Name: 生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学ぶFRETベースの遺伝子電圧インジケーターを用いたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位の非侵襲的バイオセンシング法。神経興奮性と神経疾患の病態理解に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、FRETイメージング解析に対する彼女の貴重なサポートに対してSimona Rodighieroに感謝したいと思います。

1. pHuC_Mermaidプラスミドの生成注：マーメイドは、 Ciona intestinalisの電圧感知ドメイン（VSD）をペアにして開発されたバイオセンサーです FRETパートナーフルオロフォアUmi-Kinoko Green（mUKG：ドナー）およびオレンジ発光蛍光タンパク質Kusabira Orange（mKOk：アクセプター）の単量体バージョンを用いて、ホスファターゼ（Ci-VSP）を含むCiona robusta ） 5電圧センサー。このバイオセンサーでは、膜脱分極によって誘導されるVSDドメインの構造変化が、ドナーおよびアクセプター蛍光タンパク質の近接を増加させるため、それらの間のエネルギー移動を増加させる（FRET比を増加させる） 3 。 VSDは、原形質膜におけるバイオセンサーの効率的な局在を保証する。バイオセンサーの神経細胞の発現（脊髄において、シグナルは、介在ニューロンおよび運動ニューロンの両方において検出可能である）は、マーメイドオペレーションをクローニングすることによって達成されるゼブラフィッシュ汎 - 神経系プロモーターHuC 6の下で、フレームリーディングフレーム（ORF）にクローニングした。 <ol><li> 上流のSmaI制限酵素部位を挿入するために、T3ユニバーサルプライマーおよびマーメイドSmaIプライマー（5&#39;TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA）を用いて、Pfu（プルーフリーディング）DNAポリメラーゼを用いて、マーセイドORFをpCS4 +マーメイドプラスミド3からポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅する。マーメイドORFの <ol><li>以下のPCR混合物を使用する：0.5μLのPfu DNAポリメラーゼ、7.5μLの特定の10倍緩衝液、1μLの10mM dNTP、2.5μLのジメチルスルホキシド（DMSO）、0.5μL（50ng）のプラスミド調製物、および1 50μLの全容量中の各プライマーの20μMストック溶液μL。 </li><li> 95℃で15秒間PCR混合物を加熱し、50℃で15秒間プライミングし、72℃で4分間、合計35サイクル伸長する。 </li></ol></li><li>特定の鈍器をゲル精製するPCR産物を、市販のゲル精製キットを使用して、製造者のプロトコールに従って精製した。 </li><li>製造業者のプロトコールに従って、DNA断片をpCMV-SC平滑末端ベクターにクローニングする。 </li><li> HuCプロモーターの以下の挿入のために、マーメイド陽性プラスミド（pCMV-SC_Mermaidと名付けた）をSmaI制限酵素で線状化する。 <ol><li>以下のように制限反応を設定する： Sma I制限酵素0.5μL（10U）、キット10x緩衝液2μLおよびプラスミドDNA5μgを総容量20μLで加える。反応液を25℃で1時間インキュベートする。 </li></ol></li><li>製造業者のプロトコールに従い、市販のゲル精製キットを用いて消化したプラスミドをゲル精製する。 </li><li> 1対のHuC特異的プライマー（HuCprom-forw1_SalI：5&#39;-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCAおよびHuCpro）を用いて、鋳型としてPfu DNAポリメラーゼおよびゼブラフィッシュゲノムDNAを用いてHuCプロモーター（pHuC）をPCR増幅する。m-rev1：5&#39;-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG）およびATGの3,150bp上流領域にわたる。 <ol><li>以下のスキームを使用してPCR混合物をセットアップする：0.5μLのPfu DNAポリメラーゼ、7.5μLの特定の10倍緩衝液、1μLの10mM dNTP、2.5μLのDMSO、200ngのゲノムDNA、および1μLの20μM各プライマーのストック溶液を全量50μLで加える。 </li><li> 95℃で2分間の初期段階の後、95℃で15秒間PCR混合物を加熱し、50℃で15秒間プライミングし、72℃で4分間、合計35サイクル伸長する。 </li></ol></li><li>製造業者のプロトコールに従い、市販のゲル精製キットを用いて特異的な鈍化PCR産物をゲル精製する。 </li><li> 1μLのT4 DNAリガーゼおよび1μLの特定の10X緩衝液を用いて、等容積の精製したpCMV-SC_Mermaid（ステップ1.5）およびpHuC DNA（ステップ1.7）を総容量10μLでライゲーションする。反応を16時間インキュベートする。4℃。 </li><li>コンピテント細胞のアリコートを、ライゲーション反応（ステップ1.8）5μLで、製造者の指示に従って形質転換する。 </li><li> Sal I- Eco RV二重消化により適切な向きに挿入されたプロモーターを有するpHuC陽性クローン（pHuC_Mermaid）を選択する（ SalI制限部位は、ステップ1.6においてプロモーター断片の上流に挿入されているが、 Eco RV制限部位pCMV-SCプラスミドのポリアデニル化領域、ポリAの下流に位置する）。 <ol><li>以下のように制限反応を設定する： SalIおよびEco RV制限酵素0.5μL（10U）、キット10X緩衝液2μL、およびpHuC_Mermaid DNA1μgを総容量20μLで調製する。反応液を37℃で1時間インキュベートする。アガロースゲル上で反応を実行する。 </li></ol></li></ol> 2.胚マイクロインジェクション<ol><li>受精したものを移す野生型（AB株）またはSod1-G93R成人ゼブラフィッシュ4から得られたgsをプラスチックピペットを用いて10mmペトリ皿に移した。 </li><li>冷たい（4℃）魚の水で胚を洗い流し、マイクロインジェクターを用いて200μgのpHuC_Mermaidプラスミドで卵黄にマイクロインジェクションします（マイクロインジェクション手順の全体的および詳細な説明については参考文献7および8を参照）。 </li><li>プラスチックピペットを使用して、胚をペトリ皿に移し、以下の分析のために所望の発生段階（20-24時間の受精後、hpf）に達するまで28℃で魚の水中でそれらをインキュベートする。 </li></ol> 3.自発的テールコイルリング解析注：20-24 hpfの胚で、薬物リルゾールの有無にかかわらず、自発的な尾巻作用を評価する。 <ol><li>胚を、0.2％DMS​​Oを含有する魚の水で満たした90mm丸型ペトリ皿（リルゾール賦形剤）に移し、手動で脱蝋する。o鋭い先端を持つ宝石商の鉗子。胚を5分間インキュベートする。 </li><li>実体顕微鏡に取り付けられたデジタルカメラを使用して1分間のビデオ録画中にRTで尾巻を検出する。 30フレーム/秒の時間分解能で時系列を取得する。 </li><li>時間単位あたりの屈曲の数（対側および同側の両方）を数えることによって、自発的な尾巻コイルの頻度を計算する。 </li><li> 薬物リルゾールの効果を評価するために、穏やかにプラスチックパスツールピペットを使用して、胚を5μMリルゾールを含む魚の水で満たされた新しい90mmペトリ皿に移す。 <ol><li>胚を5分間インキュベートしてから、1分間のビデオを記録し、上記のように行動分析を行う。 </li></ol></li></ol> 4.生きた胚におけるマーメイドバイオセンサーの可視化のためのイメージングセットアップ：ドナーシグナルとアクセプターシグナルの同時検出<ol><li>魚水中の1％低融点アガロースに20〜24 hpfの胚をマウントする。35mmガラス底のイメージングディッシュ内で37℃。胚を両側に向けます。アガロースが室温で凝固するまで待つ。 </li><li>イメージングディッシュを、倒立顕微鏡に取り付けられた倒立共焦点のステージに移す。 488 nmアルゴンレーザーラインでmUKGを励起し、その発光を495〜525 nmの間で記録することによって、20X対物レンズ（0.7開口数、NA）でバイオセンサーを発現する運動ニューロンを同定する。 </li><li> FRET測定のために、FRETペアのドナーであるmUKGを488 nmレーザーラインで励起します。双方向モードで8,000Hzで動作する共鳴スキャナで、ドナーから放出された蛍光（495〜525nm）とmKOkアクセプター（550〜650nm、FRETチャネル）によって放出された蛍光とを同時に検出する。可能であれば、473 nmレーザーを使用してください。 注：ドナーの励起効率はわずかに低下する（488nmで93％の代わりに85％）が、アクセプタの交差励起は（473nmレーザーラインでは488nmで17％から9％に減少する）。 </li><li>光毒性および蛍光色素漂白を低減するためには、（収集ソフトウェアのビーム経路ウィンドウ上の）レーザーラインの出力を減少させることによって、試料の照射を最小化する。 </li><li>実験の始めに設定され、セッション中一定に保たれるゲインとオフセットのパラメータを一致させるために、励起を最適化します。オフセットを設定するには、イメージの色を（Qルックアップテーブルを使用して）強度値に変更し、レーザーオフでスキャンしながら、オフセットノブ（スマートオフセット）を回して、背景ピクセルの強度がわずかになるようにしますゼロより高い。同じルックアップテーブルを使用して、スキャン中にレーザーをオンにすると、飽和ピクセルを避けるように注意しながら、ゲインノブ（スマートゲイン）を回して信号対ノイズ比を最大にします。 </li><li>開いたピンホール（2エアリーユニット）を使用して、16ビット画像を取得して定量化に十分なダイナミックレンジを提供しますeを分析する。平均化を避けて取得速度を上げ、光退色を最小限に抑えます。 </li><li>ソフトウェア取得ウィンドウで、ドロップダウンメニューから512 x 64ピクセル（ピクセルサイズ：605 nm）のイメージフィールドサイズを選択します。 </li><li>取得モードウィンドウから、ドロップダウンメニューからxyt （単一のxy平面上の時間経過）を選択し、単一のxy平面を取得し、取得パラメータを設定して1つの画像を30ごとに記録することによって、胚の脊髄ニューロン電圧の変化を記録するmsで1分間。 </li><li>同じニューロンにおける膜脱分極に対するリルゾールの投与の効果を評価するために、5μMのリルゾールを含有する魚の水を添加して5分後に新しいデータセットを取得する。 </li><li> FRET分析のために、ImageJマクロBiosensor_FRET（一本鎖FRETバイオセンサーを発現する）を使用する。 </li><li> （（FRET平均FRETバックグラウンド）/（ドナー平均 - ドナーバックグラウンド））として、各ニューロンの基底膜FRET比をt 1で評価する。ここで、FRETおよびドンまたは平均強度は、取得された各チャネルについて細胞周囲に描かれた同じ関心領域（ROI）で計算された平均蛍光強度であり、ドナーバックグラウンドは、蛍光サンプルなしの視野のROIで計算された平均蛍光強度である。 注記：プラグインの使用方法の詳細な説明は、 <a href="http://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret">www.medc.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret</a>ウェブサイトを<a href="http://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret">参照して</a>ください。 </li><li>グラフ化ソフトウェアを使用して、異なる実験パラダイム間の脱分極の頻度、振幅および持続時間を比較する。ペアのないスチューデントのt検定を用いて2つの群を比較し、P &lt;0.05のときに平均値を統計的に異なると考える。 </li></ol>

<ol><li>Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+voltage+indicators+for+large+scale+cortical+imaging+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age.</a> Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).</li>
<li>Chemla, S., Chavane, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dye+imaging%3A+Technique+review+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models.</a> J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).</li>
<li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+membrane+voltage+measurements+using+FRET+with+new+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).</li>
<li>Benedetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((INaP+selective+inhibition+reverts+precocious+inter-+and+motorneurons+hyperexcitability+in+the+Sod1-G93R+zebrafish+ALS+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model.</a> Sci Rep. 6, 24515(2016).</li>
<li>Pennati, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differences+between+larvae+of+the+Ciona+intestinalis+species+complex%3A+hints+for+a+valid+taxonomic+definition+of+distinct+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0122879(2015).</li>
<li>Park, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+upstream+elements+in+the+HuC+promoter+leads+to+the+establishment+of+transgenic+zebrafish+with+fluorescent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons.</a> Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Drapeau, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12450489">Development of the locomotor network in zebrafish.</a> Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).</li>
<li>Brustein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+during+the+development+of+the+zebrafish+locomotor+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Steps during the development of the zebrafish locomotor network.</a> J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).</li>
<li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).</li>
<li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2%3A+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).</li>
<li>Sungmoo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Membrane+Potential+with+Two+Types+of+Genetically+Encoded+Fluorescent+Voltage+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors.</a> J Vis Exp. (108), e53566(2016).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコールは、ゼブラフィッシュ胚脊髄運動ニューロンの電気的特性と、胚発生の約17hpfに現れ、24hpfまで持続する最も初期のステレオタイプ運動活性である自発的巻き取り行動との間の関連性を探索することを可能にした10 。 私たちのアプローチは、開発中の機能ネットワークにおける細胞間の相互作用の複雑さを完全に保ちながら、インタクトな胚の神経系を研究するツールを研究者に提供します。ゼブラフィッシュ胚のインビボイメージングは​​、低融点アガロース中に浸漬することによってそれらを単に固定化することによって実施されている。バイオセンサーの使用による細胞膜電位の変化の研究は、この方法の主な利点の1つである。エンベロープ組織11を除去することによってニューロンに物理的にアクセスしなければならないカノニカル電気生理学的アプローチは、検査中の細胞の電気的特性を変える可能性がある。さらに、FRETベースのバイオセンサーアプローチは、麻酔薬（ すなわち、ナトリウムチャ...

生体内の全身成分分析により、科学者は最も信頼性の高い方法で細胞の行動を調べることができます。膜電圧の変化が興奮性細胞間の伝達を促進する神経系のように、精査中の活性が細胞 - 細胞相互作用（接触および非接触依存）によって大きく影響を受ける場合、これは特に当てはまります。これらの電気信号によってコード化された情報の理解は、神経系が生理学的状態および疾患状態の両方で働く方法を理解するための鍵である。 最も非侵襲性の生理学的条件における細胞の電気的特性を研究するために、いくつかの遺伝的にコード化された電圧指示薬が最近開発されている1 。以前の世代の光電圧センサ（主に電圧感受性色素） 2とは対照的に、GEVIはインタクトな神経系の生体内解析を可能にし 、それらの発現は、特定の細胞型または集団に限定することができる。 ゼブラフィッシュの胚は、GEVIに起因する大きな潜在的可能性を利用するための生体内の 「基質」です。実際、ゼブラフィッシュモデルは、その光学的明瞭性と簡略化され、進化的に保存された神経系のおかげで、ネットワーク内のすべての細胞成分を簡単に同定し、操作することができます。実際、FRETに基づくGEVI Mermaid 3の採用により、筋萎縮性側索硬化症（ALS） 4のゼブラフィッシュモデルにおける脊髄運動ニューロン挙動の予兆的な変化が同定された4 。 以下のin vivoプロトコルは、ニューロン特異的様式でマーメイドを発現する完全なゼブラフィッシュ胚における脊髄運動ニューロンの電気的特性をどのように監視するかを記載する。また、どのように薬理学的に誘発されたchanこのような電気的性質の変化は、発達の非常に初期の段階でゼブラフィッシュの運動挙動を特徴付けるステレオタイプの運動活動である、胚性の自発的な巻き取りの頻度の変化に関連し得る。

<table><tbody><tr><td>低融点アガロース&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>Riluzole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R116</td><td></td></tr><tr><td>Pfu Ultra HQ DNAポリメラーゼ&nbsp;</td><td>Agilent Technologies - Stratagene 製品事業部</td><td>600389</td><td></td></tr><tr><td>T3 ユニバーサルプライマー&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system</td><td>Promega</td><td>A9280</td><td></td></tr><tr><td>Universal SmaI primer&nbsp;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StrataClone 哺乳類発現ベクターシステム / pCMV-SC 鈍器ベクトル&nbsp;</td><td>アジレント・テクノロジーズ - ストラタジーン製品事業部&nbsp;</td><td></td><td></td>240228</tr><tr><td>SmaI&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>プロメガ</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0138S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0195S</td> 35ミリメートル<td></td></tr><tr><td>、ガラス底イメージング皿&nbsp;</td><td>同上</td><td>81151</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td>ライ<td>カマイクロシステムズ</td><td>M10 F</td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>DFC 310 FX</td><td></td></tr><tr><td>ライカアプリケーションスイート4.7.1ソフトウェア&nbsp;</td><td>ライカマイクロシステム</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>QuickTime Player, v10.4</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡 (倒立型)</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター&nbsp;</td><td>エッペンドルフ&nbsp;</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>ImageJマクロ Biosensor_FRET&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad プリズム 6.0c&nbsp;</td><td>GraphPadソフトウェア株式会社</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

ここで説明されているプロトコルは、研究者が細胞が存在する環境の完全性を変えることなく細胞コミュニケーションを研究できるように設計されています。具体的には、脊髄ニューロンなどの興奮性細胞の電気的活動を解析するために開発されました。このようなシナリオでは、脊髄細胞の完全性を維持することが重要であるだけでなく、関与するシステムの解剖学的構造と生理学的形状を維持することも重要です。実際、神経系やその他の複雑なシステムが機能する方法の理解は、体系的なアプローチに基づいている必要があります。このため、モデル系として生きたゼブラフィッシュの胚を選び、胚の生理的条件に干渉することなく脊髄ニューロンの膜電圧変化を評価しました。
ここでは、ゼブラフィッシュの胚の使用とFRETベースのバイオセンサーを組み合わせたアプローチについて説明します。ゼブラフィッシュの胚は非常に単純化された神経系を特徴としており、その透明性によりイメージングアプリケーションに特に適しており、ゼブラフィッシュの発生中に原形質膜で蛍光ベースの電圧インジケーターを使用することができます。これら2つのコンポーネント間の相乗効果により、生理学的状態を乱すことなく、無傷の生物の細胞の電気的活動を分析することができます。最後に、この非侵襲的アプローチは、他の解析(例えば、ここに示すように自発的な動きの記録)と共存させることができます。

FRETに基づくマーメイドバイオセンサーコード配列を有する発現ベクターは、pHuC汎ニューロンプロモーターの制御下で、神経系においてのみタンパク質の合成を駆動し、単一細胞の受精卵に、マイクロインジェクションによって送達された一過性のトランスジェニック胚を得るために（ 図1 、 左パネル）。マイクロインジェクション技術を習得した後、マーメイド陽性胚の割合は100％に近かった。これらの中で、原形質膜で適切な量のマーメイドバイオセンサーを発現する胚のみがFRET分析/画像取得のために考慮された。 自発的巻上げ、尾の先端を頭部9,10 にもたらす全身収縮のみからなる運動応答を、20日の段階で記録した通常の魚培地（ 図1 、中央パネルおよびビデオ1 ）中で...

>jove_content<ここで説明するプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚をin vivoシステムで使用し、関心のある細胞タイプで選択的に発現する蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ベースの遺伝的にコードされた電圧インジケータ(GEVI)を使用することにより、最も非侵襲的な生理学的条件での興奮性細胞の電気的特性の研究を可能にします。

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

本手順の全般的な目的は、ゼブラフィッシュ胚とFRETベースのGEVIを用いて、非侵襲的な生理学的条件下における興奮性細胞の電気的特性を研究することです。本手法は、ニューロンなどの興奮性細胞の生物学に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。例えば、本手法を用いて、神経疾患の病態形成における興奮性の役割を分析することが可能です。本手法では、FRETベースの遺伝子コード型電圧インジケーターを発現する透明なゼブラフィッシュ胚を利用します。このアプローチにより、生体内の細胞の電気的特性を非侵襲的に測定することが可能になります。したがって、本手法を用いることで、ゼブラフィッシュ胚における脊髄ニューロンの興奮性に関する知見を得ることができます。また、本手法はイメージング解析が可能な他のin-vitroまたはin-vivo系にも適用できます。この手順を開始するには、Mermaidバイオセンサーのコーディング領域を増幅するためのPCR混合液を調製します。PCR混合液を95 °Cで15秒間加熱します。50 °Cで15秒間プライミングし、72 °Cで4分間伸長させる工程を計35サイクル繰り返します。その後、市販のゲル精製キットを用いて、目的の平滑末端PCR産物をゲル精製します。次に、DNA断片をpCMV-SC平滑末端ベクターにクローニングし、HuCプロモーターを挿入するため、Mermaid陽性プラスミドを制限酵素SmaIで線状化します。制限酵素反応を全量 20 µL で調製し、25 °C で 1 時間インキュベートします。その後、市販のゲル精製キットを用いて、消化したプラスミドをゲル精製します。次に、PFU DNA polymerase とゼブラフィッシュゲノム DNA をテンプレートとして、HuC プロモーターを PCR 増幅します。PCR反応液を調製します。95 °Cで2分間の初期変性後、95 °Cで15秒間の加熱を行います。続いて50 °Cで15秒間のアニーリングを行い、72 °Cで4分間の伸長反応を行います。このサイクルを計35回繰り返します。次に、特定の平滑末端PCR産物をゲル精製します。精製したpCMV-SC MermaidとpHuC DNAを等モル量ずつ、T4 DNA ligase 1 µLおよびSpecific 10x buffer 1 µLを用いて、最終容量10 µLでライゲーションします。その後、反応液を4 °Cで16時間インキュベートします。コンピテントセルの分注量に、ライゲーション反応液5 µLをトランスフォーメーションさせる。CEL1-EcoRVによるダブルダイジェスチョンを行い、プロモーターが正しい方向で挿入されたpHuC陽性クローンを選択する。これらのクローンを15 mLチューブに移し、37 °Cで一晩インキュベートする。その後、細胞からプラスミドを抽出し、CEL1-EcoRVによる二重制限酵素反応を行い、37 °Cで1時間インキュベートします。次に、反応液をアガロースゲルで電気泳動します。この手順では、野生型またはsod1G93R成体ゼブラフィッシュから得られた受精卵を10 mmのペトリ皿に移します。胚を冷たい魚用水で洗浄します。その後、直ちに200 picogramsのpHuC-Mermaidプラスミドを卵黄にマイクロインジェクションします。次に、胚をシャーレに移し、以降の解析に必要となる目的の発達段階に達するまで、28 degrees Celsiusの魚用水中でインキュベートします。自発的な尾部の巻き付き解析を行うために、胚を0.2% DMSOを含む魚用飼育水を満たした90 mmの円形ペトリ皿に移します。次に、先端の鋭いピンセット2本または針を用いて、手動で絨毛膜を除去します。その後、胚を28 °Cで5分間インキュベートします。実体顕微鏡に装着したデジタルカメラを用い、1分間のビデオ録画を行い、室温での尾部の巻き付きを検出します。次に、30 fpsの時間分解能でタイムシリーズを取得します。その後、単位時間あたりの屈曲回数をカウントし、自発的な尾部巻き付きの頻度を算出します。薬剤リルゾールの効果を評価するため、5 µMのリルゾールを含む魚用水を満たした新しい90 mmペトリ皿に胚を移します。その後、胚を28 °Cで5分間インキュベートし、1分間のビデオ録画を行い、行動解析を実施します。次に、20～24 hpfの胚を、37 °Cで魚用水を用いた1%低融点アガロース中で、35 mmガラス底イメージングディッシュ内にマウントします。胚を横向きに配置し、アガロースが室温で凝固するまで待ちます。次に、イメージングディッシュを共焦点顕微鏡のステージに移動させます。488 nmのアルゴンレーザーでmonomeric Umikinoko-Greenを励起し、バイオセンサーを発現している運動ニューロンを特定します。次に、エミッション（放出波長）を495〜525ナノメートルに設定し、記録ボタンを押します。FRET測定では、FRETペアのドナーであるmUKGを488ナノメートルのレーザーで励起させます。同時に2台の光電子増倍管を使用して、ドナーから放出される蛍光と、アクセプターであるmonomeric Kusibira-Orangeから放出される蛍光を検出します。実験の開始時に、mUKG蛍光を記録する光電子増倍管1のゲインとオフセットを最適化し、セッション全体を通じてそれらを一定に保持してください。オフセットを設定するには、Qルックアップテーブルを使用して、画像の色を強度値に変更します。レーザーをオフにしてスキャンしながら、背景ピクセルの強度が0よりわずかに高くなるようにオフセットスライダーを調整してください。同じルックアップテーブルを使用して、レーザーをオンにします。スキャンしながら、ゲインスライダーを使用して信号対雑音比（S/N比）を最大化させますが、ピクセルが飽和しないように注意してください。ソフトウェアの収集ウィンドウで、xyt収集モードを選択し、ドロップダウンメニューから512×64ピクセルのイメージフィールドサイズを選択します。次に、胚の脊髄ニューロンの電圧変化の記録設定を行い、30ミリ秒ごとにXY平面を1枚、1分間取得します。同一ニューロンにおける膜脱分極に対するリルゾールの投与効果を評価するため、5 µMのリルゾールを含む魚用水を添加した5分後に、新しいデータセットを取得します。この動画では、尾の先端が頭部に達する全身収縮のみで構成される運動反応である自発的コイルリングを、通常の魚用培地を用いた20〜24 hpfの段階で記録しました。この動画では、5 µMのリルゾールでインキュベートした後の胚における自発的なコイルリング（巻回運動）を示しています。リルゾールによって誘導された自発的コイルリング頻度の変化が、脊髄運動ニューロンの電気活動の変化に基づいているかどうかを検証するため、Mermaidバイオセンサーのドナー・アクセプターFRETペアの蛍光強度比を測定することにより、胚の脊髄運動ニューロンにおける膜電位を完全に非侵襲的な方法で解析しました。バイオセンサーを発現している一次脊髄運動ニューロンを特定し、その基底状態における自発的な脱分極活動を記録しました。リルゾールの投与により、尾部のコイル状運動の頻度の減少とともに、自発的な脱分極イベントの頻度も減少しました。この手法を習得すれば、発達中の機能系における細胞間の相互作用の複雑さを完全に維持したまま、完全な胚の神経ネットワークの電気的特性を研究することが可能になります。このビデオを視聴することで、脊髄ニューロンの電気活動が自発的な尾部コイル状運動の頻度とどのように相関しているかについて、十分な理解が得られるはずです。

biosensing-motor-neuron-membrane-potential-in-live-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、我々は共焦点顕微鏡による単一細胞の解像度でのライブゼブラフィッシュの胚で開発脊椎動物の脳を分析するためにする方法を示しています。これは、我々は、単一セルのゼブラフィッシュの胚を注入し、その後、脳の発達をマウントし、イメージする方法が含まれています。...

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の生体内で個々の神経細胞や神経堤細胞のイメージングを説明します。このメソッドは、蛍光共焦点タイムラプス顕微鏡を使用して細胞の行動とアクチンの局在を調べるために使用されます。...

細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング

幼虫ゼブラフィッシュは、脊髄運動ニューロンとターゲット骨格筋からの同時パッチクランプ記録を可能にした最初の脊椎動物のモデルシステムを表す。このビデオでは、分節キャップ運動ニューロンと標的筋細胞と同様に各セルのタイプから録音するための方法論を識別するために使用される微細な方法を示しています。...

モーターニューロンとターゲットゼブラフィッシュの骨格筋からの対のパッチクランプ記録

このビデオでは、遺伝子組み換え体性感覚ニューロンを活性化し、誘発された行動反応を高速ビデオカメラで記録する光遺伝学的手法について説明しています。...

ゼブラフィッシュのオプトジェネティクス:幼虫の行動反応を研究するための遺伝子組み換え体性感覚ニューロンの活性化

このビデオは、ゼブラフィッシュの胚の運動ニューロンの電気生理学を研究するための非侵襲的アッセイを示しています。脊髄運動ニューロンの自発的な脱分極の結果として胚のテールコイリングを測定すると、コイリング周波数を減らすためにナトリウムチャネル遮断薬が適用されます。次に、胚をアガロースに固定化し、蛍光顕微鏡下に置く。遺伝子操作された運動ニューロンは、ドナーとアクセプター蛍光色素を持つ電位感知バイオセンサーを発現します。アクセプターフルオロフォア放出の減少は、ナトリウムチャネル遮断薬による運動ニューロンの自発的な脱分極の減少を示しています。...

ゼブラフィッシュ胚における運動ニューロンの電気生理学を研究するための非侵襲的アプローチ

このビデオは、麻痺したゼブラフィッシュの幼生の求心性ニューロンからの電気信号の記録を、側線神経節の近くにマイクロピペットを配置し、信号捕捉のための緩いシールを形成する方法を示しています。細胞外溶液は、この過程でニューロンの生存率を維持します。...

動けなくなったゼブラフィッシュ幼生における求心性ニューロンからの電気信号のモニタリング

このような増殖、パターニング、分化、および軸索ガイダンスとして発生プロセスを容易にゼブラフィッシュ脊髄でモデル化することができる。この記事では、これらのイベントの可視化を最適化した、ゼブラフィッシュ胚の取付け手順を説明します。...

解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析

この原稿は、ゼブラフィッシュの胚および幼生の脊髄神経細胞からの電気生理学的記録のための方法を説明します。準備は、 その場で神経細胞を維持し、多くの場合、最小の切開を必要とします。これらのメソッドは、最初の電気的興奮の買収からの早期の幼虫の段階を経て、脊髄神経細胞の様々な電気生理学的研究が可能になります。...

ゼブラフィッシュ<em&gt;その場での</em&gt;脊髄脊髄感覚運動ニューロンからの電気生理学的記録のための準備

ここでは、胚の動きを可視化する携帯電話の電気電圧記者ゼブラフィッシュ...

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

我々は、モデル脊椎動物の毛細胞系における運動コマンド中の、無毛ニューロン活動の変化をモニターするプロトコルを記述する。...

ゼブラフィッシュで泳ぐ後側面線の発泡性ニューロンの活動

ゼブラフィッシュの幼生の神経筋接合部は、シナプス生理学を研究するための魅力的なモデルです。電気生理学や光学イメージングなど、多くの実験技術に適しています。ここでは、直立した落射蛍光顕微鏡下でpHluorinベースのプローブを使用してシナプス伝達をイメージングするためのプロトコルについて説明します。...

解剖された幼生ゼブラフィッシュの神経筋接合部におけるシナプス小胞のリサイクルのライブイメージング

学ぶFRETベースの遺伝子電圧インジケーターを用いたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位の非侵襲的バイオセンシング法。神経興奮性と神経疾患の病態理解に貢献します。

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

さらに動画を探す