Name: マウスリンパ球標識による 64のCu-抗体の受容体インビボ PET / CTによる細胞輸送 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 学ぶマウスリンパ球の放射性抗体標識法。PET/CTを用いて炎症やがんモデルにおける細胞動態とホーミングパターンを48時間追跡し、細胞治療の作用機序解明に貢献する非侵襲的イメージング技術です。

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著者は、実験とデータ分析の際に支援するために博士はジュリア・マンハイム、ウォルター・エリッチマン、ラモナシュトゥンム、Fundaケイ、ダニエル・ブカラ、マレン・ハラントだけでなく、ナタリー・アルトメイヤー感謝します。この作品は、SFB685（プロジェクトB6）と富（2309-0-0）を通じてヴェルナーシーメンス財団、DFGによってサポートされていました。

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<li>Muranski, P., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+of+cancer+using+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells.</a> Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).</li>
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<li>Tavaré, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Effective+Immuno-PET+Imaging+Method+to+Monitor+CD8-Dependent+Responses+to+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy.</a> Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).</li>
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<li>Rini, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+with+FDG-labeled+Leukocytes+versus+Scintigraphy+with+111In-Oxine-labeled+Leukocytes+for+Detection+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection.</a> Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).</li>
<li>Ritchie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+macrophage+activated+killer+cells+to+sites+of+metastatic+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma.</a> Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).</li>
<li>Adonai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+cell+labeling+with+64Cu-pyruvaldehyde-bis%28N4-methylthiosemicarbazone%29+for+imaging+cell+trafficking+in+mice+with+positron-emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).</li>
<li>Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiolabeling+Rhesus+Monkey+CD34%2B+Hematopoietic+and+Mesenchymal+Stem+Cells+with+64Cu-Pyruvaldehyde-Bis%28N4-Methylthiosemicarbazone%29+for+MicroPET+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging.</a> Mol. Imaging. 7 (1), (2008).</li>
<li>Griessinger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Tracking+of+Th1+Cells+by+PET+Reveals+Quantitative+and+Temporal+Distribution+and+Specific+Homing+in+Lymphatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue.</a> J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).</li>
<li>Griessinger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((64Cu+antibody-targeting+of+the+T-cell+receptor+and+subsequent+internalization+enables+in+vivo+tracking+of+lymphocytes+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).</li>
<li>McCarthy, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+high+specific+activity+64Cu+using+a+biomedical+cyclotron%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron.</a> Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).</li>
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</ol>

著者は、開示することは何もありません。

このプロトコルは安定PETによるインビボ追跡のために、細胞を放射標識するための信頼性と簡単な方法を提示します。この方法を利用し、ドナーマウスから単離し、in vitroで増殖コバ-TH1細胞は、64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbで放射性標識することができ、それらのホーミングがでコバプレゼンテーションの部位として肺およびperithymic LNSに追跡しました。コヴァ誘発性急性気道DTHR。 キレート剤とのmAbの変更は、迅速かつ効率的な作業とアミン類の痕跡なしに超高純度のソリューションを使用する必要があります。溶液は、mAbの残基をアミンにDOTA-NHS活性エステルの適切な結合を確実にするために、キレートイオン交換樹脂で処理しました。細胞内の放射性標識のようなキレート剤 - 結合mAbは、非特異的な細胞標識剤の使用を超えるいくつかの利点を有します。まず、mAbが定義された細胞集団の標的にラベル付けを可能に優れた特異性を提供します。モノクローナル抗体それ自体は細胞毒性ではなく、細胞の生存率や機能に有害な影響を与えま...

非侵襲性細胞の追跡は、in vivoで細胞機能、遊走及びホーミングを監視するための多目的なツールです。最近の細胞追跡研究は再生医療、がん3、4に対する養子細胞療法における炎症またはTリンパ球における自己末梢白血球の文脈では、間葉系1、2または骨髄由来幹細胞3に焦点を当てています。作用部位および細胞ベースの治療の基本的な生物学的原則の解明は途方もない重要です。 CD8 +細胞傷害性Tリンパ球、遺伝子操作されたキメラ抗原受容体（CAR）T細胞または腫瘍浸潤リンパ球（TILを）が広くゴールドスタンダードと考えられました。しかしながら、腫瘍関連抗原特異的Th1細胞は、&lt;、有効な代替治療選択肢4であることが証明されています/ SUP&gt; 5、6、7。 炎症におけるキープレーヤー、器官特異的自己免疫疾患（ 例えば 、慢性関節リウマチや気管支喘息）、および癌免疫療法における関心の高い細胞としては、TH1細胞の時間的分布とホーミングパターンを特徴付けることが重要です。 PETによる非侵襲性インビボイメージングは、in vivoホーミングにおいて 、細胞遊走パターンを調べるために、定量的、高感度法8を提示し、炎症、アレルギー、感染または腫瘍拒絶9、10、11の間にT細胞作用および応答の部位。 臨床的には、インオキシン111は 、2-デオキシ-2-（18ながら、炎症及び感染12の識別のための白血球シンチグラフィーのために使用されますF）フルオロ-D-グルコース（18 F-FDG）は、一般にPET 3,13によって細胞追跡研究のために使用されます。このPETトレーサーの1つの主要な欠点は、しかし、109.7分で放射性核種18 Fと後の時点でイメージングは養子細胞移入を投稿妨げ低細胞内安定性の半減期が短いです。細胞中で不安定であるがPETによるインビボ細胞追跡研究における長期のために、64のCu-PTSMは、しばしば非特異的T細胞生存率に対する最小に有害な影響を有するセル14、15をラベル16を機能するために使用されます。 このプロトコルは、さらに、T細胞受容体（TCR）に特異的な放射性標識モノクローナル抗体を用いて細胞生存率および機能に不利な影響を低減する方法が記載されています。まず、放射性同位体64にCu、THとのmAb KJ1-26のコンジュゲートの製造Eキレート剤DOTA、およびそれに続く64のCu-放射標識が示されています。第二ステップでは、単離およびDO11.10ドナーマウスのコバ-TH1細胞の増殖及び64のCu-ロードDOTA-結合mAb KJ1-26（64のCu-DOTA-KJ1-26）による放射性標識は、詳細に記載されています。それぞれ線量キャリブレータを有するとγカウンティングによる取り込み値と放射能の流出の評価、ならびにIFN-γELISAでトリパンブルー排除および機能によって細胞生存率に対して64のCu-放射標識の効果の評価が提示されます。 インビボ細胞追跡に非侵襲のために、養子細胞移入後のPET / CTによるコバ誘発性急性気道DTHRと画像取得のマウスモデルの誘発が記載されています。 また、この標識アプローチは、異なる疾患モデル、別のTCR又は膜結合受容体又は発現MARを関心のある一般的な細胞とマウスT細胞に伝達することができますKERSは、連続膜17を往復の基礎となります。

<table><tbody><tr><td>HCl, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1.00318<</td><td>sup>64Cu production</td></tr><tr><td>Methanol, Suprapur</td><td>Merck, ダルムシュタット, ドイツ</td><td>1.06007</td><td>64Cu production</td></tr><tr><td>Isopropanol, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1.0104</td><td>64Cu production</td></tr><tr><td>Pt/Ir (90/10) plate</td><td>&Ouml;gussa</td><td>カスタムメイド</td><td>64Cu生産</td></tr><tr><td>PEEKチャンバー</td><td>WKL</td><td>カスタムメイド</td><td>64Cu 生産</td></tr><tr><td>64Ni</td><td>Chemotrade</td><td></td><td>64Cu生産</td></tr><tr><td>ポリグラム SIL G/UV 254プレート</td><td>Macherey-Nagel</td><td>805021</td><td>64Cu生産</td></tr><tr><td>イオン交換コラム</td><td>BioRad</td><td>AG1-X8</td><td>64Cu 製造</td></tr><tr><td>PETtrace用固体ターゲットシステム</td><td>WKL</td><td>costum made</td><td>64Cu 製造</td></tr><tr><td>64Cu ワークアップモジュール</td><td>WKL</td><td>costum made</td><td>64Cu 製造</td></tr><tr><td>用量校正器</td><td>Capintec</td><td>CRC-25R</td><td></td></tr><tr><td>PETtraceサイクロトロン</td><td>General Electric Medical Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOTA-NHS</td><td>Macrocyclics</td><td>B-280</td><td>DOTA-conjugation</td></tr><tr><td>Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26)</td><td></td><td>Isolated from hybridoma cell culture</td><td>DOTA-conjugation</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71633</td><td>DOTA-conjugation</td></tr><tr><td>H+Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td>DOTA結合</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 フィルターユニット</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910008</td><td>DOTA結合</td></tr><tr><td>Rotipuran 超純水</td><td>Carl</td><td>Roth HN68.3</td><td>DOTA結合</td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32301</td><td>DOTA結合</td></tr><tr><td>PBS</td><td>テュービンゲン</td><td></td><td>DOTA-conjugation</td></tr><tr><td>Micro Bio-spin P-6 column</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>7326221</td><td>DOTA-conjugation</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71497</td><td>DOTA-conjugation</td></tr><tr><td>Cyclone Plus PhosphorImager&nbsp;</td><td>Perkin-Elmer</td><td>L2250116</td><td>DOTA標識</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Merck Millipore</td><td>102568</td><td>T細胞培地用成分&nbsp;</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1004B</td><td>T細胞培地用成分&nbsp;</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td>メル<td>クミリポア</td><td>L0473T</td><td>細胞培地用成分&nbsp;</td></tr><tr><td>MEMアミノ酸</td><td>メルクミリポア</td><td>K0293</td><td>T細胞培地用成分&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>メルクミリポア</td><td>L 1613</td><td>T細胞培地用成分&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>メルクミリポア</td><td>A2212</td><td>T細胞培地用成分&nbsp;</td></tr><tr><td>0.05 mM 2-&β;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>T細胞培地用成分&nbsp;</td></tr><tr><td>DO11.10マウス</td><td></td><td>の社内育種</td><td>TH1細胞培養</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>TH1細胞培養</td></tr><tr><td>セルストレーナー40&micro;m&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>TH1 細胞培養</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>TH1 細胞培養</td></tr><tr><td>CD4 MicroBeads, マウス</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-097-145</td><td>TH1 細胞培養</td></tr><tr><td>QuadroMACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-976</td><td>TH1 細胞培養</td></tr><tr><td>LS カラム</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td>TH1 細胞培養</td></tr><tr><td>抗CD4抗体 (Gk1.5)</td><td></td><td>ハイブリドーマ細胞培養</td><td>TH1細胞培養</td>から単離</tr><tr><td>抗CD8抗体 (5367.2)</td><td></td><td>ハイブリドーマ細胞培養から単離</td><td>TH1細胞培養</td></tr><tr><td>抗ラット抗体 (MAR18.5)</td><td></td><td>ハイブリドーマ細胞培養から単離</td><td>TH1細胞培養</td></tr><tr><td>ウサギ補体</td>MA <td>tebu-Bio</td><td>CL3221</td><td>TH1 細胞培養</td></tr><tr><td>抗IL-4抗体 (11B11)</td><td></td><td>ハイブリドーマ細胞培養</td><td>TH1細胞培養</td></tr><tr><td>cOVA 323-339-peptideから単離&nbsp;</td><td>EMC-micro-collections</td><td>カスタムオーダー</td><td>TH1 細胞培養</td></tr><tr><td>CPG1668-オリゴヌクレオチド</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>カスタムオーダー</td><td>TH1 細胞培養</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis</td><td>65483-116-07</td><td>TH1 細胞培養</td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>655180</td><td>TH1細胞培養</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>662160</td><td>TH1 細胞培養</td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>660175</td><td>TH1細胞培養</td></tr><tr><td>48ウェルプレート</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>677 180</td><td>セルラベリング</td></tr><tr><td>Gammacell 1000</td><td>Best Theratronics</td><td>viaお問い合わせ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ガルメイ RT225</td><td>ガルメイ</td><td>viaお問い合わせ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>メルクミリポア</td><td>L6323</td><td>in vitro評価</td></tr><tr><td>マウス IFN-&γ;ELISA</td><td>BD Biosciences</td><td>558258</td><td>in vitro評価</td></tr><tr><td>PE アネキシン V アポトーシス検出キット&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td> <td>559763in vitro 評価</td></tr><tr><td>チューブ 5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>55.476</td><td>in vitro 評価</td></tr><tr><td>丸底チューブ&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td> <td>352008in vitro評価</td></tr><tr><td>ウィザード &gamma;-counter</td><td>Perkin-Elmer</td><td>2480-0010</td><td>in vitro 評価</td></tr><tr><td>ELISA Reader MultiscanEX</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>51118177</td><td>in vitro 評価</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Leica</td><td>via お問い合わせ&nbsp;</td><td>in vitro評価</td></tr><tr><td>BD LSRII&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>viaお問い合わせ&nbsp;</td><td>in vitro評価</td></tr><tr><td>BALB/c マウス</td><td>Charles River</td><td>028</td><td>in vivo 細胞輸送</td></tr><tr><td>アルミニウムゲル</td><td>Serva 電気泳動</td><td>12261.01<</td><td>em>in vivo 細胞輸送</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>Bayer HealthCare</td><td>注文 via 大学病院</td><td>in vivo細胞輸送</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>Ratiopharm</td><td>注文 via 大学病院</td><td>in vivo 細胞輸送</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>CP-Pharma</td> 注文 <td>via 大学病院</td><td>in vivo 細胞輸送</td></tr><tr><td>30 G 針</td><td>BD Biosciences</td><td>304000<</td><td>em>in vivo 細胞輸送</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>11612491</td><td>in vivo細胞輸送</td></tr><tr><td>キャピラリー10 &micro;L</td><td>VWR</td><td>612-2439</td><td></td></tr><tr><td>Inveon PETスキャナー</td><td>Siemens Healthineers</td><td>は利用できなくなりました</td><td>in vivo細胞の輸送、代替企業:Bruker、Mediso&nbsp;</td></tr><tr><td>Inveon SPECT/CTスキャナー</td><td>Siemens Healthineers</td><td>販売終了</td><td>in vivo細胞輸送</td></tr><tr><td>Inveon Research Workplace</td><td>Siemens Healthineers</td><td></td><td>画像解析、代替ソフトウェア:Pmod</td></tr></tbody></table>

マウスリンパ球標識による<sup&gt; 64</sup以下のためのターゲット設定&gt;のcu-抗体の受容体<em&gt;インビボ</em&gt; pet / ctによる細胞輸送

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

このプロトコルは、64 Cuおよびマウスリンパ球細胞培養および細胞の標的64のCu-抗体受容体続いモノクローナル抗体（mAb）のキレート剤結合体/放射性標識の製造を示します。 PET / CTによって過敏反応（DTHR）型遅延気道の動物モデルにおけるインビボ細胞追跡における放射性標識および非侵襲性のインビトロ評価に記載されています。 詳細には、キレート剤1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸（DOTA）とのmAbの結合が示されています。放射性64のCuの製造以下、DOTA共役mAbの放射性標識が記載されています。次に、ニワトリオボアルブミンの膨張（コバ）特異的CD4 +インターフェロン（IFN）-γを産生するTヘルパー細胞（コバ-TH1）とコバ-TH1細胞のその後の放射標識が示されています。様々なインビトロ技術は、EFを評価するために提示されていますフローサイトメトリーのために、トリパンブルー排除により、細胞生存率の決意のような細胞上の64のCu-放射標識のfects、アネキシンVとアポトーシスの染色、およびIFN-γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）による機能の評価。さらに、細胞内への放射性取り込みおよび標識安定性の決意は、詳細に記載されています。このプロトコルは、更に、従って、BALB / cマウスにおけるコバ誘発性急性気道DHTRの誘導が含まれる、気道DTHRの動物モデルにおける細胞追跡研究を実行する方法について説明します。最後に、画像収集、再建、および分析を含む強固なPET / CTのワークフローが提示されます。 その後の受容体内在64のCu-抗体受容体標的化アプローチは、細胞標識のための一般的なPET-トレーサーと比較して高い特異性および安定性、低下細胞毒性、及び低い流出速度を提供し、例えば 64銅-pyruvaldehydeビス（N4メチルチオ）（64のCu-PTSM）。最後に、我々のアプローチは、48時間、最適な信号対バックグラウンド比PET / CTによってインビボ細胞追跡に非侵襲可能。この実験的アプローチは、内在化された膜結合型受容体とは異なる動物モデルおよび細胞型に転送することができます。

図1は、64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbおよびインビトロおよびこのプロトコルで覆われたインビボ研究の実験設計とコバ-TH1細胞の標識を要約します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55270/55270fig1.jpg" /> 図1：64のCu-DOTA-KJ1-26-モノクローナル抗体ラベリング処理＆実験デザイン。 （A）64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbによる放射性細胞標識の略図。 64のCu-DOTA-KJ1-26-mAbがTH1細胞の細胞表面上のコバ-TCR受容体に結合し、24時間以内受容体内在化されます。コバ-TCRは、放射性標識...

生存能力、機能、ラベリング安定性およびアポトーシスについて分析し、そして養子気道遅延型過敏症を有するマウスに移し、トランスジェニックマウスのT細胞受容体に結合する64のCu修飾モノクローナル抗体の調製後、T細胞は、in vivoで放射性標識されています陽電子放出断層撮影/コンピュータ断層撮影法（PET / CT）によって非侵襲的イメージングのための反応。

マウスリンパ球標識による<sup&gt; 64</sup以下のためのターゲット設定&gt;のCu-抗体の受容体<em&gt;インビボ</em&gt; PET / CTによる細胞輸送

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

本手順の全体的な目的は、銅修飾された放射性モノクローナル抗体を用いてマウスリンパ球を安定的に標識し、炎症または癌のマウスモデルにおいて、PET/CTによりリンパ球の時間的な分布とホーミングパターンをin vivoで追跡することです。この手法は、再生医療における幹細胞治療や癌免疫療法などの細胞ベースの治療における作用部位およびその根底にある主要な生物学的原理の解明に役立ちます。本技術の主な利点は、細胞への悪影響を最小限に抑えつつ、高いコントラストで48時間にわたる細胞遊走のイメージングが可能であることです。この手法は、特定の膜結合型受容体とそれに対応するモノクローナル抗体を用いることで、任意の細胞型に容易に転用することが可能です。一般的に、この手法に不慣れな場合、キレート剤の結合および放射性標識のプロセスに苦慮することがあり、その結果、免疫反応性画分や細胞特異的活性が低下することがあります。まず、DO11.10マウスを70% ethanolで消毒することから始めてください。次に、肢を粘着テープで固定し、動物の腹部に沿って正中切開を行います。切開部位の両側を外側に引き、皮膚を腹膜から剥離させ、頸管、軸、腕、および鼠径リンパ節を確認します。鈍的なピンセットを用いて、これらのリンパ節を1% FCS含有PBSの容器に移します。次に腹膜を開き、脾臓を膵臓および結合組織から分離して、リンパ節とともに脾臓を保存します。すべての組織の回収が終わったら、サンプルを15 mLコニカルチューブ内の40 µmフィルターに移し、シリンジプランジャーを用いて組織をすり潰します。その後、フィルターを10 mLのPBS希釈FCSで洗浄し、遠心分離により単一細胞懸濁液を回収します。赤血球を溶血させた後、製造元の指示に従い、白血球ペレットを新鮮なPBS + FCSおよびCD4陽性MicroBeadsに再懸濁します。4°Cで20分間置いた後、最大50 mLの新鮮なPBS + FCSバッファーで細胞を洗浄し、CD4陰性細胞集団を磁気カラムで溶出させるため、適切な容量のPBS + FCSに細胞を再懸濁します。細胞を磁気細胞分離カラムにロードし、通り抜けた液を15 mLコニカルチューブに回収します。磁気細胞分離の終了後、プランジャーを使用してCD4陽性細胞群を新しいコニカルチューブに押し出し、単離したCD4陽性T細胞懸濁液の濃度を、4°Cでの保存用に新鮮な完全培地を用いて1×10⁶ cells/mLに調整します。遠心分離によりCD4陰性細胞を回収します。沈殿物をanti-CD4、anti-CD8、マウス抗ラットモノクローナル抗体、およびウサギ補体を含む溶液で再懸濁し、37°Cで45分間インキュベートします。遠心分離により細胞を回収した後、ペレットを3 mLの新鮮な完全培地で再懸濁し、ネガティブセレクショ

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶマウスリンパ球の放射性抗体標識法。PET/CTを用いて炎症やがんモデルにおける細胞動態とホーミングパターンを48時間追跡し、細胞治療の作用機序解明に貢献する非侵襲的イメージング技術です。

マウスリンパ球標識による

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