Name: 個々のコロニーレベルにミツバチ開発に関する環境化学物質の影響を評価します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 学ぶミツバチの個体とコロニーへの農薬残留影響評価法。生体内給餌で生態毒性を調査し、環境化学物質の生態系影響を明らかにする。

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この研究は、動物の局と植物衛生検査検疫、農業委員会、行政院とグラント103から2313-B-197から002-MY3から省からの助成金105AS-13.2.3-BQ-B1によってサポートされていました科学技術（MOST）の。

1.準備<ol><li> 50％の砂糖シロップの1リットルを作ります。 1リットルのddH 2 Oに1kgのスクロースを溶解</li><li> BLDにおけるピリプロキシフェン（PPN）溶液を調製します。 10,000ppmのPPNストック溶液1.1 Lを作成し、4℃でのddH 2 Oストア滅菌1L中100mLのPPN溶液を希釈します。 </li><li>以下の実験のためにBLD 0.1、1、10及び100mg / kgの（PPM）の最終濃度にPPNストック溶液を希釈します。 </li><li> （コロニーレベル用）PPN-シロップを作ります。以下の実験のために50％の砂糖シロップに10と100 ppmの最終濃度にPPNストックを希釈します。 </li><li>ミツバチ飼育。 注：ここでは、実験場所は国立宜蘭大学（NIU）養蜂場、李-LAN市、台湾です。 （GPS座標：N24.747278、E121.746200）。 <ol><li>ミツバチ（ ミツバチ L.）は食物量毎週コロニーをチェックして（蜂蜜記憶領域が空である）、必要に応じて1リットルの50％砂糖シロップとフィード。健康の定義通常産卵クイーン各コロニーにおけるミツバチコームの9つのフレームとしてコロニー。 </li></ol></li><li>基本的な幼虫の食（BLD）の100ミリリットルを準備します。滅菌蒸留脱イオン水（のddH 2 O）中の6％D-グルコース、6％フルクトース、および1％酵母抽出物を溶解し、50％ローヤルゼリーで補います。 4°Cで保管してくださいではなく、3日以上のため。 実験の前に35°Cまでの事前暖かく、3日以内に使用します。注意してください。 </li></ol> インビボ供給方法2. 注意： インビボでの供給方法は、ハンリーらから変更されています。 20 <ol><li> ミツバチの幼虫の選択とラベリング。 <ol><li> 4フレーム区間に女王を制限しながら4つのフレームと5つのフレームに健康なコロニーの9つのフレームを分割するクイーン圧排を挿入します。産卵するための4フレーム区間内の少なくとも1つの空のフレームを残します。 </li><li>女王は1日の卵を産卵した後、、卵の外観のためのフレームをチェックし、1日齢幼虫が孵化するまで72時間（4 日目 ）のためのハチの巣の内部に卵を保ちます。手で試験ハイブから（24時間以内に斜線）1日齢ワーカー幼虫を含むフレームのうちの1つを取り、蜂ブラシ付きフレームからミツバチの労働者を削除します。 </li><li>透明スライド（サイズ=縦×横×厚さ= 29.7ミリメートル×21ミリメートル×0.1ミリメートル）でフレームをカバーし、画鋲（ 図1A）とフレームのエッジに透明スライドを爪。 </li><li>各治療のために、ランダムに50一日齢の幼虫（4 日目 ）を選択し、透明スライド上に油性マジックペンを使用して、各ひな細胞をマークする（ 図1Aおよび1B）。 注：異なる処理の間での混乱を避けるために、恒久的なマーカーペンを使用することにより、同様のフレームと透明スライド上の各処理の情報を書き込みます。マークされたスライドを削除し、in vivoでのために保ちます&lt;/ em&gt;の給餌と観察。 </li></ol></li><li> 生体内給餌で 。 <ol><li>の摂取量に応じて、それぞれ10μL、10μL、20μL、一日1,2および3にピペッティングすることによって、各標識ひなセルにPPN-BLD（0.1、1、10及び100 PPM）の異なる濃度を追加幼虫時代。対照群にはBLD（無PPN）の同量を追加します。これにより、各標識ひなセルにおけるPPN-BLDの総用量は、4、40、400、4000 PGに蓄積します。 注：マーク透明スライドによって標識ひな細胞を認識し、給餌後にマーク透明スライドを削除します。働きバチによってひな細胞の洗浄を防ぐために供給するための新鮮なBLDを使用してください。 </li><li>さらに観測の元植民地にPPN処理されたフレームを返します。 注：各処理は、4個のコロニーの4つの生物学的反復配列を持っています。 </li></ol></li><li> 7日目の治療の幼虫の観察。 <ol><li>目を観察するために、電子PPN処理した幼虫は、標識されたひな細胞に死亡し、キャッピング率を記録するためのフレームにラベルされた透明のスライドを返します。 </li></ol></li><li> 13日目での治療蛹および羽化率の観察。 <ol><li>頂いたひな細胞のミツロウを削除します。 </li><li>ひなセルに柔らかい先端がピンセットを入れて、クランプ蛹を非常にわずかにそっと蛹を取ります。 </li><li>各ウェルの下に実験室組織の二層を有する24ウェル組織培養プレートに蛹を転送します。蛹転送時の損傷や死亡率を記録します。 </li><li> （ 約 8日間）出現するまで、34℃、相対湿度70％のインキュベーターで24ウェル組織培養プレートを保ちます。 </li><li>観察し、蛹と登場ミツバチを記録。 </li></ol></li><li> 統計 <ol><li>記録したデータを計算し、平均値±SDとして存在</li><li> SAによって分散分析（ANOVA）を使用してデータを分析Sとは異なる治療法の二つの手段の違いを分析するために最小有意差（LSD）テストを使用します。 P -値&lt;0.05として統計的に有意で定義します。テーブルの同じ列における異なる文字は、統計分析によって有意な効果を示しました。 </li></ol></li></ol>ビーハイブでコロニーレベルでのPPNの3毒性<ol><li>ミツバチのグループを設定します。 <ol><li> 4フレーム区間に女王を制限しながら4つのフレーム（パートA）及び5つのフレーム（パートB）に健全なコロニーの9つのフレームを分割する垂直クイーン圧排を挿入します。産卵するための4フレーム部に少なくとも1つの空のフレームを残します。 注意：別の女王は、部品間を移動するから女王を防ぐために、女王の部分の上にエクスクルー置きます。 </li><li>女王は1日の卵を産卵した後、卵の出現のためのフレームをご確認ください。手でパートAから卵を含む適切なフレームを取り、ミツバチの労働者を削除します蜂ブラシでフレームから。 </li><li>透明スライドとフレームをカバーし、画鋲のフレームのエッジに透明スライドを爪。 </li><li>ランダムに卵を含む100個のひな細胞を選択し、透明スライド上の永久的なマーカーを使用して、各ひなセルをマーク。グループ1は、異なる処理間の混乱を避けるために、恒久的なマーカーを使用して、フレームと透明スライド上の各処理の情報を書くように、これら100個のひな細胞を割り当てます。 </li><li> 3日間パートAにラベルされたフレームを返し、その後、卵を産むためにパートBに女王を転送します。 </li><li> 1日後、パートBのフレームをチェックする1つの適切なフレームを選択し、ステップ3.1.4で説明したように卵を含む100個のひな細胞を標識します。グループ2としてこれらの100個のひな細胞を割り当てます。 </li><li> 3日間パートBへの標識フレームを返し、その後、卵を産むためにパートAに女王を転送します。 </li><li> 6回パートAとパートBとの間のクイーン交換を繰り返し、数値グループを割り当て、それぞれ（ 図2）。 9基の合計があるはずです。 </li></ol></li><li> 13日目にPPN糖シロップとT reatミツバチコロニー（ 図2）。 <ol><li> 1 Lの50％プラスチック蜂フィーダボックス10または100 ppm含有PPN糖シロップ（幅×長さ×H = 20センチメートルX 30センチメートル×3.5 cm）を追加し、実験コロニーにおけるフレームの上にボックスを置きます。 注意：ひな細胞が封入されているとして、グループ1は13日でPPNを受信しません。 </li><li>ステップ2.2で説明したように1 Lの50％砂糖シロップ（NO PPN）と対照群を供給する。 </li></ol></li><li> 5日目に、各グループの100個のラベルされたひな細胞の卵孵化率（ 図2）として1日齢幼虫やレコードをカウントします。ミツバチの卵は、通常、0日の幼虫に孵化するために3日かかります。そのため、チェックして、100個の卵を含む1日目にひなの細胞を標識し、孵化率の割合を得るために、5日目に、各グループのために1日齢幼虫の数を数えます。 </li><li> C11日目に各群の100個の標識ひな細胞の割合をキャッピング幼虫（ 図2）のようにキャップされたひな細胞およびレコードをount。 6〜7日齢の幼生ひな細胞は幼虫pupatingのためのミツバチの労働者によってミツロウでキャップされます。 </li><li>蛹の成熟を観察した（ 図2）、17日目に各群の100個の標識ひな細胞の羽化率を記録します。 <ol><li>頂いたひな細胞のミツロウを外し、優しく柔らかな先端ピンセットで蛹を取り出します。各ウェルの下に実験室組織の二層を有する24ウェル組織培養プレートに蛹を転送します。 </li><li>出現するまで34℃、70％RHのインキュベーター中で24ウェル組織培養プレートを保ちます。 </li><li>観察し、記録蛹をし、グループ9（49実験日）まで、各グループのミツバチが登場。 注意：各処理は4つの生物学的反復配列を持っています。 </li></ol></li><li>統計<ol><li>記録したデータを計算し、平均値として存在します±SD。 </li><li>スチューデントの両側tの検定を用いて、各グループの治療のペア間の有意差（ 例えば 、0 PPM / 10ppmで、10 PPM / 100ppmの0 PPM / 100 ppm）を分析します。 P -値&lt;0.05かのように、統計的に有意で定義します。 </li></ol></li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

クイーン制限産卵法、クイーン交換方法は、このプロトコル内のフィールドテストのためのミツバチのグループを設定するための重要なステップです。クイーン制限産卵方法はミツバチのライフサイクルの同期が可能になります。その結果、研究者は、農薬の異なる用量での治療のための同じ年齢の1日齢幼虫を選択することができます。クイーン交換法のために、女王は、農薬及び農薬残留物の影響を評価するために、フィールドテストのためのミツバチの異なる発達段階を取得するためにパートA（4つのフレーム）とB（5つのフレーム）との間で交換しました。また、選択されたひな細胞の多数は、標識用透明スライドを使用してフィールドテストで記録しました。しかし、過剰産卵は時折卵を産む女王には不十分ひな細胞になります。したがって、空のフレームの準備には、クイーン交換法のために必要とされます。あるいは、クイーン限定産卵方法でも使用することができます蜂の巣でのテストのために異なるミツバチグループを準備します。パートA（2つのフレーム）におけるB部と女王の配置におけるA部における2つのフレームと7つのフレームにフレームの分離は、2つのフレーム内の女王によって卵を制限することができます。 <p...

環境中の農薬の存在が影響ミツバチ1、2、3の人生で最も深刻な問題の一つです。いくつかの研究は、ミツバチのコロニーとミツバチ製品中の残留農薬の一般的な存在を証明しています。台湾では、農薬の平均的なアプリケーションは、（2005年から2013年まで）キログラム/ヘクタール、毎年11〜12でした。台湾で使用される農薬の量は、EU諸国のそれよりも高く、そしてラテンアメリカ諸国4、5です。言い換えれば、養蜂環境は、特に台湾では、おそらく他の国では、深刻な農薬ストレスを受けています。 ミツバチミツバチは農業システム6の主要な花粉媒介の一つであり、それはまた、蜂蜜などの貴重な製品を生産しています。しかし、ミツバチは、博覧会です様々な農薬やこれらの農薬へのedは蜜や花粉7、8を収集する際に農薬を噴霧してきた花で採餌した後、ハチの巣に戻すことができます。彼らはまた、自身がじんましん9、10、11内部の害虫問題を制御することを目指し養蜂家によって農薬に暴露することができます。ミツバチの幼虫は、その開発のための看護師ミツバチによって供給されるので、幼虫、ドローンとも女王は、これらの農薬汚染ネクターと花粉12に露出されてもよいです。ミツバチへの各種殺虫剤の毒性は13を対処する必要があります。 多くの努力は、環境残留農薬の問題を評価するために行われています。 Yang ら。でミツバチの幼虫の開発に神経毒性殺虫剤イミダクロプリドの影響をテストしました蜂の巣はとイミダクロプリドのサブ致死量は成人の蜂14の嗅覚連想行動をもたらしたことを報告しました。また、アーラッカーら。実験室条件の下で15ミツバチの労働者の学習パフォーマンス上の有機リン系農薬、クロルピリホス、の亜致死影響を調べました。私たちの以前の研究では、幼虫のミツバチ16上（PPN）ピリプロキシフェン昆虫成長調節（IGR）の影響を、評価しました。 本稿では、ミツバチの開発に化学的影響を評価するための方法を提示します。ミツバチ供給方法が記載され、いずれかの個々のミツバチまたはコロニーに適用しました。最初に、我々は、in vivoでの個々のミツバチへの農薬の影響を評価するためにコロニーに幼虫に殺虫剤に汚染された基本的な幼虫の食（BLD）の異なる濃度をテストしました。私たちは、その後、自然コンディットをシミュレートするために進めハチの巣内農薬汚染シロップを使用することによって殺虫剤のイオン。この方法では、広く害虫17に対して使用され、ミツバチの幼虫および蛹16、18、19の発展に有害であるPPNは、フィールド内の農薬の負の効果を表す指標であろう。

<table><tbody><tr><td>ミツバチボックス</td><td>SAN-YI ハニーファクトリー</td><td>W1266</td><td>ミツバチ飼育</td></tr><tr><td>クイーンエクスクルーダー(フレーム間)</td><td>SAN-YI ハニーファクトリー</td><td>I1575</td><td>クイーン限定&nbsp;</td></tr><tr><td>クイーンエクスクルーダー(上部)</td><td>SAN-YI Honey Factory</td><td>I1566</td><td>クイーン制限上部&nbsp;</td></tr><tr><td>ビーブラシ</td><td>SAN-YIハニーファクトリー、台湾</td><td>W1414</td>フレーム<td>上のミツバチをやさしく掃除</td></tr>します<tr><td>ビーフィーダーSAN-YI</td><td>ハニーファクトリー、台湾</td><td>P0219</td>コロ<td>ニーに砂糖シロップを供給する</td></tr>透明な<tr><td>スライド</td><td>ワンシーチェイ、台湾(http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40)</td><td>1139</td>フレーム<td>の幼虫領域をマークします(材質:ポリエチレンテレフタレート、PET)(サイズ=長さ*幅*厚さ= 29.7 mm * 21 mm * 0.1 mm)</td></tr><tr><td>24ウェルティス培養プレート</td><td>広州ジェットバイオろ過有限公司</td><td>TCP011024</td><td>抽出オート</td></tr><tr><td>クレーブ</td><td>トーミン医療機器株式会社</td>からの蛹の飼育<td>TM-321</td>滅菌<td>蒸留脱イオン水(ddH2O)</td></tr><tr><td>P20ピペットマン</td><td>ギルソン</td><td>F123600</td><td>ミツバチの幼虫の餌プールにPPNを追加します</td></tr><tr><td>インキュベーター&nbsp;</td><td>Yihder Co., Ltd. (イーダー)</td><td>LE-550RD</td><td>抽出から蛹を育て</td></tr>る <tr><td>Kimwipes</td><td>COW LUNG INSTRUMENT CO., LTD</td><td></td> KCS34155 <td>抽出から蛹を育てる</td></tr><tr><td>ローヤルゼリー</td><td>国立宜蘭大学 (NIU)</td><td>NIU</td><td>基本的な幼虫食を作る (BLD)</td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>シグマ</td><td>G8270</td><td>基本的な幼虫の食事を作る (BLD)</td></tr><tr><td>D-(-)-フルクトース</td><td>シグマ</td><td>F0127</td><td>基本的な幼虫の食事を作る (BLD)</td></tr><tr><td>酵母抽出</td>物<td>CONDA、pronadisa</td><td>1702</td><td>基本的な幼虫食(BLD)を作る</td></tr> <tr><td>ショ糖</td><td>台湾砂糖協</td><td>E01071010</td><td>蜂食用砂糖シロップを作る</td></tr><tr><td>ピリプロキシフェン(11%)</td><td>LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD.</td><td>登録第1937号</td><td>実験に使用した昆虫成長調整剤(IGR)</td></tr></tbody></table>

個々のコロニーレベルにミツバチ開発に関する環境化学物質の影響を評価します

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

養蜂環境における農薬の存在は、ミツバチの生活に影響を与える最も深刻な問題の一つです。農薬は、ミツバチが農薬を散布した花を採餌した後、蜂の巣に戻すことができます。農薬に汚染された食品は、労働者間で交換され、その後、幼虫に餌を与えることができるため、ミツバチの発育に影響を与える可能性があります。したがって、環境中に残留する農薬は、ミツバチの個体数に慢性的な損害を与える要因となり、徐々にコロニーの崩壊につながる可能性があります。提示されたプロトコルでは、ミツバチの給餌方法が記載され、個々のミツバチまたはコロニーのいずれかに適用される。ここでは、害虫の防除に広く使用されており、ミツバチの幼虫や蛹の発育に有害な昆虫成長調整剤(IGR)ピリプロキシフェン(PPN)が農薬として使用されています。提示手順は、さらなる研究のために、他の潜在的に有害な化学物質またはミツバチ病原体に適用することができます。

ミツバチのフィールドテストのために、女王が産卵するための4フレーム部に限られていました。このステップは、1つのフレーム内ひな密度を増加させ、後続の観察を容易にすることができます。各処理は標識し、そしてミツバチの開発は明らかに透明スライドで観察しました。蜂の巣でミツバチの幼虫にPPN-BLDの生体送りで正確にコロニーにおけるミツバチの開発にPPNの影響を評価するために行きました。 インビボ給餌法を使用して蜂の巣に化学処理の影響の観察を容易にしました。 PPN-BLDの各用量について、50個のひな細胞の総数は、マークと処理しました。 PPN-BLDを添加した後、処理されたフレームは、自然条件下で観察するため、元のコロニーに戻しました。幼虫の段階のミツバチのPPN-BLDの負の効果は簡単だったOBSErved。用量依存的効果が観察されました。 表1は、10および100ppmの二高用量で幼...

ここで我々が提示 個々ミツバチと蜂の巣コロニーの両方に農薬汚染された食物を供給するための方法。手順は、基本的な幼虫の食事のとも蜂の巣コロニーの自然条件にin vivoで供給することにより、個々のミツバチへの農薬の影響を評価します。

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

この実験の全体的な目的は、環境中の農薬残留物が、養蜂箱のコロニーという自然条件下で個々のミツバチにどのような影響を与えるかを評価することです。この手法の主な利点は、注目している農薬やその他の汚染物質が、個々のミツバチとコロニー全体の双方に及ぼす影響を調査できる点にあります。蛹は非常に脆弱で取り扱いが困難であるため、この手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程学生であるKo Chong-Yuが行います。実験に先立ち、各コロニーに50%糖シロップを1リットル与えてください。餌の貯蔵庫は毎週補充してください。健康なコロニーは、9枚の巣枠と、産卵を行う1匹の女王蜂を有しています。まず、コロニー内で女王蜂の位置を確認し、女王蜂がいる側のフレームを少なくとも1枚、空のフレームに交換します。次に、女王除けを挿入し、少なくとも1枚の空フレームを含む4枚のフレームセクションに女王蜂を隔離します。翌日、フレームに産みたての卵がないか確認し、卵を女王蜂から離して72時間保持します。次に、これらの巣枠を取り出し、働き蜂を払い除けて、育児室内の幼虫への処理準備を行います。各処理につき、巣枠内でランダムに選出した1日齢の幼虫50匹を透明なスライドガラスで覆います。スライドガラスを画鋲で固定し、油性マジックでスライドガラスに識別情報を記入します。35 °Cに加温したBLDを用いて、0.1から100 ppmの範囲で異なる濃度のPPN処理溶液を各100 mLずつ調製します。その後3日間にわたり、 brood cell群を処理します。幼虫を処理するには、蓋を開け、各brood cellに10 µLのPPN BLD溶液を添加します。翌日に処理液を10 µL使用して処理を繰り返し、3日目には処理液を20 µL使用して再度処理を行います。3回目の処理後、コロニー内で育成させます。実験計画では、異なるコロニーを用いて各処理群を4回反復します。7日目にPPN処理した幼虫を検査し、処理群の死亡率と封蓋率を記録します。13日目に、各処理群の羽化率を記録します。まず、封鎖された幼虫房から蜜蝋を取り除きます。次に、先端の細いピンセットで蛹を非常に軽く挟み、優しく引き出して取り出します。蛹を取り出す際は、頭部と胸部の間を挟み、非常に慎重に取り出してください。実験を開始する前に、少なくとも90%の生存率を確保できるよう、何度も練習する必要があります。取り出した蛹を、実験用ティッシュを2層に敷いた24ウェル組織培養プレートに移します。移送中に発生した損傷や死亡率に注意して記録してください。羽化まで、培養プレートを34 degrees celsius、相対湿度70%に維持します。その後8日間にわたり、羽化率を記録してください。健康な9枚枠のコロニーを用い、女王蜂を少なくとも1枚の空枠を含む4枚枠のセクションに限定して、以前と同様に準備します。この4枚枠のセクションをパートA、5枚枠のセクションをパートBと呼びます。女王蜂がセクション間を移動できないよう、女王外隔格板でコロニーが完全に分けられていることを確認してください。この区分は、孵化後1日の幼虫をグループとして採取するために不可欠です。翌日、前述と同様に、産みたての卵が入った100個の育児室のグループにラベルを貼ります。これをグループ1とし、3日間パートAに戻します。その2日後、女王蜂をパートBに移して産卵させます。翌日、パートBにある産み立ての卵100個に「グループ2」とラベルを付け、そのセクションをコロニーのパートBに戻します。さらに2日後、女王蜂をパートAに戻します。この手順を繰り返し、別のグループを作成します。3日ごとに女王蜂をパートAとパートBの間で入れ替え、3日間隔で1日齢の卵からなる9つのグループが割り当てられるまでこれを継続します。発育の最初の5日間、ラベル付けされた各幼虫細胞グループの孵化率を記録します。11日間の発育後、各群の封蓋 brood cell の数を記録し始めます。実験13日目に、10 ppm または 100 ppm の PPN を含む 50% 糖液でコロニーを処理します。給餌器に 1 L の処理液を充填し、コロニーに接続します。グループ1は、それらの細胞が現在キャップされているはずであるため、未処理の対照群となります。17日目から、各グループの羽化率を記録してください。これを行うには、以前に示した方法で幼虫を24ウェルプレートに移し、プレートをインキュベートした後、羽化率を記録します。49日後、全9群の羽化データが得られます。個々の育児室は、PPN BLDを用いて上述の通り処理しました。ミツバチの幼虫期に対する殺虫剤の負の影響は容易に観察され、それらは投与量依存的でした。これらの影響には、メラニン化と翅の変形が含まれていました。環境中のPPN残留物による影響を受けているミツバチのコロニーをシミュレートするため、コロニー全体にPPNシロップを投与しました。グループ1は、処理前に成虫へと成長したミツバチであるため、対照群となります。第2群および第3群は幼虫期に、第4群から第9群は卵の状態で最初に処理を行った。PPN処理により、孵化率、キャップ形成、羽化、および奇形に変化が見られた。孵化率を除き、100 ppmのPPNは10 ppmよりも高い効果を示した。さらに、処理後、多くの蛹がキューティクルの黒色化、あるいは羽化不全により死亡しました。100 ppmのPPN処理では、封蓋されたセルが破壊され、損傷した蛹はコロニーから除去されました。習熟すれば、コロニーの処理手順は約1ヶ月で完了し、蛹の日常的な操作は約2時間で終えることができます。この手順を行う際は、コロニーの状態を定期的に確認し、実験を開始する前に蛹の取り扱いに十分に習熟しておくことが重要です。ミツバチの取り扱いは、蜂毒アレルギーにより危険を伴う可能性があることに留意してください。本手順の実施中は、保護服の着用などの予防措置を常に講じる必要があります。

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