウスの使用は、アンジオテンシン II...

白血球ローリングとアンジオテンシン II に注入されたマウスにおける付着の可視化: 技術と落とし穴

このプロトコルの目的は、説明されているマーカーを用いた肝臓内リンパ管の内皮細胞集団を識別するためにです。コラゲナーゼ IV と DNase...

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

動物解剖、組織を埋め込む、断面、染色、腕頭動脈の分析の体系的な方法を含む後期マウスの動脈硬化病変の細胞構成を特徴づけるための標準化されたプロトコルを提案します。atheroprone 平滑筋細胞系譜トレース...

平滑筋細胞系譜トレース マウスの高度な動脈硬化病変における細胞構成の定量的解析

ここでは、マウス変形性関節症の確立された外科モデルを利用して、マウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織内の細胞外染色アッセイと細胞内染色アッセイの両方を使用して、単球/マクロファージおよびT細胞サブセットを同定するための詳細で再現可能なフローサイトメトリープロトコルについて述べた。...

変形性関節症モデルにおけるマウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織における免疫細胞サブセットのフローサイトメトリー解析

ウイルス感染後、腎臓は比較的多数のCD8+T 細胞を収容し、非粘膜TRM...

フローサイトメトリー解析のためのマウス腎臓レジデントCD8+T 細胞の分離

白血球および血小板の動員は、動脈形成中の側副動脈の効果的な成長に必要な必須成分を構成する。多光子顕微鏡は、動脈形成中の白血球の動員と血管外漏出を研究するために、 in vivoで...

マウス後肢モデルにおける動脈形成中の白血球動員モニタリングのための多光子生体内イメージング

ここでは、マウス大動脈を3次元(3D)で画像化するために最適化された組織透明化プロトコルを紹介します。私たちは、アテローム性動脈硬化症プラークを持つ末梢神経系の解剖学的近接性とアテローム性動脈硬化症の到来を定義することを目的として、免疫染色、光学クリアリング、およびイメージングのための最先端の手順を描写します。...

アテローム性動脈硬化症における大動脈組織の三次元イメージング

学ぶ細胞内染色とフローサイトメトリーを用いて、高血圧モデルマウスの大動脈、腎臓、リンパ節から単一細胞懸濁液を調製し、リンパ球サブセットを同定・定量化する方法。この技術は心血管疾患における免疫応答の研究に有用である。

細胞内染色およびフローサイトメトリーは、高血圧のモデルにおけるマウス大動脈、腎臓及びリンパ節内のリンパ球サブセットを識別するために、

さらに動画を探す