垂直化学的酸素勾配の下で細胞移動研究のためのポリジメチルシロキサン - ポリカーボネートマイクロ流体デバイス

この実験の目的は、さまざまな垂直方向の化学物質および酸素濃度の勾配の組み合わせの下で、哺乳類細胞の遊走を観察するためのポリジメチルシロキサン-ポリカーボネート製マイクロ流体デバイスを構築することです。この手法は、これらの勾配が異なる種類の細胞や、特定の遺伝子を持つ細胞の遊走に及ぼす影響など、哺乳類細胞の遊走研究における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、煩雑な設定や大型の装置を必要とせず、実験セットアップ全体を一般的なインキュベーター内で行うことができ、最適な細胞培養条件を維持できることです。

この技術の意義は、マイクロ流体デバイスを用いて細胞の運動能およびさまざまな生理学的関連勾配を特性評価できるため、がん細胞の転移能の診断へと広がります。本手法は、哺乳類細胞の遊走に関する知見を提供することが可能です。また、薬剤濃度と酸素分圧の組み合わせによるin vitroの細胞ベースの薬剤試験など、他の細胞研究にも応用できます。

最上層に流路パターンがあるモールドに、2 gのポリジメチルシロキサン（PDMSプリポリマー）を移し、PDMSの薄い層を作製します。次に、モールドをデシケーターにセットし、PDMSを60分間脱泡します。脱泡後、モールドを60 °Cのオーブンに入れ、一晩かけてPDMSを硬化させます。

金型が水平面にあることを確認してください。金型を室温まで冷却した後、さらに 13 grams の PDMS プレポリマーを金型に注ぎ、デシケーター装置内で 60 minutes 間、PDMS の脱気を行います。ガス拡散バリアとして、厚さ 1 mm のポリカーボネート（PCフィルム）を新鮮な PDMS 層にゆっくりと埋め込みます。

気泡がある場合はすべて取り除きます。その後、モールドを60°Cのオーブンに入れ、一晩静置します。この際、モールドが水平な面に置かれていることを確認してください。

硬化させたPDMSを室温まで冷却した後、すべてのチャネルパターンをカバーできる約5.5 × 5 cm²の領域までメスで切り出します。次に、PDMSスラブをモールドから剥がします。続いて、直径2 mmのバイオプシーパンチを用いて、入口と出口の穴を開けます。

作製したPDMS-PC上層は、後の組み立てに備え、周囲のホコリが入らないように保管します。デバイスを組み立てるには、まず、作製したPDMS-PC上層と、スピンコートでPDMS膜を形成したウェハーを、接合面を上にして酸素プラズマ表面処理装置に入れます。PDMS表面を90 Wの酸素プラズマで40秒間処理します。

酸素プラズマ表面処理の直後に、上層をPDMSメンブレンに接合させます。接合した層の上に重りを置き、接合を促進するために60°Cのオーブンに一晩入れます。接合した層が室温まで冷却されたら、上層に接合されたメンブレンをメスで約5.5×5 cm²の領域に切り出します。

シリコンウェハーから接合構造を剥離し、直径2 mmのバイオプシーパンチを用いて化学勾配チャネルの入口と出口に穴を開けます。次に、膜接合した上層と作製済みのPDMS下層を、接合面を上にして酸素プラズマ表面処理装置に入れます。PDMS表面を活性化させるため、90 Wのプラズマで40秒間処理します。

表面処理の直後に、ボンディングのため上層と下層を接合させます。ボンディングしたデバイス全体の上に重りを置き、60°Cのオーブン内で一晩放置します。翌日、作製したデバイス全体をオーブンから取り出し、室温まで冷却します。

テキストプロトコルに記載されている通り、デバイス内での細胞調製を行い、マイクロ流体細胞遊走アッセイを開始します。2日目には、0日目から培養した細胞から培地を吸引し、5 mLのDPBSで2回細胞を洗浄します。DPBSを吸引し、2 mLのTrypsin-EDTAを添加した後、インキュベーター内で5分間インキュベートして、細胞をフラスコ表面から剥離させます。

細胞が剥離し溶液中に懸濁したら、フラスコに無血清培地を8 mL加えます。すべての液体を15 mLコニカルチューブに移し、室温で140 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引し、最終細胞密度が1 × 10⁶ cells/mLになるように適切な量の無血清培地を加えます。

次に、テキストプロトコルに記載されている通り、1日目に準備したマイクロ流体デバイスを取り出します。1 mLシリンジに14ゲージの鈍針を取り付け、化学濃度勾配チャネルの出口から無血清培地を注入し、入口側の両方の針から培地が流出するまで行います。その後、化学濃度勾配チャネルの出口から細胞懸濁液 200 µLを注入します。

顕微鏡下でデバイス内の細胞培養チャンバーを観察し、細胞がマイクロ流路に導入されたことを確認します。その後、デバイスを加湿容器に入れ、細胞培養インキュベーター内で5時間保持し、デバイス表面への細胞の接着を促進させます。その間に、無血清培地を用いて、目的の濃度の化学物質を調製します。

化学物質を含む無血清培地と含まない無血清培地を、高純度チューブに接続された2本の3 mLシリンジにそれぞれ分注します。次に、これらのシリンジをシリンジポンプにセットし、後で使用するために流速を1 µL/minに設定します。続いて、1 M 水酸化ナトリウム溶液を15 mLと、200 mg/mL ピロガロール溶液を15 mL調製します。

水酸化ナトリウム溶液を、高純度PTFEチューブに接続した15 mLシリンジに吸い込み、ピロガロール溶液を高純度チューブに接続した15 mLシリンジに吸い込みます。これらのシリンジをシリンジポンプにセットし、後で使用するために流速を5 µL/minに設定します。5時間のインキュベーション後、デバイス全体を取り出し、直径15 cmのシャーレに置きます。

粘着プティを使用してデバイスをペトリ皿に固定し、ペトリ皿をインキュベーター内の生細胞イメージング顕微鏡に移します。化学勾配を形成するため、シリンジからのチューブを化学勾配チャネルの入口に接続します。次に、出口を廃棄リザーバーへつながるチューブに接続します。

化学勾配生成用のシリンジを装着したシリンジポンプの電源を入れます。次に、塩化ナトリウムとピロガロールを含むシリンジからの高純度チューブを、酸素勾配チャネルの入口に接続します。廃液を回収するためにチューブを出口に接続し、酸素勾配生成用のシリンジを装着したシリンジポンプの電源を入れます。

デバイスの保湿を維持するため、ペトリ皿に二重蒸留水を約15 milliliters加えます。次に、タイムラプス画像キャプチャ用に生細胞イメージング顕微鏡をセットアップし、15分ごとに画像を撮影します。テキストプロトコルに記載されている通りに、データの収集と解析、および勾配の特性評価を行います。

ここでは、細胞遊走用にマイクロ流体デバイス内で生成された化学物質濃度勾配の代表的な結果を示します。数値シミュレーションの結果は、化学物質としてフルオレセイン溶液を用いた実験的特性評価とよく一致しています。ケモカインSDF-1 alphaなどの他の化学物質の勾配についても、シミュレーションを用いて事前に推定することが可能です。

デバイス内で生成される酸素勾配は、酸素感受性蛍光色素を用いて実験的に評価することができます。通常、デバイス内では上流の1%から下流の16%までの酸素勾配を安定して構築することが可能です。ここでは、ライブセルイメージング顕微鏡を用いて実験中に収集した代表的なタイムラプス画像を示します。

画像解析後、A549細胞の遊走軌跡とその平均移動量を算出することができます。勾配がない条件下では、細胞はランダムな遊走を示し、平均移動量はゼロに近くなります。SDF-1 αケモカイン勾配のみが存在する場合、細胞は走化性挙動を示し、予想通りにケモカイン濃度が高い方向へ遊走します。

酸素勾配のみが存在する場合、細胞は低酸素方向へ移動し、哺乳類細胞では十分に研究されていなかったエアロタクシス（酸素走性）挙動を示します。興味深いことに、ケモカイン勾配と酸素勾配の両方が存在する場合、細胞は低酸素勾配に向かって移動し、酸素勾配が支配的な影響を持つことが示されました。この観察結果については、さらなる研究が必要です。

この手順を行う際は、作製時にデバイスを十分に水平にし、細胞遊走実験中のマイクロ流体デバイスのセットアップにおいて気泡を完全に除去することが重要です。このビデオを視聴することで、PDMS-PCマイクロ流体デバイスの作製方法と、化学勾配および酸素勾配の組み合わせ条件下での哺乳類細胞の遊走を研究するための実験セットアップについて、十分な理解を得ることができます。