ツインスポットMARCMを使用して細胞系譜の解析と遺伝子機能研究
2017年3月2日
ここで、我々は、2つの異なる色で共通の前駆細胞由来の神経細胞の可視化を可能にモザイク標識技術のためのプロトコルを提示します。これは、出生付き合っ個々のニューロンを、異なる個体の同じ神経細胞に遺伝子機能を研究する能力を持つ神経系統解析を容易にします。
このツインスポットMARCMプロトコルの全体的な目標は、高分解能の細胞系譜解析とより優れた遺伝子機能研究を行うことです。脳組織は膨大な数の多様なニューロンで構成されており、発生中にニューロンがどのように組み立てられるかの根底にあるメカニズムを研究することは困難です。この手法の主な利点は、一般的なニューロン前駆細胞に由来するニューロンを2つの異なる色で標識できることです。
これにより、個々のニューロンの情報の誕生を検索することができます。したがって、この手法は、研究者が神経発達の根底にある細胞および分子メカニズムを探求するのに役立ちます。今日、その手順を実演するのはPei-Chi Chungです。
ユウ教授の研究室の技術者。まず、ツインスポットのMARCM対応オスとメスをフライフードバイアルに組み合わせ、バイアルに新鮮な酵母を入れます。交配したツインスポットのMARCMレディフライを摂氏25度で2日間維持し、受精卵を収集する前に交配の可能性を高めます。
幼虫が孵化したときに過密状態にならないように、交差したツインスポットのMARCMレディフライを軽くたたいて、新鮮な酵母のバイアルに移します。ツインスポットMARCMの子孫を、彼らが発達の望ましい段階に達するまで培養します。ここでは、幼虫期のハエにヒートショックを与えてフリッパーゼの発現を誘導します。
フライバイアルを摂氏37度のウォーターバスに10分、20分、30分、40分、50分移して、フリッパーゼ発現に最適なヒートショックを決定します。対象のツインスポット MARCM クローンを生成する。ヒートショックのタイミングによってクリアリングが発生する段階が決まり、ヒートショックの期間によってクリアリングが発生する回数が決まります。
25°CのMARCM動物を25°Cで熱に衝撃を与え、所望の発達段階まで培養します。その後、染色と埋込みに進みます。鉗子保護皿にPBSを追加します。
そして、ツインスポットのMARCM動物を皿に移します。解剖顕微鏡を覗きながら、鉗子を使用してツインスポットMARCM動物の脳を解剖します。まず、ハエの体から頭を取り外します。
次に、脳に損傷を与えることなく、キューティクルをそっと取り除きます。次に、白い色の繊維として現れる気管を慎重に取り除きます。脳を4%ホルムアルデヒドとPBSを含むガラススポットプレートに移します。
そして室温で20分間固定します。染色手順を開始するには、ハエの脳を1%PBTで3回すすぎます。その後、1%PBTで3回洗浄します。
毎回30分間振とうします。一次抗体の混合物とハエの脳を、摂氏4度で一晩または室温で4時間インキュベートします。ハエの脳を1%PBTでそれぞれ3回すすぎ、洗う、前と同じように振る
。次に、ハエの脳を二次抗体の混合物と室温で4時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。前回と同様に脳をすすぎ、洗浄した後、消光剤で脳をマイクロスライドにマウントします。そして、ハエの脳を覆って保護するためのカバーガラスを置きます。
マイクロカバーガラスとマイクロスライドの端を透明なマニキュアで密封します。最後に、選択した共焦点顕微鏡システムを使用して、サンプルからツインスポットMARCMクローンの蛍光画像を撮影します。この図は、フリップパーゼの誘導によって誘導されたVL2p前背側嗅球投射ニューロンであるツインスポットMARCMクローンの結果を示しています。
胚期のadPN神経芽球におけるマイトーシス組換えを媒介すること。この最初の図は、ニューロン新生のパターンを示しています。この脳の共焦点顕微鏡画像では、VL2p adPNは緑色で示され、マゼンタの多細胞神経芽球adPNと関連しています。
この画像は、側角の細胞を示しています。触角葉のニューロン形態がここに見られます。この画像は、DL1 adPNのデータを示しています。
ここで見るように、DL1 adPNはVL2p adPNよりも開発が遅れています。DC3 adPNのツインスポットMARCMクローンの誘導は、このニューロンタイプが発生の後半に現れることを示しています。この画像は、adPN系統内のGAL4ネガティブニューロンでツインスポットMARCMイベントが発生することを示しています。
この手法を習得すると、研究者は神経系統を分析し、ニューロンと神経芽細胞クローンを区別するためのさまざまなマーカーを提供することができます。さらに、ツインスポットMARCMは、ホモ接合型変異体クローンを作製し、分子メカニズムを探索することができます。ヘテロ接合性の遺伝的背景で。
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概要
本記事では、ニューロンにおける高解像度の細胞系譜解析および遺伝子機能研究のために設計された、ツインスポットMARCMプロトコルを紹介します。共通の前駆細胞から派生したニューロンを2つの異なる色で標識することで、個々のニューロンの発達と誕生時期を効果的に追跡することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 発生生物学
背景
- 脳組織は多種多様なニューロンで構成されています。
- 発生過程におけるニューロンの集積を理解することは困難です。
- 現在の手法では、系統追跡に十分な解像度が得られない可能性があります。
- 本プロトコルは、これらの課題を解決することを目的としています。
研究目的
- 詳細な細胞系譜解析を行うため。
- ニューロンにおける遺伝子機能の研究を強化するため。
- 神経発達における細胞および分子メカニズムの探索を促進するため。
使用方法
- ニューロン標識のためのツインスポットMARCMプロトコル。
- リネージトレーシングのための異なる色マーカーの使用。
- 高解像度イメージング技術。
- ニューロンの発達および遺伝子機能の解析。
主な結果
- 共通の前駆細胞から派生したニューロンの正常なラベル化。
- 個々のニューロンの誕生情報の回収能力。
- 神経系譜および発生に関する理解の深化。
- 異なる個体における遺伝子機能を研究するための潜在的な応用可能性。
結論
- ツインスポットMARCMプロトコルは、神経科学研究において価値の高いツールです。
- これにより、ニューロンの系統および遺伝子機能の詳細な解析が可能になります。
- この手法は、神経発達の理解を大幅に深めることができます。
よくある質問
業界における重要性
モデル生物における神経系のリネージ（細胞系譜）と遺伝子機能を理解することは、神経治療薬開発におけるターゲット検証のための基礎的な知見を提供します。twin-spot MARCM法を用いることで、ニューロンの出生順序を高解像度でマッピングし、個体間で遺伝的に同一なニューロンの表現型解析を行うことが可能となり、初期探索段階におけるメカニズムのデリスキング（リスク低減）を支援します。このアプローチは、発生メカニズムを疾患関連システムにおける機能的結果に結びつけることで、予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：共通の前駆細胞からニューロンの系譜を追跡することで、特定の細胞集団における遺伝子機能を評価し、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値：ヘテロ接合体背景におけるホモ接合体変異クローンの表現型解析を通じて、生物学的なリスク低減（de-risking）を促進し、メカニズムの曖昧さを解消する。
- 予測的価値：神経発達疾患のメカニズムと相関する定量的な系譜データを提供し、ポートフォリオの優先順位付け（triage）を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：疾患に関連する神経回路における後続の化合物スクリーニングに適した、検証済みの色分けされた神経系を構築できる。
- 運用的価値：ヒートショックの時間で制御される、誘導性のステージ特異的なクローン生成により、アッセイの標準化と再現性を確保できる。
- 拡張性：複数の神経サブタイプ（例：adPN系統）にわたってプラットフォームを再利用でき、比較表現型スクリーニングが可能である。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナル価値：神経発達障害に関与するニューロンの出生順解析を可能にすることで、疾患に関連したシステムモデリングを支援する。
- メカニズムのデリスキング：個体間で同一のニューロンの表現型解析を可能にし、遺伝子機能研究における遺伝的な変動と確率的な変動を区別できる。
- 前臨床の連続性：ターゲットへの結合およびパスウェイ変調研究のためのリネージ分解能データを提示することで、発見から検証への橋渡しを行う。
パイプラインおよびワークフローの統合
ツインスポットMARCM法は、初期のターゲット検証から前臨床的なメカニズム研究に至るディスカバリーの連続的なプロセスに組み込まれており、特にニューロンの起源とコネクティビティが重要となる神経発達疾患の適応において有用です。
- 探索生物学：遺伝子摂動を系統特異的なニューロン表現型に結びつけることで、仮説検証および経路の解明を支援します。
- スクリーニング：クローンの誕生時期とマーカー発現に基づく定量的出力により、アッセイにそのまま使用可能な再現性のあるニューロン調製物を提供します。
- 分析：2色読み出しを用いることで、発達段階に応じたニューロンの形態および遺伝子発現の比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：バイオマーカーに整合したターゲット変調のための系統整合モデルを提供し、前臨床検証へと繋げます。
- エンタープライズでの再利用：プロジェクトやモデルシステムを横断して標準化されたニューロンコホートを生成するための、再利用可能な機能として作用します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 遺伝子機能研究におけるリネージ（系統）に関連する交絡を減らすことで、ターゲットバリデーションの予測信頼性を向上させる。
- 運用の価値： 制御されたクローン誘導および標準化された染色・封入プロトコルを通じて、再現性と標準化を高める。
- 戦略的価値： リネージ特異的な表現型効果の早期検出を可能にすることで、go/no-go判断を改善し、後期の生物学的リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響： 不均一な組織における神経細胞ターゲットのメカニズム的な明確さを提供することで、リスク調整済みの開発推進を支援する。
実施上の検討事項
- 正確な系統解釈のために、Drosophilaの遺伝学、クローナル標識法、および共焦点顕微鏡法に関する専門知識が必要です。
- クローナルの誘導および可視化のために、ヒートショック装置、解剖顕微鏡、共焦点イメージングシステムなどの機器に依存します。
- ユーザー間でのクローナルの整合性を確保するため、ヒートショックのタイミング、染色プロトコル、およびイメージングパラメータのチーム間標準化が必要です。
- 提示されたadPNモデル以外の異なる神経系統や発生段階に本手法を適用する場合、適応に関する検討が必要となります。
- プロトコルに記載されている通り、クローナル効率がヒートショックの時間に依存することや、標的とする系統ごとに最適化が必要であることなどの実用的制限があります。
