Name: 新規の表面マーカーの組み合わせで識別離および肝前駆サブセットの濃縮 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学ぼう、フローサイトメトリーと新規表面マーカーカクテルを用いてマウス肝臓から肝前駆細胞サブセットを高純度に分離する方法。高生存率の単一細胞懸濁液調製と磁性ビーズ分離技術により、肝損傷と再生の研究に有用なデータを得られます。

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<ol><li>Dolle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+isolation+of+liver+progenitor+cells+by+aldehyde+dehydrogenase+activity+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice.</a> Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).</li>
<li>Dolle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quest+for+liver+progenitor+cells%3A+a+practical+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The quest for liver progenitor cells: a practical point of view.</a> J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+markers+for+the+murine+oval+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Surface markers for the murine oval cell response.</a> Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).</li>
<li>Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ductular+reactions+in+human+liver%3A+diversity+at+the+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Ductular reactions in human liver: diversity at the interface.</a> Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).</li>
<li>Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+tracing+of+Sox9%2B+liver+progenitors+in+mouse+oval+cell+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury.</a> Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).</li>
<li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxl1-Cre-marked+adult+hepatic+progenitors+have+clonogenic+and+bilineage+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential.</a> Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).</li>
<li>Furuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cell+supply+from+a+Sox9-expressing+progenitor+zone+in+adult+liver%2C+exocrine+pancreas+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine.</a> Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).</li>
<li>Font-Burgada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+Periportal+Hepatocytes+Regenerate+the+Injured+Liver+without+Giving+Rise+to+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer.</a> Cell. 162 (4), 766-779 (2015).</li>
<li>Kuramitsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+fibrotic+liver+regeneration+in+mice+is+linked+to+a+severe+fibrogenic+response+driven+by+hepatic+progenitor+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation.</a> Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).</li>
<li>Pritchard, M. T., Nagy, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+fibrosis+is+enhanced+and+accompanied+by+robust+oval+cell+activation+after+chronic+carbon+tetrachloride+administration+to+Egr-1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice.</a> Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).</li>
<li>Spee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+liver+progenitor+cell+niche+in+liver+diseases%3A+potential+involvement+of+Wnt+and+Notch+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling.</a> Gut. 59 (2), 247-257 (2010).</li>
<li>Eckert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podoplanin+discriminates+distinct+stromal+cell+populations+and+a+novel+progenitor+subset+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).</li>
<li>Epting, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+antigen-1+is+necessary+for+cell-cycle+withdrawal+and+myoblast+differentiation+in+C2C12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).</li>
<li>Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+immortalisation+of+hepatic+oval+cells+from+adult+mice+fed+a+choline-deficient%2C+ethionine-supplemented+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet.</a> Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).</li>
<li>Rountree, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).</li>
<li>Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD133%2B+liver+stem+cells+for+clonal+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li>
<li>Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Change+and+Induction+of+Cytokeratin+Expression+During+In+Vitro+Culture+of+Corneal+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).</li>
<li>Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+%28MSC%29%3A+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Commun Signal. 9, 12(2011).</li>
<li>Schmelzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stem+cells+from+fetal+and+postnatal+donors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors.</a> J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).</li>
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著者には、競合する金融利害関係を持っていません。

肝臓の炎症と異なる起源の損傷は、前駆細胞の増殖および活性化2、3を伴う肝臓での再生プロセスをトリガーします。これらの肝前駆細胞は、細胞性幹有し、おそらく、様々な肝疾患の病理学的機序において重要な役割を果たす。 肝臓前駆細胞の不均一性は、長い間示唆されています。異なる表面マーカーを運ぶサブセットを識別し、肝損傷12の間の炎症関連遺伝子の固有のセットを表現できるCD133およびGP38の新たな表面マーカーの組み合わせを使用して、肝前駆細胞サブセットの再評価。ここで説明する方法は、稀な細胞の直接のフローサイトメトリー分析および種々の肝障害モデルでの直接比較を可能にします。種々の傷害は、複数の前駆体の活性化をトリガーするように、これは、特に適切です小管反応...

肝臓再生は、主に肝細胞の自己再生能と関連しています。それにもかかわらず、慢性肝損傷は、肝細胞及び胆管1、2、3、4に分化する能力と関連している前駆細胞の活性化および拡大で起こります。慢性傷害の間、肝細胞増殖が有効でない場合、これは特に重要です。前駆細胞を標的とする多数の遺伝的追跡研究にもかかわらず、肝臓再生におけるそれらの役割は、5、6、7、8議論の余地。また、前駆細胞の活性化は、負傷9の間にそれらの正確な役割について疑問を提起肝臓で増加した線維化反応、にリンクされています、10。 前駆細胞コンパートメントの不均一な性質は、長い顕微解剖または細胞選別に基づく方法1、11を使用して単一の表面マーカーを発現する前駆細胞を単離し、遺伝子発現研究によって示唆されています。実際、最近、GP38（ポドプラニン）を使用して、新規な表面マーカーの組み合わせは明確種々のサブセット12に前駆細胞の前の単一のマーカーを結合されました。重要なことは、これらのサブセットは、それらの表面マーカー発現が異なるだけでなく、怪我12の間に機能的変化を示しただけではなく。 多数の動物モデルは、前駆細胞の活性化及び肝再生を研究するために利用されています。様々な損傷の種類は、前駆細胞12の異なるサブセットの活性化を促進すると思われます。これは、pHを説明するかもしれません人間4で観察された小管反応のenotypic発散。このように、前駆細胞の複雑な表現型および機能解析は、怪我や肝疾患における小管反応の真の意義における役割を理解することが極めて重要です。 表面マーカーの組み合わせの他に、細胞単離プロトコールにおける重要な違いは、さらに、以前の研究2に基づいて結論を複雑にします。研究のかなりの量が大きく、それらの単離プロトコルが異なる前駆細胞（ 例えば、肝臓解離（酵素の組み合わせと処理の持続時間）、密度媒体、及び遠心分離スピード）の役割に対処2。希少な細胞集団とサブセットの組成物の反射のためのより良い生存可能性を提供する最適化された分離技術は、開発され、最近12公開されています。この記事の目的は、より多くのDETを提供することです技術の適切な再現を可能にするために、この肝細胞の単離手順およびサブセット解析のプロトコルをailed。さらに、プロトコルは、新しいプロトコルと比較して違いを示すために、以前の分離法との比較を含んでいます。

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッドフリー DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ P</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11249002001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>17105041</tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>1% ストック溶液</td></tr><tr><td>10% BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>autoMACSすすぎ液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>0.5% (v/v) BSA を加え、氷上に保存します</td></tr><tr><td>フェノールレッドフリー DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1145</td><td></td></tr><tr><td>カウント ビーズ カウント ブライト</td><td>ライフ テクノロジー</td><td>ズ C36950</td><td></td></tr><tr><td>PI</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr><tr><td>FcR ブロッキング試薬</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>抗CD31マイクロビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-418</td><td></td></tr><tr><td>抗CD45マイクロビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>死細胞除去キット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>抗ビオチンMicroビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>CD64</td>精製<td>バイオレジェンド</td><td>139302</td><td>希釈:1:100</td></tr><tr><td>CD16/32精製</td><td>されたBioLegend</td><td>101302</td><td>希釈率:1:100</td></tr><tr><td>CD45 APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103116</td><td>希釈率:1:200、造血細胞をマーク</td></tr><tr><td>CD31 Biotin</td><td>BioLegend</td><td>102504</td><td>希釈率:1:200、内皮細胞をマーク</td></tr><tr><td>ASGPR1 精製</td><td>バイオテクネ</td><td>AF2755-SP</td><td>希釈率:1:100、肝細胞</td></tr>ポ<tr><td>ドプラニン APC</td><td>BioLegend</td> <td>をマーク127410</td>希釈<td>:1:1,400、前駆細胞ポ</td></tr><tr><td>ドプラニンBiotin</td><td>BioLegend</td><td>127404</td><td>希釈:1:1,400</td></tr><tr><td>CD133 PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-210</td><td>3 & マイクロを使用します。L, marks progenitor cells</td></tr><tr><td>CD133 Biotin</td><td>BioLegend</td><td>141206</td><td>希釈率: 1:100</td></tr><tr><td>CD34 Biotin</td><td>eBioScience</td><td>13-0341-81</td><td>希釈率: 1:100</td></tr><tr><td>CD90.2 Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>140306</td><td>希釈率: 1:800</td></tr><tr><td>CD157 PE</td><td>BioLegend</td><td>140203</td><td>希釈率: 1:600</td></tr><tr><td>EpCAM Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>118225</td><td>希釈:1:100</td></tr><tr><td>SCA-1 Biotin</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-885</td><td>10 & マイクロを使用します。L</td></tr><tr><td>マウスIgG2b、&κ;PE</td><td>BioLegend</td><td>400311</td><td></td></tr><tr><td>ラット IgG1 PE</td><td>BioLegend</td><td>400407</td><td></td></tr><tr><td>ラット IgG2b, & カッパ;APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>400624</td><td></td></tr><tr><td>ラット IgG2a, & κ;ビオチン</td><td>バイオレジェンド</td><td>400504</td><td></td></tr><tr><td>ラットIgG2a、およびカッパ;ブリリアントバイオレット421</td>バイオ<td>レジェンド</td><td>400535</td><td></td></tr><tr><td>シリアハムスターIgG APC</td><td>BioLegend</td><td>402012</td><td></td></tr><tr><td>シリアハムスターIgGビオチン</td><td>BioLegend</td><td>402004</td><td></td></tr><tr><td>正常なヤギIgG制御精製</td><td>バイオテクネ</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>ロバ反ヤギIgGアレクサフロー488</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズA11055</td>希釈<td>:1:800</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン アレクサ フルーア 405</td><td>ライフ テクノロジー</td><td>ズ S32351</td><td>希釈: 1:400</td></tr><tr><td>100 & マイクロ;m フィルターメッシュ</td><td>A. Hartenstein</td><td>PAS3</td><td></td></tr><tr><td>LS カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>FACS AriaTMIII</td><td>BDBiosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva sofware</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン丸底チューブ</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy plus mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>RLT 溶解バッファーが含まれています</td></tr></tbody></table>

新規の表面マーカーの組み合わせで識別離および肝前駆サブセットの濃縮

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

慢性肝臓傷害の間、前駆細胞は、炎症性細胞浸潤および上皮細胞の活性化の出現を伴う小管反応と呼ばれるプロセスで展開します。そのような炎症反応中に前駆細胞集団は、大部分の組織学的分析によって、またはフローサイトメトリーベースの技術のいずれかによって、単一の表面マーカーを使用して研究されています。しかしながら、新規な表面マーカーは、細胞コンパートメント幹/肝前駆細胞内の種々の機能的に異なるサブセットを同定しました。ここで紹介する方法は、新規の表面マーカーの組み合わせを使用して、前駆細胞サブセットの分析サイトメトリー分離と詳細な流れを説明しています。また、種々の前駆細胞のサブセットは、自動磁気及びFACSソーティングに基づく方法を用いて高純度で単離することができる方法を示します。重要なことは、小説や肝臓の単純化された酵素的解離は高い生存率これらの希少な細胞集団の単離を可能にしますそれは、他の既存の方法に比べて優れています。これは、さらに、インビトロで前駆細胞を研究するため、または遺伝子発現プロファイルを分析するために、高品質のRNAを単離するために特に適切です。

実質及び非実質肝細胞（ 図1および図2A）を含む単一細胞懸濁液中の酵素の結果の新規な混合物を使用して、肝臓の消化のためにここに提示手順。赤血球のACK-溶解後、単一細胞懸濁液の分析サイトメトリー直接流れが（ 図1及び2）が可能です。ゲーティング戦略はダブレットと死細胞（ 図2a）の排除を伴います。 CD45、CD31、およびASGPR1のために陰性である細胞がゲートされます。この集団は、肝臓前駆細胞を含み、それらのGP38及びCD133発現（ 図2A）に基づいて分類することができます。 GP38 + CD133 +およびGP38 - CD133 +細胞はCD45の中で最も豊富な細胞集団表す- CD31 - ASGPR1 -</sup...

肝臓損傷は、不均一な細胞集団を表し、前駆細胞の増殖を伴います。この細胞区画の新規分類は、複数のサブセットの区別を可能にします。ここで説明する方法は、分析し、さらなるアッセイのために使用することができる種々のサブセットの高純度分離、フローサイトメトリーを示します。

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

この肝臓消化プロトコルの全体的な目的は、フローサイトメトリーを用いてさまざまな肝前駆細胞サブセットを評価し、新規の表面マーカーカクテルを用いてこれらの細胞を高純度で単離し、その後の詳細な解析に供することです。この手法は、例えば、肝前駆細胞のサブセット特異的な特徴や、肝損傷時における遠隔原因など、肝前駆細胞の生物学に関するさまざまな疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、in-vitro解析において重要となる、高純度かつ高生存率での前駆細胞の単離が可能であることです。この消化法は前駆細胞の生物学的知見を得るためのものですが、実際には造血細胞および血管内皮細胞集団の単離にも利用できます。マウス肝臓から単一細胞懸濁液を調製するには、肝葉を乾燥したペトリ皿に移し、メスを用いて組織を約2 mm³の均一な立方体状に細切します。切断した組織片を、消化バッファーを2.5 mLずつ含む15 mLコニカル遠心チューブ2本に、肝臓1個につき分けて移します。サンプルを37 °Cのウォーターバスに入れ、5分間および10分間、緩やかに振盪します。15分間の消化後、チップの先端を切断した1,000 µLピペットを用いて、肝臓片を静かにピペッティングします。その後、チューブを再びウォーターバスに戻し、組織片を2分間静置させます。次に、上清を約700 µLずつ2回分、800 µLの回収バッファーで事前濡らしした100 µmストレーナーでろ過します。そして、取り出した分の上清を新しい消化バッファーで補充します。肝組織が見えなくなったら、消化チューブ内のすべての上清をフィルターに通してください。遠心分離によりすべての細胞を回収します。室温で、細胞ペレットを1 mLの塩化アンモニウム・カリウム溶解バッファーに再懸濁し、1分後に5 mLの新鮮な回収バッファーを加えて溶解を停止させます。再度遠心分離を行い、細胞を回収します。次に、緩いペレットを乱さないように注意しながら、上清を慎重に吸引します。そして、氷上で4 mLの新鮮な回収バッファーを用いて細胞を再懸濁します。フローサイトメトリーで肝臓サンプルの細胞数を測定するために、まず、1.5 mLポリスチレンチューブ内で肝細胞懸濁液20 µLとPBS 174 µLを混合し、さらにプロピジウムヨード6 µLを加えます。細胞の定量を可能にするカウンティングビーズを添加し、ビーズと細胞の混合液をフローサイトメーターにロードする。デブリを除去するため、前方散乱光（forward-scatter）パラメータによる側方散乱光（side scatter）のゲートを設定する。前方散乱光の高さ（height）対面積（area）のゲートによってダブレットを除外し、さらにプロピジウムヨード陽性の死細胞を除外する。次に、30 µLのサンプルをフローサイトメーターにロー

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ここでは、マウスの肝臓全体からCD133発現肝幹細胞およびがん幹細胞を単離する方法について説明します。このプロセスには、組織の消化、細胞の濃縮、およびフローサイトメトリーによる単離が必要です。また、高度な単一細胞単離およびクローン増殖の手法についても解説します。...

クローン性増殖のためのCD133 +肝幹細胞の単離

フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit...

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

同じドナーからヒト肝細胞と非実質肝細胞を分離する技術が説明されています。さまざまな肝細胞タイプが、機能的な肝臓モデルと組織工学の基礎を構築します。この新しい方法は、肝細胞を高収量で生存率で単離することを目的としています。...

初代ヒト肝細胞と非実質肝細胞の対応する主な集団の単離のためのプロトコル

識別し、並べ替え (MAC および FACS) 蛍光と磁気の組み合わせを使ってマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の 6 のサブセットを分離する方法を示します。このプロトコルは、体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化)、養子の転送実験生体内RNA ・...

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)から肝細胞様細胞を18日間で効率的に生成する単層、血清フリー法を詳細に述べている。これは、hPSCが肝細胞様細胞を形成する前に、原始的な筋、決定的な内因性内因性、後部前腸および肝芽前駆体のような中間細胞型に順次分化するように6つのステップを伴う。...

ヒト多能性幹細胞の肝細胞への効率的な分化

本稿の目的は、多能性幹細胞からのヒト肝前駆物質分化を誘導する標準化されたアプローチを提供することです。すぐに使用できるメディア製剤を用いたこの手順の開発は、生物医学の研究と翻訳のためのヒト肝細胞を生成する容易なシステムをユーザーに提供する。...

定義された分化系を用いた多能性幹細胞からの肝前駆体仕様

本稿では、ヒト肺の近位領域および遠位領域からの生存上皮細胞の濃縮を可能にする組織解離および細胞分画アプローチの詳細な方法論を提供する。本明細書では、これらのアプローチは、3Dオルガノイド培養モデルの使用を通じて肺上皮前駆細胞の機能解析に適用される。...

オルガノイド培養のためのヒト肺上皮前駆細胞の単離と濃縮

ここでは、初代マウス肝臓正弦波内皮細胞(LSEC)単離のためのプロトコールを概説し、実証する。このプロトコールは、肝臓コラゲナーゼ灌流、低速遠心分離による非実質細胞精製、およびCD146磁気ビーズ選択に基づいている。また、フローサイトメトリーと走査型電子顕微鏡を用いて、これらの単離されたLSECの表現型と特性評価も行っています。...

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

脂質を含んだ肝細胞は肝臓の再生に固有のものですが、通常は密度勾配遠心分離で失われます。ここでは、脂肪肝細胞を保持する最適化された細胞分離プロトコルを提示し、マウスの部分肝切除後に再生肝細胞の代表的な集団を生み出します。...

マウスにおける肝部分切除後の再生肝細胞の単離

ここでは、定常状態の末梢血から単核球を単離した単核球を用いてヒト自家肝スフェロイドを作製する非遺伝的方法を紹介します。...

肝疾患研究のための末梢血からのヒト肝スフェロイド

多能性幹細胞に由来する肝細胞は、ミトコンドリアと活性化白血球細胞接着分子(ALCAM、CD166)染色の組み合わせを使用して、細胞選別によって精製できます。...

ヒト人工多能性幹細胞由来肝細胞の精製のための細胞選別における生ミトコンドリア染色の応用

学ぼう、フローサイトメトリーと新規表面マーカーカクテルを用いてマウス肝臓から肝前駆細胞サブセットを高純度に分離する方法。高生存率の単一細胞懸濁液調製と磁性ビーズ分離技術により、肝損傷と再生の研究に有用なデータを得られます。

新規の表面マーカーの組み合わせで識別離および肝前駆サブセットの濃縮

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