生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

本手順の全般的な目的は、ゼブラフィッシュ胚とFRETベースのGEVIを用いて、非侵襲的な生理学的条件下における興奮性細胞の電気的特性を研究することです。本手法は、ニューロンなどの興奮性細胞の生物学に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。例えば、本手法を用いて、神経疾患の病態形成における興奮性の役割を分析することが可能です。

本手法では、FRETベースの遺伝子コード型電圧インジケーターを発現する透明なゼブラフィッシュ胚を利用します。このアプローチにより、生体内の細胞の電気的特性を非侵襲的に測定することが可能になります。したがって、本手法を用いることで、ゼブラフィッシュ胚における脊髄ニューロンの興奮性に関する知見を得ることができます。

また、本手法はイメージング解析が可能な他のin-vitroまたはin-vivo系にも適用できます。この手順を開始するには、Mermaidバイオセンサーのコーディング領域を増幅するためのPCR混合液を調製します。PCR混合液を95 °Cで15秒間加熱します。

50 °Cで15秒間プライミングし、72 °Cで4分間伸長させる工程を計35サイクル繰り返します。その後、市販のゲル精製キットを用いて、目的の平滑末端PCR産物をゲル精製します。次に、DNA断片をpCMV-SC平滑末端ベクターにクローニングし、HuCプロモーターを挿入するため、Mermaid陽性プラスミドを制限酵素SmaIで線状化します。

制限酵素反応を全量 20 µL で調製し、25 °C で 1 時間インキュベートします。その後、市販のゲル精製キットを用いて、消化したプラスミドをゲル精製します。次に、PFU DNA polymerase とゼブラフィッシュゲノム DNA をテンプレートとして、HuC プロモーターを PCR 増幅します。

PCR反応液を調製します。95 °Cで2分間の初期変性後、95 °Cで15秒間の加熱を行います。続いて50 °Cで15秒間のアニーリングを行い、72 °Cで4分間の伸長反応を行います。このサイクルを計35回繰り返します。

次に、特定の平滑末端PCR産物をゲル精製します。精製したpCMV-SC MermaidとpHuC DNAを等モル量ずつ、T4 DNA ligase 1 µLおよびSpecific 10x buffer 1 µLを用いて、最終容量10 µLでライゲーションします。その後、反応液を4 °Cで16時間インキュベートします。

コンピテントセルの分注量に、ライゲーション反応液5 µLをトランスフォーメーションさせる。CEL1-EcoRVによるダブルダイジェスチョンを行い、プロモーターが正しい方向で挿入されたpHuC陽性クローンを選択する。これらのクローンを15 mLチューブに移し、37 °Cで一晩インキュベートする。

その後、細胞からプラスミドを抽出し、CEL1-EcoRVによる二重制限酵素反応を行い、37 °Cで1時間インキュベートします。次に、反応液をアガロースゲルで電気泳動します。この手順では、野生型またはsod1G93R成体ゼブラフィッシュから得られた受精卵を10 mmのペトリ皿に移します。

胚を冷たい魚用水で洗浄します。その後、直ちに200 picogramsのpHuC-Mermaidプラスミドを卵黄にマイクロインジェクションします。次に、胚をシャーレに移し、以降の解析に必要となる目的の発達段階に達するまで、28 degrees Celsiusの魚用水中でインキュベートします。

自発的な尾部の巻き付き解析を行うために、胚を0.2% DMSOを含む魚用飼育水を満たした90 mmの円形ペトリ皿に移します。次に、先端の鋭いピンセット2本または針を用いて、手動で絨毛膜を除去します。その後、胚を28 °Cで5分間インキュベートします。

実体顕微鏡に装着したデジタルカメラを用い、1分間のビデオ録画を行い、室温での尾部の巻き付きを検出します。次に、30 fpsの時間分解能でタイムシリーズを取得します。その後、単位時間あたりの屈曲回数をカウントし、自発的な尾部巻き付きの頻度を算出します。

薬剤リルゾールの効果を評価するため、5 µMのリルゾールを含む魚用水を満たした新しい90 mmペトリ皿に胚を移します。その後、胚を28 °Cで5分間インキュベートし、1分間のビデオ録画を行い、行動解析を実施します。次に、20～24 hpfの胚を、37 °Cで魚用水を用いた1%低融点アガロース中で、35 mmガラス底イメージングディッシュ内にマウントします。

胚を横向きに配置し、アガロースが室温で凝固するまで待ちます。次に、イメージングディッシュを共焦点顕微鏡のステージに移動させます。488 nmのアルゴンレーザーでmonomeric Umikinoko-Greenを励起し、バイオセンサーを発現している運動ニューロンを特定します。

次に、エミッション（放出波長）を495〜525ナノメートルに設定し、記録ボタンを押します。FRET測定では、FRETペアのドナーであるmUKGを488ナノメートルのレーザーで励起させます。同時に2台の光電子増倍管を使用して、ドナーから放出される蛍光と、アクセプターであるmonomeric Kusibira-Orangeから放出される蛍光を検出します。

実験の開始時に、mUKG蛍光を記録する光電子増倍管1のゲインとオフセットを最適化し、セッション全体を通じてそれらを一定に保持してください。オフセットを設定するには、Qルックアップテーブルを使用して、画像の色を強度値に変更します。レーザーをオフにしてスキャンしながら、背景ピクセルの強度が0よりわずかに高くなるようにオフセットスライダーを調整してください。

同じルックアップテーブルを使用して、レーザーをオンにします。スキャンしながら、ゲインスライダーを使用して信号対雑音比（S/N比）を最大化させますが、ピクセルが飽和しないように注意してください。ソフトウェアの収集ウィンドウで、xyt収集モードを選択し、ドロップダウンメニューから512×64ピクセルのイメージフィールドサイズを選択します。

次に、胚の脊髄ニューロンの電圧変化の記録設定を行い、30ミリ秒ごとにXY平面を1枚、1分間取得します。同一ニューロンにおける膜脱分極に対するリルゾールの投与効果を評価するため、5 µMのリルゾールを含む魚用水を添加した5分後に、新しいデータセットを取得します。この動画では、尾の先端が頭部に達する全身収縮のみで構成される運動反応である自発的コイルリングを、通常の魚用培地を用いた20〜24 hpfの段階で記録しました。

この動画では、5 µMのリルゾールでインキュベートした後の胚における自発的なコイルリング（巻回運動）を示しています。リルゾールによって誘導された自発的コイルリング頻度の変化が、脊髄運動ニューロンの電気活動の変化に基づいているかどうかを検証するため、Mermaidバイオセンサーのドナー・アクセプターFRETペアの蛍光強度比を測定することにより、胚の脊髄運動ニューロンにおける膜電位を完全に非侵襲的な方法で解析しました。バイオセンサーを発現している一次脊髄運動ニューロンを特定し、その基底状態における自発的な脱分極活動を記録しました。

リルゾールの投与により、尾部のコイル状運動の頻度の減少とともに、自発的な脱分極イベントの頻度も減少しました。この手法を習得すれば、発達中の機能系における細胞間の相互作用の複雑さを完全に維持したまま、完全な胚の神経ネットワークの電気的特性を研究することが可能になります。このビデオを視聴することで、脊髄ニューロンの電気活動が自発的な尾部コイル状運動の頻度とどのように相関しているかについて、十分な理解が得られるはずです。