新規の表面マーカーの組み合わせで識別離および肝前駆サブセットの濃縮

この肝臓消化プロトコルの全体的な目的は、フローサイトメトリーを用いてさまざまな肝前駆細胞サブセットを評価し、新規の表面マーカーカクテルを用いてこれらの細胞を高純度で単離し、その後の詳細な解析に供することです。この手法は、例えば、肝前駆細胞のサブセット特異的な特徴や、肝損傷時における遠隔原因など、肝前駆細胞の生物学に関するさまざまな疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、in-vitro解析において重要となる、高純度かつ高生存率での前駆細胞の単離が可能であることです。

この消化法は前駆細胞の生物学的知見を得るためのものですが、実際には造血細胞および血管内皮細胞集団の単離にも利用できます。マウス肝臓から単一細胞懸濁液を調製するには、肝葉を乾燥したペトリ皿に移し、メスを用いて組織を約2 mm³の均一な立方体状に細切します。切断した組織片を、消化バッファーを2.5 mLずつ含む15 mLコニカル遠心チューブ2本に、肝臓1個につき分けて移します。

サンプルを37 °Cのウォーターバスに入れ、5分間および10分間、緩やかに振盪します。15分間の消化後、チップの先端を切断した1,000 µLピペットを用いて、肝臓片を静かにピペッティングします。その後、チューブを再びウォーターバスに戻し、組織片を2分間静置させます。

次に、上清を約700 µLずつ2回分、800 µLの回収バッファーで事前濡らしした100 µmストレーナーでろ過します。そして、取り出した分の上清を新しい消化バッファーで補充します。肝組織が見えなくなったら、消化チューブ内のすべての上清をフィルターに通してください。

遠心分離によりすべての細胞を回収します。室温で、細胞ペレットを1 mLの塩化アンモニウム・カリウム溶解バッファーに再懸濁し、1分後に5 mLの新鮮な回収バッファーを加えて溶解を停止させます。再度遠心分離を行い、細胞を回収します。

次に、緩いペレットを乱さないように注意しながら、上清を慎重に吸引します。そして、氷上で4 mLの新鮮な回収バッファーを用いて細胞を再懸濁します。フローサイトメトリーで肝臓サンプルの細胞数を測定するために、まず、1.5 mLポリスチレンチューブ内で肝細胞懸濁液20 µLとPBS 174 µLを混合し、さらにプロピジウムヨード6 µLを加えます。

細胞の定量を可能にするカウンティングビーズを添加し、ビーズと細胞の混合液をフローサイトメーターにロードする。デブリを除去するため、前方散乱光（forward-scatter）パラメータによる側方散乱光（side scatter）のゲートを設定する。前方散乱光の高さ（height）対面積（area）のゲートによってダブレットを除外し、さらにプロピジウムヨード陽性の死細胞を除外する。

次に、30 µLのサンプルをフローサイトメーターにロードし、イベントを記録します。前駆細胞サブセットのフローサイトメトリー解析に向けて肝細胞を染色するため、2x10^5 個ずつの細胞を1.5 mL反応チューブに移します。そして、遠心分離により細胞をペレット化します。

ペレットをFcブロックに再懸濁し、氷上で5分間インキュベートします。その後、適切なチューブに目的の細胞表面染色抗体カクテルを50 µL加え、遮光下、氷上で20分間インキュベートします。インキュベーション終了後、サンプルあたり400 µLの染色バッファーでサンプルを洗浄します。

ペレットを適切な二次抗体カクテル 100 µL に再懸濁し、遮光して氷上で 20 分間静置します。その後、さらに 400 µL の染色バッファーで細胞を洗浄します。そして、プロピジウムヨードを含む染色バッファー 300 µL にペレットを再懸濁します。

フローサイトメーターを用いてサンプルを測定します。磁気マイクロビーズを用いた分離により前駆細胞集団を濃縮するために、1.5-2x10^6個の細胞を適切な数の15 mlコニカルチューブに移し、遠心分離によって細胞を回収します。ペレットをBSA添加HBSS 400 µLで再懸濁します。

次に、40 µLのanti-CD31 Microbeadsと30 µLのanti-CD45 Microbeadsを加え、4 °Cで15分間インキュベートします。続いて、5 mLのHBSS plus BSAで細胞を洗浄します。そして、ペレットを100 µLのdead cell removal beadsに再懸濁し、室温で15分間インキュベートします。

細胞をインキュベートしている間に、肝臓1つにつき1本の適切なサイズのポジティブセレクションカラムを、3 mLのBSA添加HBSSで平衡化します。次に、細胞に900 µLのBSA添加HBSSを加え、100 µmのポリアミドフィルターメッシュで細胞をろ過します。ビーズでインキュベートしたろ過後の細胞をカラムにロードし、溶出液を遠心チューブに回収します。

すべての細胞がカラムを通過した後、BSA添加HBSS 3 mLでカラムを3回洗浄します。遠心分離で細胞をペレット化し、100 µLのリンスバッファーおよびFcブロックで細胞ペレットを再懸濁します。4〜6個の肝臓から得られた細胞ペレット、または1x10^6個未満のネガティブセレクション細胞を回収してください。

5分後、抗GP38ビオチン化抗体を用いて氷上で10分間細胞をラベルします。インキュベーション終了後、遠心分離で細胞を回収し、400 µLの洗浄バッファーおよび5 µLのAnti-Biotin Microbeadsに再懸濁します。4 °Cで15分間置いた後、すぐに5 mLの洗浄バッファーで細胞を洗浄します。

その後、ペレットを1 mLの新鮮な洗浄バッファーで再懸濁します。再懸濁した細胞を冷却した15-ラックに設置し、自動磁気分離を開始します。次に、フロースルーを遠心分離し、得られたペレットを予定している下流の実験解析に適した溶液で再懸濁します。

CD45、CD31、およびアシアル糖タンパク質受容体1（asialoglycoprotein one receptor）に陰性の細胞をゲーティングすることで肝前駆細胞を選択し、その後、糖タンパク質38（glycoprotein 38）およびCD133の発現に基づいてグループ分けすることが可能です。gp38陽性CD133陽性およびgp38陰性CD133陽性の細胞は、健康な成マウスの肝臓におけるCD45陰性CD31陰性ASGPR1陰性細胞の中で最も豊富に存在する細胞集団であり、前駆細胞に関連すると以前から知られている様々な表面マーカーの発現に明らかな差異が認められます。前述のように、磁性マイクロビーズを用いたこれらの前駆細胞の単離により、高い生存率を維持したまま90%以上の純度で肝細胞を回収することができます。

これらの希少な細胞を単離しようとする際は、肝臓の消化ステップで使用する酵素を考慮することが重要です。使用する酵素によって、得られる特定の前駆細胞サブポピュレーションが異なり、CD133の発現レベルが大幅に低下する可能性があるためです。また、細胞の純度と回収率は、肝臓単一細胞懸濁液をいかに穏和に調製できるかに依存することを忘れてはいけません。細胞破片や死細胞の混入量が多いと、本プロトコルの成功に悪影響を及ぼす可能性があります。