イメージングフローサイトメトリーを使用したT細胞同種反応性の測定
2017年4月19日
この論文は、イメージングフローサイトメトリーを使用して、T細胞の混合集団におけるアロ反応性を測定するための方法を記載しています。
この手順の全体的な目標は、イメージングフローサイトメトリーを使用してT細胞のアロア活性を測定することです。この方法は、レシピエントのT細胞のどのくらいの割合がドナーの同種抗原に反応するかなど、移植免疫学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術は、フローサイトメトリーのマルチパラメトリック定性能力と蛍光顕微鏡のイメージング機能を組み合わせて、個々のT細胞抗原提示細胞シナプスのハイスループット検査を可能にします。
その手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるSajad Moshkelgoshaです。まず、ゼロ点の5×10を6番目の樹状細胞に播種します。96ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、続いて10〜6番目のT細胞に1回、およびウェルあたり合計で最大50マイクロリットルの培地の最終容量を得る。
冷やした培養物を摂氏37度と二酸化炭素5%で4時間インキュベートします。次に、PBS中の1ポイント5パーセントホルムアルデヒドの培養量の3倍を各ウェルに室温で30分間加えます。固定の終了時に、各ウェルからの細胞を対応する5ミリリットルのポリスチレンチューブに移します。
適切な蛍光色素標識抗体を用いて、100 μLの洗浄バッファーで、室温で30分間、光から保護して細胞を染色します。次に、細胞を1ミリリットルの洗浄バッファーで洗浄し、ペレットをファロイジンFITCを含むパーマ/洗浄バッファーに再懸濁します。光から保護された室温でさらに30分後、1ミリリットルの新鮮なパーマ/洗浄バッファーで細胞を洗浄します。
目的の核染料にペレットをパーマ/洗浄バッファーに再懸濁し、光から保護された室温で最後の30分間インキュベーションします。細胞を1ミリメートルのパーマ/洗浄バッファーで洗浄し、続いて洗浄バッファーのみで1回洗浄します。次に、細胞を50〜100マイクロリットルの新鮮な洗浄バッファーに再懸濁します。
細胞をキャップ付きの小さな微量遠心チューブに移します。細胞間相互作用を解析するには、まず明視野画像取得用に1つのチャンネルを確保し、最初のコントロールチューブをロードします。明視野チャネルをオフにした状態で、ワークスペースウィンドウで、領域全体のアスペクト比で使用されるチャネルごとに新しい散布図を作成します。
アスペクト比が1に近いシングレットをインゲートします。各蛍光色素について、正の母集団を確認し、必要に応じて照明ボックスのレーザー電圧を調整します。チャンネルボックスで、染色に使用した蛍光色素の適切なチャンネルを選択します。
次に、[記録] をクリックします。イベント数が指定されたしきい値に達すると、取得は自動的に停止します。すべてのシングルステインコントロールを取り込んだ後、最初の実験用サンプルチューブをロードし、明視野チャンネルを含む適切な分析チャンネルで数万のイベントを取り込んでください。
コンペンセーションマトリックスを生成するには、単一の染色コントロールデータファイルをコンペンセーションウィザードにロードし、実験に適した蛍光チャンネルを選択します。正しい正の母集団が選択されていることを確認したら、行列内の値をダブルクリックし、グラフを各チャネルの分析領域に追加します。「終了」をクリックして、補正マトリックスを CTM ファイルとして保存します。
RIFファイルを適切な解析ソフトウェアにロードします。RIF ファイルをデータ分析 DAF ファイルに変換します。最初のサンプル ファイルを開きます。
明視野チャネルのイメージング強度の変化率の二乗平均平方根をプロットします。次に、抗原提示細胞マーカーの面積に対するアスペクト比をプロットします。単一の抗原提示細胞を含むダブレットをインゲートします。
T セル マーカーの面積に対するアスペクト比をプロットします。1つのTセルを含むダブレット上のインゲート。互いに接触しているセルを識別するには、解析メニューでマスクオプションを使用してマスクマネージャーを開き、新しいマスクにT細胞オブジェクトマスクという名前を付けます。
機能ボタンをクリックし、ダイアログボックスでオブジェクトを選択します。T細胞マーカーが検出されるチャネルを選択し、[OK]をクリックします。同様に、適切なチャネルに抗原提示細胞マーカーのマスクを作成します。抗原提示細胞オブジェクトマスクのT細胞マーカー蛍光強度を、T細胞オブジェクトマスクの抗原提示細胞蛍光強度に対してプロットします。
次に、互いに接触しているセルのみを含むゲートを描画します。最後に、このゲート内のイベントのファロイジンFITC画像を手動で確認し、これらの画像をマークするタグ画像機能を使用して、成熟免疫シナプスと単純な細胞間接触を区別します。ここでは、膜接触ゲートは、移植の7日後にB6心臓同種移植片の寛容化および非寛容レシピエントから得られた脾子CD4陽性T細胞について示され、実証されているように、B6骨髄由来樹状細胞と共インキュベートされています。
シナプスイベントと非シナプスイベントは緑色の十字線で示されています。Brighfieldおよび蛍光チャネル分析により、個々のシナプスおよび非シナプスイベントの視覚化も可能になります。実際、B6心臓の非寛容CDAレシピエントと寛容CDAレシピエントの両方からのシナプスは、T細胞抗原提示細胞界面に密集したFITC陽性隆起が存在することにより、非シナプス接触と容易に区別されます。
さらなる開発の後、この技術は、免疫抑制の減少または撤退、またはヒトトランスパントレシピエントにおける移植片転帰の予測などの臨床現場で適用できる可能性があります。
概要
この論文では、イメージングフローサイトメトリーを用いたT細胞の異種反応性の測定方法について説明しています。この技術により、個々のT細胞と抗原提示細胞のシナプスの高スループット検査が可能になります。
主要な研究要素
科学の分野
- 移植免疫学
- 免疫学
- 細胞生物学
背景
- T細胞の異種反応性は移植片拒絶において重要です。
- ドナーの異種抗原に対するT細胞の反応を理解することは重要です。
- イメージングフローサイトメトリーはフローサイトメトリーと蛍光顕微鏡法を組み合わせたものです。
- この方法はT細胞の相互作用の分析を強化します。
研究の目的
- ドナーの異種抗原に反応するT細胞の割合を測定すること。
- T細胞の相互作用を分析するための高スループット法を開発すること。
- 免疫シナプスの形成の理解を深めること。
使用された方法
- 96ウェルプレートに樹状細胞とT細胞を播種すること。
- ホルムアルデヒドで細胞を固定すること。
- 蛍光色素結合抗体で細胞を染色すること。
- イメージングフローサイトメトリーを用いて細胞の相互作用を分析すること。
主な結果
- T細胞と抗原提示細胞の相互作用の同定。
- 免疫シナプスと非シナプティック接触の可視化。
- 寛容化された対非寛容化された受容体におけるシナプス形成の違いの実証。
- 移植免疫学における潜在的な臨床応用。
結論
- この方法はT細胞の異種反応性に関する洞察を提供します。
- 移植受容者の移植片の転帰を予測するのに役立つ可能性があります。
- さらなる開発により臨床応用が向上する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of T cell alloreactivity using imaging flow cytometry addresses a critical challenge in transplant immunology by enabling precise assessment of immune synapse formation between recipient T cells and donor antigen-presenting cells. This capability enhances predictive confidence for graft outcomes and supports risk-adjusted decisions regarding immunosuppression strategies. The approach is positioned to impact early discovery, translational research, and clinical pipeline inflection points in immune modulation and tolerance induction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of alloreactive T cell populations for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of immune synapse formation as a predictive biomarker.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of immune tolerance and rejection pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a high-throughput, multiparametric platform for evaluating T cell-APC interactions.
- Delivers standardized, reproducible quantitative outputs for immune synapse frequency.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound or cell therapy screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro immune synapse metrics with in vivo graft outcome predictions.
- Supports translational continuity from discovery to preclinical validation of tolerogenic interventions.
- Enables measurement of regulatory T cell impact on alloreactivity in disease-relevant models.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging flow cytometry method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for immunomodulatory therapies and transplant tolerance strategies.
- Discovery Biology: Quantifies T cell alloreactivity and immune synapse formation to clarify rejection and tolerance mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for immune cell interaction assays.
- Analytics: Enables statistical comparison of synapse frequencies across experimental conditions and interventions.
- Translational Research: Bridges in vitro immune metrics with preclinical and potential clinical endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical workflow for immune monitoring in diverse transplant and immunotherapy programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in immune response assessment and target validation.
- Operational Value: Standardizes immune synapse quantification for cross-study comparability and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for immunosuppression minimization and tolerance induction strategies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulatory and cell therapy assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, immunology, and advanced image analysis.
- Demands access to imaging flow cytometry instrumentation and compatible analytical software.
- Necessitates standardized staining protocols and gating strategies for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different species, cell types, or clinical sample sources.
- Throughput and data complexity may require dedicated informatics support for large-scale studies.
