垂直化学的酸素勾配の下で細胞移動研究のためのポリジメチルシロキサン - ポリカーボネートマイクロ流体デバイス

この実験の全体的な目標は、垂直な化学的勾配と酸素勾配のさまざまな組み合わせの下で、哺乳類細胞の移動に対するポリジメチルシロキサン-ポリカーボネートマイクロ流体デバイスを確立することです。この方法は、さまざまな種類の細胞やote遺伝子を持つ細胞の遊走に対するこれらの勾配の影響など、哺乳類の細胞遊走研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、従来のインキュベーターで実験セットアップ全体を実施でき、面倒なセットアップやかさばる装置を必要とせずに、最適な細胞培養条件を実現できることです。

この技術の意味は、マイクロ流体デバイスを使用して細胞の運動性とさまざまな生理学的に関連する勾配を特徴付けることができるため、がん細胞転移能力の診断にまで及びます。この方法は、哺乳類細胞の遊走に関する洞察を提供します。また、薬物濃度と酸素濃度の組み合わせに関するin vitro細胞ベースの薬物試験など、他の細胞研究にも適用できます。

2グラムのポリジメチルシロキサン、またはPDMSプレポリマーを最上層の流体チャネルパターンで金型に移し、PDMSの薄層を作ります。次に、金型をデシケーターセットアップに置き、PDMSを60分間脱気します。脱気後、金型を摂氏60度のオーブンに一晩置いてPDMS硬化させます。

金型が水平面にあることを確認してください。金型を室温まで冷却した後、さらに13グラムのPDMSプレポリマーを金型に注ぎ、デシケーターセットアップでPDMSを60分間脱気します。厚さ1mmのポリカーボネートまたはPCフィルムを、ガス拡散バリアとして新鮮なPDMS層にゆっくりと埋め込みます。

存在する気泡を排出します。次に、型を摂氏60度のオーブンに一晩置きます。金型が水平面上にあることを確認します。

硬化させたPDMSを室温まで冷却した後、メスでデバイスを約5.5×5平方センチメートルの領域に切断し、すべてのチャネルパターンをカバーできます。次に、PDMSラボを金型から取り出します。次に、直径2mmの生検パンチを使用して、入口と出口に穴を開けます。

製作した最上層PDMS-PCは、後で組み立てるために周囲のほこりから離して保管してください。デバイスを組み立てるには、まず、作製したPDMS-PCの最上層とスピンコードされたPDMSメンブレンを装着したウェーハを、ボンディング面を上にして酸素プラズマ表面処理装置にセットします。PDMS表面を90ワットの酸素プラズマで40秒間処理します。

酸素プラズマ表面処理の直後に、最上層をPDMSメンブレンに接着します。接着層の上に重りを置き、60°Cのオーブンに一晩入れて接着を促進します。接着層が室温まで冷えたら、最上層に接着した膜をメスで約5.5×5平方センチメートルの領域に切断します。

シリコンウェーハから結合構造を剥がし、直径2mmの生検パンチを使用して化学勾配チャネルの入口と出口に穴を開けます。次に、膜結合した最上層と作製したPDMS最下層を酸素プラズマ表面処理装置に、接着面を上にして配置します。PDMSサーフェスをアクティブにするには、90ワットのプラズマを40秒間使用します。

表面処理の直後に上層と下層を一緒に取り付けて接着します。接着されたデバイス全体の上にウェイトを置き、摂氏60度のオーブンに一晩置きます。翌日、製造したデバイス全体をオーブンから取り出し、室温まで冷却します。

マイクロ流体細胞遊走アッセイは、テキストプロトコルに記載されているように、デバイス内で細胞を調製することにより開始します。2日目に、ゼロ日目から培養した細胞から培地を吸引し、細胞を5ミリリットルのDPBSで2回洗浄します。DPBSを吸引し、2ミリリットルのトリプシンEDTAを加え、インキュベーター内で細胞を5分間インキュベートして、フラスコ表面から細胞を分離します。

細胞を分離して溶液に懸濁したら、8ミリリットルの無血清培地をフラスコに加えます。すべての液体を15ミリリットルのコニカルチューブに移し、Gの140倍で室温で5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、適切な量の無血清培地を添加して、最終細胞密度が1ミリリットルあたり100万細胞になるようにします。

次に、テキストプロトコルに記載されているように、初日に準備したマイクロ流体デバイスを取り出します。鈍い14ゲージの針を備えた1ミリリットルのシリンジを使用して、化学勾配チャネルの出口から無血清培地を注入し、培地が入口で両方の針から流出するまで注入します。次に、化学勾配チャネルの出口から200マイクロリットルの細胞懸濁液を注入します。

装置内の細胞培養チャンバーを顕微鏡で観察し、細胞がマイクロ流体チャネルに導入されたことを確認します。その後、デバイスを湿った容器に入れ、細胞培養インキュベーターに5時間保管して、デバイス表面への細胞の接着を促進します。その間、無血清培地で所望の濃度で化学物質を調製します。

化学物質の有無にかかわらず、無血清培地を高純度チューブに接続された2つの別々の3ミリリットルシリンジに引き込みます。次に、後で使用するために、1分あたり1マイクロリットルの流量でシリンジポンプにシリンジをセットアップします。次に、1モルの水酸化ナトリウム溶液を15ミリリットルと、ピロガロール溶液1ミリリットルあたり200ミリグラムの15ミリリットルを作ります。

水酸化ナトリウム溶液を高純度PFTEチューブに接続された15ミリリットルシリンジに引き込み、ピロガロール溶液を高純度チューブに接続された15ミリリットルシリンジに引き込みます。シリンジをシリンジポンプにセットし、流量は毎分 5 マイクロリットルで、後で使用します。5時間のインキュベーション後、装置全体を取り出し、直径15cmのシャーレに置きます。

接着パテを使用してデバイスをペトリ皿に固定し、次にペトリ皿をインキュベーター内の生細胞イメージング顕微鏡に移します。シリンジからのチューブを化学勾配チャネルの入口に接続して、化学勾配を生成します。次に、出口を廃棄物リザーバーにつながるチューブに接続します。

化学勾配生成を行います。次に、塩化ナトリウムとピロガロールを含むシリンジからの高純度チューブを酸素勾配チャネルの入口に接続します。チューブを出口に接続して廃棄物を収集し、シリンジでシリンジポンプをオンにして酸素勾配を生成します。

ペトリ皿に約15ミリリットルの二重蒸留水を加えて、デバイスの保湿を維持します。次に、タイムラプス画像キャプチャ用に生細胞イメージング顕微鏡をセットアップし、15分ごとに画像を撮影します。データ収集と分析、およびテキストプロトコルに記載されている勾配の特性評価を実行します。

ここに示されているのは、細胞遊走のためにマイクロ流体デバイス内で生成された化学的勾配の代表的な結果です。数値シミュレーションの結果は、フルオレセイン溶液を化学物質として使用した実験的特性評価とよく一致しています。また、ケモカインSDF-1 alphaなどの他の化学物質の勾配も、シミュレーションを使用して事前に推定することができます。

デバイス内で生成された酸素勾配は、酸素感受性蛍光色素を使用して実験的に特徴付けることができます。通常、上流の1%から下流の16%までの酸素勾配をデバイス内で安定して確立できます。ここに示されているのは、ライブセルイメージング顕微鏡を使用した実験中に収集された典型的なタイムラプス画像です。

画像解析後、A549細胞の移動軌跡とその平均移動を計算できます。勾配がない場合、セルはランダムな移動を示し、平均移動はゼロに近くなります。SDF-1αケモカイン勾配のみでは、細胞は走化性挙動を示し、予想通り高ケモカイン勾配方向に移動します。

酸素勾配のみでは、細胞は低酸素方向に移動し、哺乳類細胞では十分に研究されていない飛行能力の振る舞いを示します。興味深いことに、ケモカイン勾配と酸素勾配の両方で、細胞は低酸素勾配に向かって移動し、酸素勾配が支配的な効果を持つことを示しています。この観察にはさらなる研究が必要です。

この手順を試行する際には、製造中にデバイスを十分に水平にし、細胞移動実験中にマイクロ流体デバイスのセットアップ内の気泡を排除することを忘れないでください。このビデオを見れば、PDMS-PCマイクロ流体デバイスの準備方法と、化学的勾配と酸素勾配の組み合わせ下での哺乳類細胞の移動を研究するための実験のセットアップ方法について十分に理解できるはずです。