Name: イメージングフローサイトメトリーを使用したT細胞同種反応性の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶイメージングフローサイトメトリーを用いたT細胞同種反応性測定法。移植免疫学においてドナー抗原に反応するT細胞の割合を解析し、免疫シナプス形成を可視化して移植片転帰予測に応用する。

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SCJはFellowship.SM旅行国際心肺移植研究員と医師のロイヤル・カレッジ・オブ協会とカナダDetweilerの外科医によって支持された心と（SCJ）は肺移植キャリア開発賞のための国際協会によって部分的にサポートされていました。 SSは、ヘルスリサーチをOxford Biomedical研究Centre.JHの国立研究所によってサポートされていました腎臓リサーチUK上級非臨床フェローシップの受け手です。ウェルカムトラストプログラム・グラント（082519Z07Z）、英国心臓財団プログラム・グラント（PG / 10 / 62.28504）、およびEUフレームワーク計画7（; BioDRIM ONE研究）：この作品は、ABとKWに以下の助成金によって賄われていました。著者は、のImageStreamマークXの機器とへのアクセスとサポートを提供するためのマイケル・パーソンズとフローサイトメトリーコア施設Lunenfeld-タネンバウム研究所で、シナイ医療システム、トロントに感謝したいです。

<ol><li>Cravedi, P., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+monitoring+in+transplantation+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Immunologic monitoring in transplantation revisited.</a> Curr Opin Organ Transplant. 17 (1), 26-32 (2012).</li>
<li>Pearson, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assessment+of+transplantation+tolerance+induced+by+anti-CD4+monoclonal+antibody+in+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model.</a> Transplantation. 55 (2), 361-367 (1993).</li>
<li>Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+tolerance+twelve+years+after+prospective+withdrawal+of+immunosuppressive+drugs%3A+studies+of+chimerism+and+anti-donor+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity.</a> Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).</li>
<li>Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+precursor+frequency+does+not+correlate+with+either+the+incidence+or+severity+of+graft-versus-host+disease+after+matched+unrelated+donor+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation.</a> Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).</li>
<li>Roelen, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+cytotoxic+alloreactivity+under+different+immunosuppressive+regimens+in+clinical+islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation.</a> Clin Exp Immunol. 156 (1), 141-148 (2009).</li>
<li>VanBuskirk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+allograft+acceptance+is+associated+with+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human allograft acceptance is associated with immune regulation.</a> J Clin Invest. 106 (1), 145-155 (2000).</li>
<li>Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panel+of+reactive+T+cells+as+a+measurement+of+primed+cellular+alloimmunity+in+kidney+transplant+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (2), 564-572 (2006).</li>
<li>Zitzner, J. R., Tambur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ELISPOT+Assays+in+Risk+Assessment+Pre-+and+Post-Kidney+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation.</a> Cells. 1 (2), 100-110 (2012).</li>
<li>Newell, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+B+cell+signature+associated+with+renal+transplant+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans.</a> J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).</li>
<li>Brouard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+peripheral+blood+transcriptional+biomarker+panel+associated+with+operational+renal+allograft+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (39), 15448-15453 (2007).</li>
<li>Sagoo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+cross-platform+biomarker+signature+to+detect+renal+transplant+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans.</a> J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).</li>
<li>Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assessment+of+disease+states+in+kidney+transplant+biopsy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples.</a> Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+common+blood+gene+signatures+for+the+diagnosis+of+renal+and+cardiac+acute+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection.</a> PLoS One. 8 (12), e82153(2013).</li>
<li>Khatri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+rejection+module+%28CRM%29+for+acute+rejection+across+multiple+organs+identifies+novel+therapeutics+for+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation.</a> J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).</li>
<li>Halloran, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+diagnosis+of+antibody-mediated+rejection+in+kidney+transplant+biopsies%3A+an+international+prospective+study+%28INTERCOM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM).</a> Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).</li>
<li>Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+biomarkers+and+functional+assays+to+monitor+cell-therapy-induced+tolerance+in+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).</li>
<li>Miqueu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+peripheral+T-cell+repertoire+in+kidney+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients.</a> Eur J Immunol. 40 (11), 3280-3290 (2010).</li>
<li>Morris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+donor-reactive+T+cells%3A+Evidence+for+clonal+deletion+in+tolerant+kidney+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients.</a> Sci Transl Med. 7 (272), 272ra210(2015).</li>
<li>Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor+engagement+delivers+a+stop+signal+to+migrating+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).</li>
<li>Goldsmith, M. A., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+signal+transduction+by+the+antigen+receptor+without+commitment+to+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation.</a> Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+T+cell-dendritic+cell+interactions+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes.</a> Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).</li>
<li>Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+CD4%28%2B%29+T+Cell+Alloreactivity+and+Its+Control+by+Regulatory+T+Cells+Using+Time-Lapse+Microscopy+and+Immune+Synapse+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection.</a> Am J Transplant. 16 (5), 1394-1407 (2016).</li>
<li>Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numbers+matter%3A+quantitative+and+dynamic+analysis+of+the+formation+of+an+immunological+synapse+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 347 (1-2), 79-86 (2009).</li>
<li>Burbach, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+regulation+of+integrin-dependent+T+cell+conjugate+formation+and+NF-kappa+B+activation+by+the+adapter+protein+ADAP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP.</a> J Immunol. 181 (7), 4840-4851 (2008).</li>
<li>Markey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-dressing+by+donor+dendritic+cells+after+allogeneic+bone+marrow+transplantation+contributes+to+formation+of+the+immunological+synapse+and+maximizes+responses+to+indirectly+presented+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-dressing by donor dendritic cells after allogeneic bone marrow transplantation contributes to formation of the immunological synapse and maximizes responses to indirectly presented antigen.</a> J Immunol. 192 (11), 5426-5433 (2014).</li>
<li>Moreau, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li>
<li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InFlow+microscopy+of+human+leukocytes%3A+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li>
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<li>Macedo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+naive+and+memory+T-cell+populations+to+the+human+alloimmune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Contribution of naive and memory T-cell populations to the human alloimmune response.</a> Am J Transplant. 9 (9), 2057-2066 (2009).</li>
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<li>Lee, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+recognition+of+allopeptides+promotes+the+development+of+cardiac+allograft+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Indirect recognition of allopeptides promotes the development of cardiac allograft vasculopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (6), 3276-3281 (2001).</li>
<li>Pickl, W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characteristics+of+dendritic+cells+generated+from+highly+purified+CD14%2B+peripheral+blood+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes.</a> J Immunol. 157 (9), 3850-3859 (1996).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Francis, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transplantation+tolerance+converts+potential+effector+T+cells+into+graft-protective+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).</li>
<li>Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+induction+of+transplantation+tolerance+with+a+nondepleting+anti-Cd4+monoclonal+antibody+and+donor-specific+transfusion+before+transplantation.+A+critical+period+of+time+is+required+for+development+of+immunological+unresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness.</a> Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).</li>
<li>Faust, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T+cell+TGFbeta+signaling+and+IL-17+in+allograft+acceptance+and+fibrosis+associated+with+chronic+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection.</a> J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+CD4+Th17+cells+in+mediating+cardiac+allograft+rejection+and+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy.</a> J Exp Med. 205 (13), 3133-3144 (2008).</li>
<li>Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+alloreactive+T+cell+repertoire+using+high-throughput+sequencing+of+mixed+lymphocyte+reaction+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture.</a> PLoS One. 9 (11), e111943(2014).</li>
<li>Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+indirect+allorecognition+in+lung+transplant+recipients+with+obliterative+bronchiolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis.</a> Am J Transplant. 3 (6), 736-742 (2003).</li>
<li>Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+direct+and+indirect+T+cell+alloreactivity+during+allograft+rejection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice.</a> J Immunol. 162 (1), 352-358 (1999).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+direct+and+indirect+recognition+pathways+to+T+cell+alloreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity.</a> J Exp Med. 177 (6), 1643-1650 (1993).</li>
</ol>

著者は、開示することは何もありません。

イメージングフローサイトメトリー、モノクローナルT細胞およびAPCの間、またはスーパー抗原24、25、26、27、28の存在下における免疫シナプス形成を実証するために使用されてきました。この方法は、生産的T細胞APCの接触後、T細胞は、コンタクト21の部位に向かって偏光、そのアクチン細胞骨格を再配置するという事実を利用します。この再配置は、TCRシグナル伝達なしに発生せず、それゆえT細胞活性化19、20、21の初期の相関です。ここで提示された方法は、ポリクローナルT細胞集団におけるアロ反応性T細胞の頻度の測定にこのアプローチを適応させます。このように、将来的には、ドナーのためのアッセイの開発のための基礎として役立ち得るreactivi<html>臨床移植におけるTY。 直接の比較はまだなされていないが、アロ反応性免疫シナプスの検出は、従来のMLRよりも優れた予測力を持っているように見えます。例えば、以前の研究は、上記の寛容化プロトコールにおいて、MLRの結果を確実に移植転帰2と相関しない、ことを示しています。 これらは、アロ抗原に反応してエフェクター細胞機能を測定しないがアッセイの数は、11、10、ヒト9に運用寛容状態のために開発されています。 対照的に、IFNγELISPOTは、IL-17 38のように、8小節エフェクターT細胞機能のアッセイが、急性および慢性同種移植片拒絶反応に関連し得るサイトカイン分泌の全スペクトルを捕捉することができません&gt; 39。 労働集約的であり、限界希釈アッセイ4、およびマウスを必要とトランスビボアッセイ 6は 、臨床現場での適用を妨げる重大な実用上の制限があります。 MLRにおける応答T細胞のTCR配列解析を用いて細胞増殖の分析に関する最近の改良は価値があるかもしれませんが、ここで示したアッセイのように、臨床研究におけるさらなる検証18、40が必要になります。 免疫シナプス検出アッセイのさらなる開発は重要な質問の数が回答されている必要があります。まず、開発されたようアッセイは、唯一の直接同種反応性を測定します。直接経路は、ドナー由来のAPC上の同種MHC /ペプチド複合体のプレゼンテーションを伴います。後者は、一般に移植後速やかに除去し、さらに同種抗原提示はCARRIあるれますそのままのドナーMHC（半直接経路）または自己MHC（間接経路）に加工し、ドナー抗原を提示し、受信者のAPCによって編。間接的な経路は、慢性同種移植片拒絶反応33、41の重要なドライバです。 原理的には、このアッセイを用いた間接免疫シナプスを検出することが可能でなければなりませんが、間接的アロ反応性T細胞は、イベントのより多くの分析が必要とされることを意味し、直接的なもの42、43よりもはるかに低い周波数を有します。第二の考慮事項は、CD8 + T細胞はまた、抗ドナー応答の重要な構成要素であるのに対し、我々は唯一の、CD4 + T細胞を用いてこのアッセイを試験していることです。再び、この方法を用いてCD8 + T細胞APCシナプスを検出することが可能であるべきです。別の制限は、この方法は、最終MEMBにおける細胞画像のマニュアルレビューおよび分析を必要とすることですRANEコンタクトゲート、そして我々は現在、このステップの自動化に取り組んでいます。 最後に、この方法は、ヒト被験者でのテストと開発を必要とし、ヒトサンプルとの予備的研究が現在行われています。移植レシピエントにおける免疫シナプスの検出と組み合わせて、さらなる表現型のT細胞サブセットの分析（ すなわち 、エフェクター、メモリ、調節など ）アロ反応性T細胞レパートリーを特徴付けるための強力なアプローチを表すことになるとのための重要な焦点です。今後の課題。

固形臓器移植は、腎臓、肝臓、心臓、および肺の末期疾患の患者のケアを形質転換しました。 免疫抑制剤が使用されていない場合はメジャーとマイナー組織適合性抗原での格差に起因して、しかし、同種移植片は、速やかに受信者のT細胞によって拒否されています。これらの薬剤は、癌および臓器不全のリスクを含む多数の副作用を、持っています。主要な臨床目標は、同種移植片拒絶を防止するために必要な最小レベルまで免疫抑制の用量を低下させることです。このレベルは、自然免疫系の活性化の程度に依存して変化する可能性があります。ドナー - 受信者アロ抗原ミスマッチの程度;そして、患者間の免疫機能の違い、薬物動態、および薬力学。 残念ながら、移植臨床医は、正確に個々の患者1にドナー反応性を評価するための任意のツールを持っていません。 ミックス白血球反応（MLR）は、ドナー反応性を検出することができるが、それは確実にグラフト結果2,3を予測することができません。 、限界希釈アッセイ、サイトカインELISPOTS、およびトランスビボアッセイのいずれかが応答の限られた範囲を測定または動作公差9、10、11に関連した4、5、6、7、8つの .Gene発現プロファイルを明らかにした署名は実用的ではありません12及び拒絶13、14、15、これらは常に集団16を横切って一般化されず、最終的に個々の患者に限られた有用性を有していてもよいです。 配列ベースANALYMLR 18における末梢血17または増殖中のT細胞のT細胞受容体（TCR）のSESも開発が、さらなる検証が必要とされています。 概念的には、ドナー抗原によるレシピエントT細胞活性化において最も早く必要なステップを検出するアッセイを有することが望ましいであろう。 アーティファクトを導入することができる（MLRのように）日にわたって細胞を培養するため、そのような試験は、理想的には、このような増殖またはエフェクター機能などの下流の事象の測定を必要としません。テストは純粋に記述的評価から、T細胞機能のいくつかの要素に依存することに等しく、しかし、それはまた、望ましいであろう （ 例えば、TCR配列）はアネルギー性と機能性T細胞を区別することができないかもしれません。 多くの研究は、長期T-APC接触が不可欠である第一の免疫シナプスの形成のために必要とされることが示されていますT細胞応答19、20、21、22のステップ。マウスCD4 + T細胞の10％同種骨髄由来樹状細胞（BMDCを）23との長期的なコンタクトを形成する-私たちは、最近、 インビトロタイムラプス撮影の動的中、約5は、と報告しました。 長時間接触の頻度は、マウスで以前に同じ抗原に対して耐性のに対し、移植片を拒絶した動物において増加し、それは非移植マウス23に見られるレベルに留まりました。 長期の相互作用は、レシピエントTregの存在下で還元し、その非存在下では増加し、我々は、ヒトT細胞および同種異系の単球由来DC（MoDCを）23を使用して同様の現象を観察しました。 しかし、長時間コンタクトの列挙は、ポリクローナルT細胞populatio内で行わNは時間がかかり、労働集約的です。したがって、我々は、画像の使用は、同種免疫シナプス形成を調べるために、フローサイトメトリーを行いました。イメージングフローサイトメトリーは、蛍光顕微鏡の単一細胞イメージング能力を持つ従来のフローサイトメトリーのマルチパラメトリックデータの取得および解析機能を組み込んでいます。この技術は、モノクローナルT細胞24、26、27又はスーパー抗原28の存在下における免疫シナプス形成を研究するために他の研究者によって使用されてきました。アロ反応性T細胞は、一般に、総T細胞レパートリー29、30、31、32の5〜15％を表すと推定されるのに対し、このような設定では、しかし、T細胞応答の頻度は、30から100パーセントの範囲です。重要なことに、我々は、イメージングフローサイトメトリー、AVを生成することができることを示しましたERY匹敵アロ反応性T細胞の頻度23の尺度およびポリクローナルT細胞集団内のシナプス周波数の変化は、グラフト結果23の予測されます。現在、このアプローチは、CD4 + T細胞の直接の同種反応性を測定するために最適化されているが、原理的に、また、CD8 + T細胞および間接的な経路を調べるために開発することができます。間接アロ反応性は、移植後33長い時間でますます関連するようになると考えられています。我々は現在、患者でのテストを可能にするヒト細胞を、使用するには、この方法を開発しています。したがって、将来的には、全体的なアプローチは、移植前に移植レシピエントにおけるT細胞応答の機能評価のために有用であり得ます。すぐに移植した後、そして長期的に、薬剤の最小化が重要な目標となったとき。

<table><tbody><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>様々な</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアメンテトラ酢酸、0.5 M溶液</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100 非イオン性洗剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>β-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td><td>ド Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>溶液は 37% ホルムアルデヒドであるため、1.5% 溶液 セル ストレーナーの場合は 25 倍に希釈する必要があります</td></tr><tr><td>セル ストレーナー、70 &mu;m 細孔径</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>ファロイジン-フルオレセインイソチオシアネート</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P5282</td><td></td></tr><tr><td>7-アミノアクチノマイシン D</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>A1310</td><td>DMSOで再構成</td></tr><tr><td>アロフィコシアニン標識抗マウス CD90.2</td><td>eBioscience</td><td>17-0902</td><td></td></tr><tr><td>太平洋青色標識抗マウス CD11b</td><td>eBioscience</td><td>48-0112</td><td>パシフィックブルーはeFluorに置き換えられました 450</td></tr><tr><td>ビオチン化抗マウスCD3</td><td>eBioscience</td><td>13-0032</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗マウスMHCクラスII</td><td>eBioscience</td><td>13-5321</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗マウス B220</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗マウスCD8</td><td>eBioscience</td><td>13-0081</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗マウスCD19</td><td>eBioscience</td><td>13-0193</td><td></td></tr><tr><td>抗ビオチンマイクロビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>LSカラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS 磁気細胞セパレーター</td><td>MIltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスGM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトTGF&β;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>ヒト TGF&β;1 はマウス細胞に活性があります</td></tr><tr><td>Amnis ImageStream X Mark II</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>イメージングフローサイトメーター; 詳細は</td></tr> <tr><td>http://www.emdmillipore.com/ IDEAS Software</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>無料ダウンロード：登録が必要です：</td></tr><tr><td>https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20 細胞培養培地&nbsp;</td><td>様々な</td><td>変化</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>様々な</td><td>変化</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート</td><td>様々な</td><td>変化</td><td></td></tr></tbody></table>

イメージングフローサイトメトリーを使用したt細胞同種反応性の測定

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

移植レシピエントにおけるドナー抗原に対する免疫学的反応性の測定は、成功の減少や免疫抑制の撤退のために重要である可能性が高いです。混合白血球反応（MLR）、限界希釈アッセイ、およびトランスインビボ遅延型過敏症（DTH）アッセイは全て、この問題に適用されているが、これらの方法は、予測能力及び/又はそれらの有用性を低下させる重大な実用上の制限が制限されています。 イメージングフローサイトメトリーは、蛍光顕微鏡の撮像機能を備えたフローサイトメトリーのマルチパラメトリック定量的な力を兼ね備えた技術です。我々は最近、ドナー抗原提示細胞（APC）との成熟した免疫シナプスを形成することができるレシピエントT細胞の割合を定義するために、撮像フローサイトメトリー法を使用しました。よく特徴付けられたマウス心臓移植モデルを用いて、我々は示されたそのT-APCのmembrうちインビトロ免疫シナプスの周波数ANE接触イベントは強く同種移植片拒絶反応、耐性の結果、および移植の生存が誘導制御性T細胞に依存状況を予測しました。 T-APCの接触の頻度は、急性拒絶反応の際にマウスからT細胞を増加し、同種抗原に応答しないレンダリングされたマウスからのT細胞を減少しました。 インビトロ系に調節性T細胞の添加は、長期T-APCの接触を減少させました。決定的に、この効果はまた、天然のヒト化マウスモデルにおけるヒト組織の拒絶反応を制御することが知られている制御性T細胞を、発生、拡大ヒトポリクローナルで見られました。このアプローチのさらなる開発は、移植レシピエントにおけるアロ反応性T細胞コンパートメントのより深い特徴付けを可能にすることができます。将来的には、ヒト細胞を用いたこの方法のさらなる開発及び評価は、免疫抑制の最小化のために患者を選択するために使用されるアッセイのための基礎を形成してもよく、寛容原の影響を測定するために使用することができますクリニックにおけるICの治療法。

この方法は、異所心臓同種移植片の移植の前にドナー同種抗原に対して耐性マウスにおいてCD4 + T細胞の同種反応性を調べるために使用しました。 CBAマウス（H-2 k）は B6心臓移植を受ける前に、非消失性CD4抗体一月組み合わせるドナー特異的（B6、H-2 b）は、輸血からなる寛容化プロトコルを与えられました。 Foxp3 +制御性T細胞36,37に依存し、長期同種移植片生存におけるこのプロトコルの結果。七日後の移植は、このプロトコルに従って、脾臓CD4 + T細胞をB6、心臓同種移植片の寛容化および非寛容化レシピエントから入手し、B6骨髄由来DCと共培養しました。 図2は、この実験からの代表的データを示します。膜接触ゲートは、 図2に示されていますシナプス事象（左のパネル、1）上および非シナプス事象（右パネル）上に配置された緑色の十字線と、。 図2Bは 、このイベントのために明視野と蛍光チャネルを示しています。バイアスを低減するために、データは、治療割当23に盲検観察者によって分析しました。非寛容化の両方から、 図3のいくつかの例に示すように （ 図3A-B）及び寛容化（ 図3C-D）B6心臓のCBAレシピエントは、シナプスは、T-APC界面における緻密FITC陽性リッジの存在によって非シナプス連絡先から容易に区別されます。これらの結果は、レシピエントT細胞によって作られた免疫シナプスの視覚的検出は、レシピエントにおける同種反応性の程度で追跡することを示します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig2.jpg" /> メンブレンT-APCダブレットの図2同定連絡先と免疫シナプス形成。最終の二重ゲート（ 図1F）内のイベントが分析されます。 APCオブジェクトマスクのA. T細胞マーカーの蛍光は、DCオブジェクトマスクにおけるAPCマーカー蛍光に対してプロットされています。 いくつかの二重事象は、細胞 - 細胞接触なしAPCとT細胞を有しており、プロットの左下隅に表示される（画像が示されていません）。膜接触ゲートは、このようにT細胞及びAPCは接触しているだけダブレットを含むことを描くことができます。このゲート内の各イベントの画像は、ファロイジン-FITCチャネルにおけるアクチン細胞骨格再編成の証拠について検討されると解析ソフトウェアを使用してタグ付けすることができます。右のパネルは、免疫シナプスの形成（2標識と緑十字線で示される）ことなく、膜接触事象を示し、一方、左のパネルは、免疫シナプス事象（1標識と緑十字線で示す）を示しています。シナプス形成の決意は、これらの手動審査を要求します画像、B. B.に示す一番上の行は、免疫シナプスとダブレットのために明視野と蛍光チャネル画像を示す（Aのイベント1に相当します）。下の行は、膜接触とダブレットを示しているが、シナプス形成（Aにおけるイベント2に相当する）を欠きます。データは、処置割り当てに対して盲検で分析し、以前に公開された実験23からのものであるしました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig3.jpg" /> T-APCシナプス形成の3例を図。 CBAマウス（非消失性抗CD4抗体のカバーの下にない前処理（AB）のいずれかの後またはB6全血と寛容誘導後B6ドナーからの心臓同種移植片を受け<st<html>栄&gt; CD）。 7日後、脾臓CD4 + T細胞をB6 DCとシナプス形成について試験しました。 A.非寛容化動物からの膜接触と非シナプスダブレットの3例。 B.非寛容化動物から免疫シナプスの三つの例。 C.寛容化動物からの膜の接触と非シナプスダブレットの三つの例。 D.寛容化動物から免疫シナプスの三つの例。シナプス形成は、T-APC界面で明るい、FITC陽性リッジ（CH03）の存在によって示されます。データは、処置割り当てに対して盲検で分析し、以前に公開された実験23からのものであるしました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> AYS &quot;&gt; <tbody><tr><td> 抗体/色素 </td><td> 蛍光色素 </td><td> チャネル </td><td> 濃度 </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> eF450 </td><td> CH02 </td><td> 5μg/ mlの、経験的に滴定</td></tr><tr><td> CD90.2 </td><td> APC </td><td> CH06 </td><td> 5μg/ mlの、経験的に滴定</td></tr><tr><td>ファロイジン</td><td> FITC </td><td> CH03 </td><td> 0.5μg/ mLの - 0.05 </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> - </td><td> Ch05 </td><td> 25μg/ mLの</td></tr></tbody></table> 表1抗体および本研究で用いた染料。蛍光標識抗体、染料、サプライヤ、および推奨濃度は表に示されています。各蛍光色素を検出するために使用されたチャネルサイトメータ撮像流れも表に示されています。

この論文は、イメージングフローサイトメトリーを使用して、T細胞の混合集団におけるアロ反応性を測定するための方法を記載しています。

イメージングフローサイトメトリーを使用したT細胞同種反応性の測定

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

本手順の全体的な目的は、イメージングフローサイトメトリーを用いてT細胞の同種反応性を測定することです。この手法は、レシピエントのT細胞のどの程度の割合がドナーの同種抗原に対して反応性を持つかなど、移植免疫学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術は、フローサイトメトリーの多パラメーター定量能と蛍光顕微鏡のイメージング機能を組み合わせることで、個々のT細胞と抗原提示細胞のシナプスを高スループットで解析することを可能にします。手順のデモンストレーションは、私の研究室のポスドクであるSajad Moshkelgoshaが行います。まず、96ウェル細胞培養プレートの各ウェルに0.5×10⁶個の樹状細胞を播種し、続いて1×10⁶個のT細胞を加え、最後に培養液を加えて1ウェルあたりの総量を50 µLにします。冷やした培養物を37°C、5% CO2条件下で4時間インキュベートします。次に、PBSで調製した1.5%ホルムアルデヒドを培養液量の3倍量、各ウェルに添加し、室温で30分間置きます。固定終了後、各ウェルの細胞を対応する5 mLポリスチレンチューブに移します。適切なフルオロクロム標識抗体を100 µLの洗浄バッファーに加え、室温・遮光条件下で30分間細胞を染色します。次に、1 mLの洗浄バッファーで細胞を洗浄し、phalloidin FITCを含むperm/washバッファーでペレットを再懸濁します。室温・遮光条件下でさらに30分間静置した後、1 mLの新鮮なperm/washバッファーで細胞を洗浄します。ペレットを目的の核染色液を含むperm/washバッファーで再懸濁し、遮光下、室温で30分間最終インキュベーションを行います。1 mLのperm/washバッファーで細胞を洗浄し、続いてwashバッファーのみで1回洗浄します。その後、細胞を50〜100 µLの新鮮なwashバッファーで再懸濁します。細胞を蓋付きの小型マイクロ遠心チューブに移します。細胞間相互作用を解析するために、まず明視野像取得用に1つのチャネルを確保し、最初のコントロールチューブをロードします。明視野チャネルをオフにした状態で、ワークスペースウィンドウにて、使用する各チャネルについて、面積に対するアスペクト比の新しい散布図を作成します。アスペクト比が1に近いシングルレットをゲートします。各蛍光色素について、陽性集団を確認し、必要に応じて照明ボックス内のレーザー電圧を調整します。チャンネルボックスで、染色のに使用した蛍光色素に適したチャンネルを選択します。次に、「record」をクリックします。イベント数が指定したしきい値に達すると、データ収集が自動的に停止します。すべての単色染色コントロールの収集が完了したら、最初の実験サンプルチューブをロードし、明視野チャンネルを含む適切な解析チャンネルで数万個のイベントを収集します。補正マトリックスを作成するには、シングルステインコントロールのデータファイルを補正ウィザードに読み込み、実験に適した蛍光チャネルを選択します。正しいポジティブ集団が選択されていることを確認した後、マトリックス内の値をダブルクリックし、各チャネルのグラフを解析領域に追加します。最後に「完了」をクリックし、補正マトリックスをCTMファイルとして保存します。RIFファイルを適切な解析ソフトウェアにロードします。RIFファイルをデータ解析用のDAFファイルに変換します。最初のサンプルファイルを開きます。明視野チャンネルにおけるイメージ強度の変化率の二乗平均平方根（RMS）をプロットします。次に、抗原提示細胞マーカーについて、面積に対するアスペクト比をプロットします。単一の抗原提示細胞を含むダブレットをゲートします。T細胞マーカーについて、アスペクト比を縦軸に面積を横軸にとったプロットを作成します。T細胞1個を含むダブレットをゲートで囲みます。互いに接触している細胞を特定するため、解析メニューの「masks」オプションを使用してマスクマネージャーを開き、新しいマスクに「T cell object mask」という名前を付けます。ファンクションボタンをクリックし、ダイアログボックスでオブジェクトを選択します。T細胞マーカーが検出されているチャネルを選択し、OKをクリックします。同様の手順で、適切なチャネルを用いて抗原提示細胞マーカーのマスクを作成します。抗原提示細胞オブジェクトマスクにおけるT細胞マーカーの蛍光強度を、T細胞オブジェクトマスクにおける抗原提示細胞の蛍光強度に対してプロットします。次に、互いに接触している細胞のみを含むゲートを設定します。最後に、このゲート内のイベントのphalloidin FITC画像を手動で確認し、タグ画像機能を用いてこれらの画像をマークすることで、成熟した免疫シナプスと単純な細胞間接触を区別します。ここでは、B6心臓同種移植後7日の耐性誘導済みおよび非耐性誘導受容体から得られた脾臓CD4陽性T細胞を、B6骨髄由来樹状細胞と共培養させた場合の膜接触ゲートを例として示しています。緑色の十字線でシナプス事象および非シナプス事象が示されています。明視野および蛍光チャンネル解析により、個々のシナプス事象および非シナプス事象の可視化も可能です。実際に、B6心臓を移植した非耐性および耐性CDAレシピエントの両方において、T細胞と抗原提示細胞の界面に高密度のFITC陽性リッジが存在することから、シナプスを非シナプス接点と容易に区別することができます。さらなる開発を経て、この技術は、免疫抑制剤の減量や投与中止、あるいはヒト移植レシピエントにおけるグラフト転帰の予測など、臨床現場への応用が可能になると考えられます。

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