Name: 飼育 Ixodes肩甲骨、ブラック・ティック・ティック：未熟期をマウスに与える (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 学ぶ未熟期ダニのマウス飼育法。生存率向上と宿主ストレス低減を実現し、血液摂取ダニを1日で効率的に採取できる。ダニコロニー管理と生物学研究に有用なプロトコルです。

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著者は、ネバダ大学リノ校の実験動物医学のスタッフからの支援に感謝しています。MMはネバダ州INBREから資金提供を受けました。

下記に概説プロトコル（数-00682）は、ネバダ大学リノ校で施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、ネバダ大学、リノの動物研究倫理委員会のガイドラインに従っています。手短に言えば、マウスをイソフルランで麻酔し、ノーズコーンを20分間連続イソフルランレベルを維持するために使用しました。獣医軟膏は、麻酔下で、目の乾燥を防ぐために使用されました。つま先のピンチは、麻酔のレベルを確認するために使用され、呼吸数は、プロシージャ全体で測定しました。マウスは、個々のケージに保管し、意識を取り戻したまで監視しました。マウスは、ダニの供給のために一度だけ使用し、ポストティック回復を安楽死させました。安楽死は、動物医療スタッフの人員の研究室で行いました。 CO 2及び頸椎脱臼は、動物を安楽死させるために使用されました。 注：ティックで作業が完了個人用保護EQを使用する必要がありますuipment。未成熟ダニをカウントするため、ゴムバンド、及び閉鎖つま先靴でキャップ白衣のスリーブ開口部を覆うように白白衣、長いニトリル手袋を着用します。ダニをマウスに寄生するために、ヘアネット、使い捨てカバーオール、袖オーバー長袖手袋、フットカバーを使用しています。わがままなダニを検出するために、白や明るい色のカバーオールを使用してください。定期的にダニ用手袋と袖を確認してください。 動物住宅用1.準備室<ol><li>ダニが寄生し、家のマウスに別の部屋を指定します。偶発チック脱出を防ぐために、外部のドアの内側に粘着マットまたは両面カーペットテープを置きます。 </li></ol> 2.カウントはマウス加害ティック<ol><li>すべての7&quot; ×5&quot; ×14&quot; プラスチック容器の上縁の周りに両面テープを入れて、約2cmまで水で満たします。 </li><li> ＆容器の中心に別の小さなボックスまたはペトリ皿を置き、作成1センチメートルまで水で満たします＃34;堀 &quot; </li><li>ペトリ皿の中に幼虫やニンフを含むバイアルを保管します。 </li><li>バイアルから幼虫または幼虫を取り除き、顕微鏡下で数えるために、細かいペイントブラシを使用してください。 50匹の幼虫または25匹のニンバを別々のシンチレーションバイアルに数える。バイアルをナイロンメッシュまたはオルガンディッシュのスクリーンで直ちに覆い、ゴムバンドで閉めます。 </li></ol> 3.未成熟なティックでマウスに感染する<ol><li>白または薄い色の作業台を使用し、両面テープを作業エリアの周辺に貼り付けます。 </li><li>イソフルランでマウスを麻酔する。つま先をつまんで麻酔のレベルを確認してください。麻酔を終えたら、マウスをペーパータオルで覆われた加熱パッドに移し、継続的なイソフルラン供給のためにノーズコーンに取り付けます。 </li><li>乾燥を避けるために石油ゼリーベースの眼軟膏を塗布する。イソフルランレベルを調節するためのマウスの呼吸パターンに注意してください（毎分80~230回の呼吸が正常です）。もしbrであればイソフルランレベルを下げてくださいeathing率）は、動物を殺す避けるために毎分80未満の呼吸です。 </li><li> 50幼虫または若虫25の1つのバイアルを取り、場所はペイントブラシ（ 図1）と耳の間の頭部に毛下ティック。ダニは添付するのに十分な時間を与えるために配置した後20分間麻酔下でマウスを保管してください。 </li><li>静的蓋と白の寝具標準、プラスチック製の靴箱型の使い捨てマウスケージにマウスを移動します。正常なマウスケアに従っておもちゃ、水、および食品を自由に提供します。 </li><li>トップエッジの周りに両面粘着テープと並ぶ大きなラットやスナネズミケージ内にマウスケージを保管してください。水3センチ（ 図2）と外側のケージを埋めます。 </li></ol> 4.マウスからダニの収集<ol><li>未熟ティックは日3及び摂食の6の間で切り離します。 3日後に毎日充血ダニのためのケージと水の堀を確認してください。 </li><li>日4および6.痛みの間にケージから取り外したダニを集めますtブラシまたは軟らかい鉗子を使用してゴムバンドで固定されたナイロンメッシュ布でキャップされたきれいなシンチレーションバイアルに保管してください。 </li><li> 7日目にマウスに麻酔をかけ、残りの付着したダニを確認する。 </li><li> 7日目に詰まったダニについて寝具、フードトラフ、水筒を点検する。上記の手順に従ってマウスを安楽死させる。使い捨てケージ、寝具、ウォーターボトル、フードトラフをオートクレーブして、脱落しないようにします。 </li></ol> 5. Fed Ticksの保管<ol><li> 90％の湿度で虫歯を防ぎ、20 湿潤および温度制御されたインキュベーター中で脱皮が起こるまで、12：12の明暗サイクルを繰り返す。これには約12〜18週間かかります。 </li><li>湿度が高いとダニの生存が促進されるが、ダニは真菌の過増殖を起こしやすい。少なくとも1週間に1回、顕微鏡下で飼育されたダニを金型検査する。検出された場合、生存者を70％エタノールで5回洗浄する分、乾燥するためにろ紙に移し、水ですすぎ、そして新しい、きれいなバイアルに移します。 </li></ol>

<ol><li>Gleim, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+associated+with+tick+bites+and+pathogen+prevalence+in+ticks+parasitizing+humans+in+Georgia%2C+USA%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26amp%3B+Vectors%22%5BJournal%5D)">Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA.</a> Parasites &amp; Vectors. 9 (125), Available from:
 <a target="_blank" href="http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6">http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6</a> 1-13 (2016).</li>
<li>Krober, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+feeding+assays+for+hard+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In vitro feeding assays for hard ticks.</a> Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).</li>
<li>Kuhnert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+of+Hard+Ticks+In+Vitro%3A+New+Perspectives+for+Rearing+and+for+the+Identification+of+Systemic+Acaricides%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides.</a> ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).</li>
<li>Voigt, W. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8233589">In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium.</a> Parasitol. 107, 257-263 (1993).</li>
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<li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSonenshine%2C+DE+%22Biology+of+Ticks%22">Biology of Ticks</a>. 2, Oxford University Press. New York. (1993).</li>
<li>Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBouchard%2C+KR+%22Biology+of+Disease+Vectors%22">Biology of Disease Vectors</a>. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).</li>
<li>Schumaker, T. S., Barros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+cycle+of+Ornithodoros+%28Alectorobius%29+talaje.+%28Acari%3AArgasidae%29+in+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory.</a> J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).</li>
<li>Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+life+cycle+of+Ixodes+woodi+%28Acari%3AIxodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae).</a> J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

プロトコル内の重要なステップ偶発的な逃げを避けるためにダニを飼育するときは、いくつかのレベルの安全対策が必要です。粘着テープと水面を使用することは、安全性を確保する上で重要です。体温を一定に保つために、麻酔したマウスをヒーティングパッド上に置くことが重要です。我々はまた、マウスをシェービングしても、ダニ付着のための特別な利益は得られないことも分かった。個々のマウスは、指定された「ティックルーム（tick room）」内で同じケージ内で1週間保持することができ、これにより、ダニと人員との接触がさらに制限される。 変更とトラブルシューティングダニ生物学およびダニ - 病原体相互作用の研究には、高品質で実験室で飼育されたダニの生産が必要である。以前の栄養補給プロトコルは、マウスを不動に保つために懸架式ワイヤーフロア8または円筒形ケージを使用した6,10であり、動物へのストレスと同様に余分なコストもかかる。さらに、懸架されたワイヤーケージは、虫...

ティックは、脊椎動物の必須の赤血球性外部寄生虫であり、世界中に分布している。米国では、少なくとも11種のダニは公衆衛生上重要な病原菌のベクターである1 。 Ixodes肩甲介は、ライム病（ Borrelia burgdorferi ）再発熱（ B. miyamotoi）、ヒト顆粒球アナプラズマ症（ Anaplasma phagocytophilum ）、およびバベシア症（Babesia spp。）の原因物質のようないくつかの病原体の伝達に関与する。疾病ベクターとしての肩甲介の重要性にもかかわらず、研究室での研究のためにこれらのクモ形類を野生から豊富に収集することは、必ずしも実現可能ではない。したがって、健全な実験室で飼育されたダニの生産は、ダニ生物学およびダニ病原体の相互作用に関する研究にとって不可欠である。 I. scapularisを含むすべての硬ダニ（Ixodidae科）の生活環は、卵と3つの活性成分eステージ：幼虫、ニンフ、および成体。各活性段階は、脊椎動物の宿主に供給される。付着と摂食の数日にわたってダニとその宿主との間で起こる複雑な相互作用は人工フィーダーを用いて複製することはほとんど不可能であり、大量飼育のために十分な数の飼養されたダニを提供する可能性は低い2、3、4 。したがって、生きたマウスおよびウサギは、未成熟（幼虫および幼虫）およびダニの成熟段階（成虫）をそれぞれ飼育するための宿主として最も頻繁に使用される。各発達段階の間に複数の宿主が血液供給のために必要であるため、ダニの飼育が複雑になり、時間とコストが掛かる5,6,7。ほとんどのダニ飼育プロトコルでは、マウスを吊り下げられたワイヤーグリッドの床ケージ7,8または円筒状のカード動物は自由に移動し、それ自体6、9、10をグルーミングすることができないような寸法のGE。 これらの円筒形のケージは、後のワイヤグリッドで靴箱ケージに転送されます。充血し、剥離ダニは、次いで下水から収集されます。しかし、連邦準備制度を露光におけるこの方法の結果は、真菌の増殖を増加させ、死亡率9をチェックすることができ、尿及び糞便で汚染された水ティック。また、ダニ水トラフから脱出、ならびにマウスにストレスを引き起こす可能性が高くなります。これらの問題を回避するために、我々はここではプラスチック製の靴箱型の使い捨てケージ内でマウスの幼虫ダニの摂食を示しています。この方法は、マウスの正常な動作を可能に充血ダニ回復を増加し、汚染によるダニの死亡率を減少させます。

<table><tbody><tr><td>Puralube獣医軟膏</td><td>アマゾン</td><td></td><td>ペットショップやオンラインストアから入手可能</td></tr><tr><td>使い捨てマウスケージ</td><td>&nbsp;Innovive, San Diego, CA&nbsp;</td><td>MV 2</td><td>底面と蓋のセット</td></tr><tr><td>ホワイト アルファ ドライ寝具&nbsp;</td><td>ラボサプライ、テキサス州フォートワー</td>ス<td>&nbsp;アルファ-Dri&trade;</td><td></td></tr></tbody></table>

飼育<em&gt; ixodes肩甲骨、</em&gt;ブラック・ティック・ティック：未熟期をマウスに与える

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

マダニのscapularis、ライム病のベクトルは、東部と中西部米国で最も重要な病気のベクトルのうちの1つです。この種は、各開発段階のための脊椎動物宿主からの血液の食事を必要とする3つのホストダニで、成人女性は、再生のための血液の食事を必要とします。給餌のための5日間、完全に充血したときにホストを降ろし - 幼虫は3のために自分のホストに接続ティック。いくつかの異なるホスト上のこの依存性や充血のための長い添付ファイルの時間は、実験室の設定で飼育ダニを複雑にします。しかし、生物学をダニやダニ - 病原体相互作用を理解するために、健康、研究室飼育の生産が不可欠であるダニ。ここでは、マウスを餌未熟ダニのための簡単な、費用対効果の高いプロトコルを示しています。我々は、マウスで減少し、ストレスのための既存のプロトコルを変更し、ダニのwiの接触を避けるために、メッシュボトムなし使い捨てケージを使用して、成功と生存を供給増加ダニマウスの尿や糞で汚染された水。

我々は、改善された給電効率を既存のダニ飼育プロトコル6、10を変更し、マウス宿主へのストレスを低減します。結果は、標準的なシューボックススタイルのマウスのケージは、ダニの飼育に適していることを示しています。白い寝具は、供給されたダニの容易な収集のための良好なコントラストを提供します。ほとんどのダニは、給餌後、容器の壁を登っおよび収集することが容易でした。また、（日常UNRでハウジングマウス用）、使い捨てプラスチックの箱の緊密な嵌合蓋は、ボックスからの脱出をチェック防ぎます。さらに、当社は、ダニの侵入（ 図1）のためのマウスを剃るませんでした。公表されたプロトコルにおけるこれらの変化は重要なダニの添付ファイル、充血、および生存しました。 それは、これらのalreadの外に特別なマウスのケージを必要としない...

健康的な実験室飼育の生産は、ダニの生物学の研究、およびダニ病原体相互作用に不可欠であるダニ。ここでは、費用対効果およびマウスにストレスの少ないです未熟ダニ供給のための単純なプロトコルを示しています。

飼育<em&gt; Ixodes肩甲骨、</em&gt;ブラック・ティック・ティック：未熟期をマウスに与える

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

このマダニ吸血プロトコルの全体的な目的は、齧歯類宿主へのストレスを軽減しつつ、吸血後のマダニの生存率を高めることで、既存の基準を改善することです。この手法は、マダニコロニーの飼育を簡素化するだけでなく、1日の採取日で多数の吸血後マダニを収集するより容易な方法を提供し、これはマクロ生物学分野における重要な生物学的疑問を解決するために不可欠です。本手法の主な利点は、マダニがマウスの排泄物を含む水にさらされないため、マダニの死亡率を低減できることです。さらに、ダニを1日で回収することで、マウスへのストレスを軽減できます。計数用にダニのバイアルを保管する場合、脱出を最小限に抑える容器を作成してください。プラスチック容器の上端の縁に沿って、すべてに両面テープを貼ります。次に、容器に約2 cmの水を満たします。続いて、別の小型ボックスまたはシャーレを容器の中央に配置し、そこに約1 cmの水を入れて、沈んで固定されるようにします。このボックスまたはシャーレの中に、ダニの幼虫または若虫が入ったバイアルを保管します。感染させるためのダニを計数するには、顕微鏡と細い絵筆を用いて、バイアルから幼虫または若虫を取り出します。幼虫50匹、または若虫25匹をシンチレーションバイアルに移します。バイアルがいっぱいになったら、すぐにナイロンメッシュまたはオーガンジー布のスクリーンで蓋をし、きついゴムバンドで固定します。ダニに寄生されたマウスを収容するための専用の部屋を指定してください。ダニが誤って脱出するのを防ぐため、部屋の外側に粘着マットまたは両面カーペットテープを設置し、部屋のドアの内側にも別のマットを設置します。まず、マウスの近くにダニを扱うためのエリアを準備します。白または淡色のワークベンチを使用します。ベンチ上の作業エリアの周囲に両面テープで縁取りをします。次に、マウスをイソフルランで麻酔させます。準備が整ったら、マウスをペーパータオルを敷いたヒートパッドに移し、イソフルランを継続的に投与するためにノーズコーンを装着します。足指へのピンチテストにより麻酔深度を確認してください。呼吸パターンに基づいて麻酔量を調整します。1分間に80回から230回の呼吸が正常です。呼吸が遅い場合は、イソフルランの量を減らしてください。また、眼には白色ワセリンベースの眼軟膏を塗布します。次に、50匹の幼虫または25匹の若虫が入ったバイアルを1本用意し、絵筆を用いてマダニをマウスに移します。マダニは、頭部の耳の間の被毛の下に配置してください。最後のマダニを配置した後、マウスがマダニを取り除こうとする前に付着させることができるよう、20分間麻酔状態を維持します。20分後、ダニの視認性を高めるために、白い敷材を敷いた新しいホームケージにマウスを戻します。いくつかの玩具を入れ、水と餌を自由に取り出せるようにしてください。蓋が密閉できる使い捨てボックスを使用してください。次に、壁の内側上端に両面テープを貼った、より大きなラット用またはゲルビル用ケージの中にホームケージを配置します。その後、ケージ間の隙間に約3 cmの水を満たします。未成熟のダニは、3〜6日間の吸血後に脱落します。3日目以降、ケージ内および周囲の水に、吸血して膨張したマダニがいないか毎日確認します。脱落したマダニを絵筆または柔らかいピンセットで回収し、ゴムバンドで固定したナイロンメッシュ布のキャップ付きの清潔なシンチレーションバイアルに移します。7日目に、前述と同様にマウスを麻酔し、付着したままのマダニがいないか確認します。また、敷材、餌容器、および水を徹底的に確認してください。その後、マウスを安楽死させ、使い捨てケージ、敷材、水ボトル、および餌容器をオートクレーブで滅菌し、残っているダニをすべて除去します。吸血し膨満したダニは、制御されたインキュベーター内で飼育してください。12～18週以内に、マダニが脱皮します。少なくとも週に1回は、顕微鏡下でマダニにカビが発生していないか確認してください。カビが検出された場合は、生存しているマダニを70% ethanolで5分間洗浄してください。次に、生存した個体を水で洗浄し、ろ紙に移して乾燥させます。洗浄および乾燥後、ダニを新しい清潔なバイアルに移し、ライフサイクルを継続させます。ほとんどのダニは吸血後、容器の壁を登ったため、容易に回収することができました。ダニがマウスケージから脱出することは稀でした。白い床材は、吸血したダニを検出するための良好なコントラストとなりました。回収期間中、ほとんどのダニは4日目までに離脱しました。数匹のマウスは5日目まで脱落せず、7日目までには、どのマウスにもダニは付着していませんでした。ダニの約2/3が、吸血して飽食状態に達するまで付着することができました。マウスはすべて健康な状態を維持し、不快感の兆候は見られませんでした。この方法を習得すれば、1日の採集で数百匹の吸血済みのマダニを確保することが可能です。この手順を実施する際は、マダニの不慮の寄生を防ぐため、必ず完全な個人用保護具（PPE）を着用してください。

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Immunology and Infection

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