ヒト多能性幹細胞のin vitro分化における絨毛細胞へ

このプロトコルの全体的な目標は、骨形態形成4および活性および節転移経路の阻害剤を使用して、ヒト多能性幹細胞をヒト絨毛細胞に分化させ、ヒト胎盤の形成および機能の初期イベントを研究することです。この方法は、絨毛細胞の機能とこれらの細胞がどのように形成されるかの研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝学を含むさまざまなアプリケーション向けに豊富な絨毛細胞を作製し、細胞機能アッセイを可能にすることです。

実験を開始するには、細胞外マトリックスのアリコートを氷上で3〜4時間解凍します。氷冷チップを使用して、1本の冷たい50ミリリットルの円錐管とダルベッコの変性等媒質(DMEM F12培地)を使用して、2ミリグラムの細胞外マトリックスを24ミリリットルの氷冷DMEMF12に移します。すぐに50ミリリットルの円錐形チューブを氷に移し、摂氏4度で保管します。

組織培養プレートをコーティングするには、6ウェルプレートのウェルあたり1ミリリットルの希釈した細胞外マトリックスを添加します。プレートを渦巻かせてウェルをコーティングし、プレートを室温で少なくとも1時間インキュベートします。新しいプレートから細胞外マトリックスを吸引し、bFGFを含むマウス胚性線維芽細胞馴染培地またはMEFCMを添加します。

ピペットを使用して、削り取ったセルラークランプをMEFプレートから移し、細胞外マトリックスコーティングプレートに分注します。次に、プレートをインキュベートします。パスツールピペットで分化した細胞をこすり落とした後、1ウェルに2ミリリットルの培地を使用して、毎日MEFCMをbFGF培地に交換します。

顕微鏡でコロニーが大きく明るく見える場合、6〜7日ごとにhESCを通過します。フィーダーフリー細胞を継代する準備ができたら、培地を取り出し、ピペットを使用して1ミリリットルのPBSを追加して細胞を洗浄します。PBSを吸引し、ピペットで事前に温めたディスパーゼのミリリットルあたり0.5ミリグラムと交換します。

細胞を摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、ウェルあたり2ミリリットルのPBSを加えてPBSで細胞を洗浄し、PBSを吸引します。ウェルごとに1ミリリットルのCMを追加し、5ミリリットルのピペットの先端を使用して細胞を小さな塊に手動で掻き取ります。

次に、懸濁した細胞凝集体を新しい細胞外マトリックスコーティングプレートにプレートします。微分培地を準備します。bFGFを含まないCMを使用し、使用前に新しい阻害剤を添加してください。

細胞外マトリックスコーティングプレート上で増殖するフィーダーフリーのhESCを、酸素5%に設定されたインキュベーター内で培養した1つの継代に使用します。細胞外マトリックスコーティングプレートに最初の継代を行った後、細胞を24時間接着させます。翌日、bFGFを含むCMを取り出し、6ウェルプレートのウェルあたり2ミリリットルのBMP4/A/Pを含むCMに置き換えることにより、鑑別を開始します。

4%酸素レベルを使用して細胞を培養し続けます。BMP4/A/Pを含むCMを2日ごとに交換し、古い培地を吸引し、BMP4/A/Pを含む新しい培地を追加します。

mESCをMEFからbFGFを含むhESC培地に移した後、細胞外マトリックス上で2つの継代でhESCを培養します。高い細胞密度が重要であるため、hESCを新しいプレートに1対1で分割し、翌日に少なくとも50%の密度を確保します。低酸素インキュベーターで細胞を一晩インキュベートします。

翌日、培地を分化培地のウェルあたり2ミリリットルと交換します。細胞を低酸素インキュベーターに一晩置きます。トランスフェクションの前に、ゼラチンを皿に0.1%ゼラチンを加えて皿をコーティングします。

皿を回してプレートをコーティングし、プレートを室温のままにします。20分後、ゼラチンを取り除きます。目的の時点までセルを微分します。

トランスフェクションの前日に、0.05%トリプシンを使用して細胞を5分間トリプシン化します。ゼラチンコーティングされたプレート上に細胞を目的のコンフルエントにプレートします。bFGFを欠くBMP4/A/Pを含むCMを添加し、培養物を一晩インキュベートします。

翌日、新鮮な分化培地を細胞に加えます。siRNAトランスフェクション試薬を使用してsiRNAをトランスフェクションします。血漿DNAには、適切なリポフェクタミン試薬を使用してください。

各トランスフェクション試薬について説明されている製品プロトコルに従ってください。siRNAリポフェクタミン複合体を各ウェルまたは細胞プレートに移し、穏やかに混合します。次に、低酸素インキュベーターで細胞を一晩培養します。

翌日、メディアを新しい分化メディアと交換します。所望の時点で細胞を採取し、定量的RT-PCRを用いて遺伝子破壊効率を確認します。最後に、細胞を回収するには、ウェルごとに0.05%トリプシンを1ミリリットル加え、細胞をインキュベートします。

トリプシンを中和するために、ウェルあたり5ミリリットルのMEF培地を追加します。細胞を200倍gで5分間スピンダウンし、細胞ペレットをRNA単離に使用します。この手法を用いると、形態変化がはっきりとわかります。

分化1日目の細胞は、0日目の細胞よりも大きくなります。分化が進むと、細胞は分裂してコロニーの中心から広がり、外側に成長します。個々のコロニーは、分化5日目までに融合し、細胞が互いに重なり合って成長します。

QRT-PCR解析の結果、多能性CマーカーNANOGの相対発現量は、分化後1日後にBMP4で培養すると75%減少し、BMP4/A/P存在下では90%減少することが明らかになりました。分化2日目までに、BMP4単独またはBMP4/A/Pで培養した細胞のNANOGのレベルは、β FGFを含むhESC CM培地の細胞と比較して非常に低くなっています。GFPプラスミドを使用して実施し、分化1日目と3日目にBMP4/A/P処理細胞に導入したトランスフェクションは、トランスフェクションの24時間後に30〜50%のトランスフェクション効率を得ました。

このビデオを見れば、in vitroでヒト多能性細胞を絨毛細胞に分化させる方法と、遺伝子発現を操作するためのDNAコンストラクトの導入方法について十分に理解できるはずです。