細胞内染色およびフローサイトメトリーは、高血圧のモデルにおけるマウス大動脈、腎臓及びリンパ節内のリンパ球サブセットを識別するために、

このプロトコルの全体的な目標は、マウスの大動脈、腎臓、およびリンパ節から単一細胞懸濁液を取得して、アンジオテンシンII誘発性高血圧のモデルにおける免疫細胞を定量化し、特徴づけることです。この方法は、どの2つのリンパ球サブセットが高血圧の発症を促進するかなど、心血管疾患の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、固形臓器の免疫細胞サブセットを単一細胞レベルで同定および定量化できることです。

手順を開始する前に、マウスの胸部を70%エタノールで消毒してください。次に、ハサミを使って皮膚と胸壁を慎重に開き、心臓を露出させます。血管系を灌流するには、右心房に小さな切開を行い、少なくとも10ミリリットルの冷たいPBSを毎秒約1ミリリットルの速度で左心室の頂点に着実に注入します。

すべての臓器が白くなったら、微細解剖鉗子を使用して、カプセルが破裂しないように注意しながら、腹部大動脈排液リンパ節を切除します。解剖顕微鏡で、細いハサミで2つの腎臓を切除します。次に、細かい湾曲したハサミを使用して、心臓から腸骨分岐部まで胸部と腹部の大動脈全体を解剖し、周囲の血管周囲脂肪が大動脈に付着しないように注意します。

次に、腎臓を10ミリリットルの腎臓消化液が入った解離チューブに移し、半自動解離器を使用して、製造元の指示に従って腎臓組織を機械的に分解します。解離の終わりに、連続回転下でサンプルを摂氏37度でインキュベートします。20分後、5%FBSを添加した冷冷RPMI 1640培地による酵素消化を直ちに停止し、得られた組織スラリーを40ミクロンのストレーナーで50ミリリットルの円錐管にろ過します。

1ミリリットルの注射器のプランジャーを使用して、残りの組織をからかいます。次に、遠心分離により細胞をペレット化します。ペレットを3ミリリットルの36%密度勾配培地に再懸濁し、細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。

密度72%のグラジエント培地3ミリリットルを細胞の下に穏やかに層状にし、層を乱さないように注意し、遠心分離により細胞を分離します。免疫細胞は界面に位置します。細胞の破片を含む一番上の黄色がかった層を取り除き、次に冷たいPBSを使用して容量を最大15ミリリットルにします。

よく振って勾配を分解し、遠心分離で細胞を洗浄します。大動脈免疫細胞を単離するには、氷の上に新たに調製した大動脈消化液1ミリリットルが入った2ミリリットルのチューブに大動脈を移し、細いハサミを使って大動脈全体を細かく刻みます。次に、フラグメントを摂氏37度で30分間連続回転させます。

消化の最後に、消化溶液の5倍の容量で5%FBSを添加した冷たいRPMIを加え、得られた組織スラリーを40ミクロンのストレーナーでろ過します。次に、遠心分離によってシングルセル懸濁液を回収し、FBSを使用して新鮮なRPMIにペレットを再懸濁します。大動脈排液リンパ節から単一細胞懸濁液を生成するには、リンパ節を60 x 15 mmの組織培養皿の40ミクロンストレーナーに移し、1ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して組織を分解します。

次に、2ミリリットルのRPMIとFBSでストレーナを洗い流し、遊離した細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。細胞を刺激するためには、まず、各細胞懸濁液を細胞培養培地中の1ミリリットルあたり10〜6細胞の濃度の1倍に調整します。次に、培地1ミリリットルごとに、細胞の各グループに2マイクロリットルの細胞活性化カクテルを追加します。

次に、ウェルあたり10倍から第6大動脈または腎臓細胞に1〜2倍を12ウェルプレートに移し、ウェルあたり10倍から6番目のリンパ節細胞に1〜2倍を24ウェルプレートに移します。プレートを摂氏37度の加湿二酸化炭素インキュベーターに3時間置きます。次に、細胞を適切な対応するポリスチレンFACSチューブに移し、遠心分離により細胞をペレット

同じ遠心分離条件下で新鮮なFACSバッファーで細胞を2回洗浄した後、FCとの結合をブロックし、非特異的表面をブロックしてPBSで細胞を洗浄します。ペレットを1ミリリットルの新鮮なPBSに再懸濁し、1マイクロリットルの細胞不透過性アミン反応性生存率染色剤で細胞を4°Cで15分間染色し、光から保護します。インキュベーションの終了時に、1〜2ミリリットルのFACS緩衝液で細胞をさらに2回洗浄し、ペレットを100マイクロリットルの適切な細胞表面染色抗体カクテルに再懸濁します。

摂氏4度で30分間静光保護した後、細胞を2ミリリットルの新鮮なFACS緩衝液でさらに2回洗浄し、製造元の指示に従って固定および透過化キットで細胞を固定および透過化します。次に、目的の細胞内抗体カクテルで細胞を標識し、FACSバッファーで細胞を再度洗浄します。刺激された細胞内サイトカイン産生のフローサイトメトリー解析では、まず未染色および単一染色のコントロールチューブを実行してスペクトルのオーバーラップを調整し、次にパネル内の各蛍光色素の蛍光マイナス1コントロールを実行します。

基本的な蛍光分析パラメータを設定したら、前方散布界プロットを使用して白血球集団検出のプライマリゲートを設定し、続いてゲーティングを使用して、生存率染色発現の欠如に応じて死細胞を除外します。前方散布図の高さとゲートに対して前方散布図面積をプロットして、ダブレットを除外します。その後、白血球はCD45の発現によって同定できます。

マウスの腎臓または大動脈でIL-17AまたはIL-17Fを産生するT細胞の存在を決定するために、各サイトカインの蛍光マイナス1コントロール分析で実証したように、単一細胞懸濁液を調製できます。予想通り、蛍光マイナス1コントロールではIL-17AまたはIL-17F陽性の細胞はほとんどなく、陽性シグナルと負シグナルを正確に識別することで、実験サンプル中のIL-17AまたはIL-17F陽性細胞を同定するためのゲートを適切に調整することができます。ビヒクルまたはアンジオテンシンIIを注入した野生型マウスの腎臓および大動脈から単離されたT細胞の代表的な細胞内染色により、両方の組織内にIL-17AまたはIL-17Fを発現するT細胞のサブセットが存在することが明らかになりました。

さらに、大動脈ドレーンリンパ節からのT細胞の細胞内染色は、CD8陽性T細胞がアンジオテンシンII刺激後にインターフェロンγおよびT-betを発現することを示しています。この手法を習得すると、処理される組織の数にもよりますが、6時間から9時間で実行できます。この手順を実行する際には、細胞死を最小限に抑えるために迅速かつ効率的に作業することが重要です。

このビデオを見れば、マウスの腎臓、大動脈、リンパ節から単細胞懸濁液を生成する方法、およびこれらの臓器からの免疫細胞サブセットを特徴付けて定量化する方法について十分に理解できるはずです。この技術により、心血管および腎臓の生理学は、高血圧やその他の炎症誘発性疾患に寄与する可能性のある免疫細胞集団の変化を調査できます。