Name: プログラム可能な材料とのインタフェースリビング細胞を操作するために合成生物学を使用して、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学ぶ遺伝子改変と表面修飾を組み合わせた合成生物学的手法で、E. coliを用いてプログラム可能な材料表面を制御・操作する技術。このモジュール型アプローチは分子医学や環境モニタリングへの応用が期待される。

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作者は感謝して、米国の科学研究の空軍オフィスから受賞FA9550-13-1-0108からの支援を認めます。著者はさらに、米国の海軍研究局から表彰N00014-15-1-2502からバージニア工科大学での重要な技術と応用科学研究所から、国立科学財団大学院研究からの資金を支援を認めますフェローシッププログラム、受賞番号1607310。

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

私たちは、官能材料表面との生活設計された細胞をインタフェースするための新たな戦略を提示しています。これは、IPTGで誘導した場合に、ビオチンの上昇したレベルを合成することができる細胞株を開発することによって達成されました。ビオチンの上昇したレベルは、その後、官能化された表面を修飾するために使用することができます。プロトコルは、 大腸菌細胞株を操作する方法を2つの異なる官能化表面を作成する方法を詳述します。 このプロトコルでの重要なステップは、操作された細胞株の構築を通じて起こります。下流の問題を回避するために、成長曲線（ 図2）と、蛍光応答の両方で操作された細胞株を特徴付ける（ 図3）が推奨されます。手続き上の問題が発生する必要があり、このようなPCRの抽出及びギブソンアセンブリ14のような他の分子クローニング戦略は、ここでの手順のために適切に置換されてもよいです。ビオチンyieを最適化するため操作された細胞株のLDは、DTBの十分な量を細胞に提供さ...

ここでは、操作された細胞株からの化学信号に応答することができるプログラム可能な基板を開発するための手順を報告しています。 1我々は、合成的に操作された大腸菌（E. coli）細胞によって産生されるビオチンに応答ビオチン-ストレプトアビジンのインタフェースを作成することによってこれを行います。以前は、プログラム可能な表面は、毒素検出2と防衛・安全保障へのポイントオブケア診断3からのアプリケーションの広い範囲のために設計されています。プログラム可能な表面は、センサやアクチュエータとして有用であり得る4が、それらは異なる環境課題に適応する能力でそれらを持たせることにより、「よりスマート」にすることができます。対照的に、 大腸菌なども簡単な微生物は、固有の適応性を有しており、洗練された、多くの場合、予期しない溶液でのチャレンジに応答することが可能です。この適応性は、Eを有効にしていますその複雑な遺伝子ネットワークによって制御される大腸菌集団は、費用対効果的にするために資源を求め、5は高付加価値製品、6、さらには電力マイクロスケールのロボットを作成します。 7プログラム可能な表面の使用で生細胞の適応の利点を結合することによって、我々は、異なる環境条件に対応できるスマートな基板を作成することができます。 合成生物学は生物の動作をプログラムするために研究者に新しい能力を与えています。新しい遺伝子調節ネットワークを含むように細胞を操作することによって、研究者は、プログラムされた行動の範囲を示す細胞を設計することができます。 図8に示すように 、基礎研究を超えて9、これらの行動は、このような材料のアセンブリを制御し、生物学的に付加価値製品を製造するような用途に使用することができます。我々はアンに合成生物学のツールを使用する方法10ここで、私たちの詳細誘導時にビオチンを合成する大腸菌株をgineer。この株は、プラスミド、pKE1-のlacI-のbioBを組み立てるために、制限酵素クローニング法を使用して開発されました。このプラスミドは、 大腸菌 K-12株MG1655に形質転換されたときに、bioBのレベルの上昇を発現する能力、ビオチン合成に必須の酵素で細胞を付与します。形質転換された細胞は、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導し、ビオチン前駆体、デスチオビオチン（DTB）で提供された場合には、ビオチンのレベルの上昇を作製しました。 ストレプトアビジンとビオチンの結合相互作用は、自然界に見られる最も強い非共有結合の一つです。このように、ビオチン - ストレプトアビジン相互作用は、両方のよく特徴付けられ、非常にバイオテクノロジーに採用します。 図11は、この原稿の中で、我々は、官能表面と細胞産生ビオチンを感知し、検出するために、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用を利用する2つの戦略を提示します。我々「間接的」と「直接」の制御方式として、これらの対照的な面を参照してください。間接的な制御方式では、セル生産ビオチンコンジュゲートとの結合部位をストレプトアビジンポリスチレン表面上に固定化されたビオチンと競合します。また、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）とコンジュゲートされています。 HRPは3、3 &#39;、5、5&#39;-テトラメチルベンジジン（TMB）は、450nmで（OD 450）での分光吸光度（ すなわち 、光学密度）を定量することによってモニターすることができる光信号12を生成するように修正します。このように、間接的な制御方式は、研究者がOD 450信号のattentuationを監視することにより、細胞産生ビオチンを測定することができます。 直接制御方式は、材料表面に直接ストレプトアビジンを固定化し、結合部位をストレプトアビジンのために競争するために、セル生産ビオチンおよびビオチン化HRPを可能にすることにより、ストレプトアビジン - ビオチンイベントを利用します。ここでも、細胞産生ビオチンの相対レベルは、OD 450の信号を測定することによって監視されています。 まとめると、遺伝子操作された細胞と官能基化表面は、私たちが生きている細胞内でネットワークを誘導することによって、プログラム可能な表面の特性を制御することができます。言い換えれば、私たちは一緒に、これらのシステムを連携することにより操作材料界面の生物の適応性と信頼性と仕様を活用するシステムを作成しました。

<table><tbody><tr><td>LBブロス、ミラー&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>M9、最小塩、5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>カサミノ酸&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1424-100</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム、無水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム、二水和</td><td>物フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース(D-グルコース)、無水フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>NEBターボ細胞株</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>C2984L</td><td></td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチドプライマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>N/A</td><td>25N 合成、DSL 精製</td></tr><tr><td>Q5 ハイフィデリティポリメラーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 反応バッファー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td>ス <td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 溶液ミックス</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td>ス <td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>バイオエクスプレス</td><td>E-3120-125</td><td></td></tr><tr><td>エチジウム臭化物、1%</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>ゲル抽出キット</td><td>エポックバイオラボ</td><td>2260250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatchプラスミドDNAミニプレップキット</td><td>エポックバイオラボ</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0157S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>ColiRolle ガラスめっきビーズ&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>7101-3</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Desthiobiot in (DTB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16129</td><td></td></tr><tr><td>スクシンイミジルトランス-4-(マレイミジルメチル) シクロヘキサン-1-カルボキシレート (SMCC)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S1534</td><td></td></tr>ジ<tr><td>メチルスルホキシド(DMSO)&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸(SPDP)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S1531</td><td></td></tr><tr><td>NHS-LC-LC-ビオチン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21343</td><td></td></tr><tr><td>セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31490</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、10倍溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン(SA)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>21145</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミンテタ酢酸 (EDTA)&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン80&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>H325-4</td><td></td></tr><tr><td>3、3'、5、5'-テトラメチルベンジジン(TMB)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>AC229280050</td><td></td></tr><tr><td>ビバスピン500遠心濃縮器&nbsp;</td><td>ビバ製品</td><td>VS0192</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム、無水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルポリスチレンプレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>266120</td><td></td></tr></tbody></table>

プログラム可能な材料とのインタフェースリビング細胞を操作するために合成生物学を使用して、

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

私たちは、操作された細胞は、官能面の材料特性を制御することを可能にする非生物的・生物インタフェースを開発しました。 大腸菌細胞の合成的に操作された株と官能物質界面このシステムは、二つのモジュールを作成することによって行われます。この論文の中で、私たちの詳細遺伝的分子クローニング戦略を用いて、 大腸菌株内で選択行動を操作するためのプロトコル。化学誘導物質にさらされたときに一度開発し、この株はビオチンのレベルの上昇を生成します。セル合成ビオチンに応答することができ、それぞれが2つの異なる官能化表面を作成するために加え、我々詳細プロトコル。まとめると、我々が操作された細胞は、非生物の基板上に材料組成およびアセンブリを制御することを可能にリンクされ、非生物的・生物システムを作成するための方法論を提示します。

代表的な結果を伴う5図に示されています。読者が視覚的に合成操作されたE. coli株を作成するための重要なステップに従うことができるように、まず、我々はグラフィカルにクローニングプロセス（ 図1）を提示します。細胞集団動態を特徴付けるために、我々は、集団の600ナノメートル（OD 600）での光学密度を測定することによって生成された成長曲線（ 図2）を提供します 。そして、私たちは私たちは、光学的にIPTGで誘導時に細胞によって産生されることになるのbioBの相対量を測定することを可能にする、bioBのためのプロキシ（ 図3）としてmCherryをを使用することにより、調節遺伝子ネットワークが検証される方法を示しています。次に、我々は間接制御とダイレクト制御官能基化表面のための応答データを提示します。これらのデータプロット（ 図4）は、</stro...

本論文では、遺伝子操作された細胞およびプログラマブル材料表面を制御し、操作するために、合成遺伝子操作大腸菌を有効に官能基化表面を開発するための一連のプロトコルを提示します。

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

これらの手順の全体的な目的は、遺伝子改変と表面機能化戦略を組み合わせることで、合成的にエンジニアリングされたE.coliを用いて、プログラム可能な材料表面を制御および操作することです。この手法は、分子医学や環境モニタリングなどの分野における重要な疑問への回答に寄与します。遺伝的にプログラムされた細胞を用いて局所的な環境を解釈し、それに応じて機能化材料を修飾することで、幅広いアプリケーションに適用可能なモジュール式ツールを提供します。この手法の主な利点は、生細胞が機能化された界面を介して、周囲の状況を読み取り、処理し、記録できるダイナミックなセンサーとして機能できることです。テキストのプロトコルに従って溶液を調製し、ビオチン産生E.coliからビオチン濃縮上清を回収した後、20 µLのストレプトアビジン（SA溶液）に1.4 µLのSPDP溶液を加えます。チューブをアルミホイルで包み、室温で1時間30分間インキュベートして、SPDP架橋剤がアミノ基を介してSAと結合し、ピリジルジチオ活性化SAを形成させます。インキュベーション後、チューブに2.4 µLのDTT溶液を加え、室温で1時間インキュベートして、ピリジン-2-チオンの切断によりスルフィドリル活性化SAを生成させます。次に、72 µLのHRP溶液に7.5 µLのSCC溶液を加え、アルミホイルで包み、室温で1時間30分間インキュベートします。これにより、アミノ基によって結合したマレイミド活性化HRPが得られます。17 µLのLC-LCビオチン溶液を200 µLのBSA溶液と混合し、チューブをアルミホイルで包み、室温で1時間30分間インキュベートします。このステップにより、ビオチンがアミド結合を介してBSAに接合されます。SA-SPDP溶液、HRP-SMCC、およびBSA結合ビオチン溶液を、それぞれ独立したスピンチューブ付き遠心濃縮器に移します。SA-SPDPを10,000 ×gで、チューブの液量が100 µLになるまで、または16分間遠心分離し、その後、PBS-EDTAを用いてスピンチューブを500 µLまで満たします。この遠心分離とPBS-EDTAの添加をさらに5回繰り返します。溶液を100 µLまで濃縮した後、ストック溶液を4 °Cで保存します。HRP SMCCについて、液量が25 µLになるまで、または16分間、10,000 ×gでチューブを遠心分離します。遠心後のスピンチューブにPBSを加えて4500 µLまで満たし、この遠心とPBSの添加をさらに5回繰り返します。溶液を100 µLまで濃縮した後、ストック溶液を4 °Cで保存します。BSAビオチンの調製について、サンプルを10,000 ×gで、液量が100 µLになるまで、あるいは12分間遠心分離し、その後PBSを用いてスピンチューブを500 µLまで満たします。この遠心分離とPBSの添加をさらに4回繰り返した後、再度液量が100 µLになるまで、あるいは12分間遠心分離し、チューブに100 µLのPBSを加えてストック溶液を4 °Cで保存します。次に、10 mg/mLのHRP 25 µLと10 mg/mLのSA溶液25 µLを混合し、チューブを4 °Cで一晩保存します。その後、BSAビオチンのストック溶液10 µLを490 µLのPBSに加えることで、PBS中のBSAビオチン分注液を2本調製します。溶液 100 µL を 96ウェルプレートの各ウェルに分注します。プレートをアルミホイルで包み、37 °C で1時間インキュベートします。次に、0.5% Tween 80 および BPS 200 µL を各ウェルに加えます。プレートを室温で2分間インキュベートし、その後、液体を吸引・デカントします。この洗浄操作を3回繰り返した後、各ウェルに0.5%casing solutionを200 µLずつ加え、プレートを37 °Cで1時間インキュベートします。前述と同様にさらに洗浄を行った後、05%casing solution 12 mLと05%Tween 80 7.5 µLを混合し、この溶液を用いてSA-HRPストック溶液を10,000倍に希釈します。希釈したSA-HRPを96ウェルプレートの各ウェルに80 µLずつ分注し、次に調製したビオチンサンプルを各ウェルに20 µLずつ加えます。プレートを37 °Cで1時間インキュベートします。このステップにより、SA-HRP結合部位をめぐって、遊離ビオチンと固定化されたBSAビオチンとの間で競合的な結合が起こります。その後、前と同様にプレートを3回洗浄し、50 millimolar 酢酸ナトリウム、1% TMB、および 3% 過酸化水素を 1,000：10：1 の比率で混合した 20 milliliter の溶液を調製します。この溶液をプレートの各ウェルに 200 microliters ずつ加え、アルミホイルで包んで室温で 15 分間インキュベートします。反応を停止させるため、各ウェルに 2 molar 硫酸を 50 microliters ずつピペッティングし、プレートリーダーを用いて OD 450 を測定します。テキストプロトコルに従って溶液を調製した後、7.5 µLのLC-LC biotinを72 µLのHRPに加えます。溶液をアルミホイルで包み、室温で1.5時間、撹拌しながらサンプルをインキュベートします。この工程により、アミド結合を介してビオチンがHRPに接合されます。溶液をスピンチューブに入れた遠心濃縮器に移し、液量が100 µLになるまで、または12分間、10,000 ×gで遠心分離します。次に、PBSを用いてスピンチューブを500 µLまで満たし、遠心分離と緩衝液の添加を4回繰り返します。続いて、96ウェルプレートの各ウェルに、PBSで調製した0.17 µg/mLのSAを100 µLずつ添加します。プレートをアルミホイルで包み、37 °Cで1時間インキュベートします。プレートのウェルを洗浄するため、0.5% Tween 80を200 µLずつ各ウェルにピペッティングします。プレートを室温で2分間インキュベートし、液を捨てます。この洗浄操作をさらに3回繰り返した後、0.5%コーティング溶液を200 µLずつウェルに加えます。プレートを37°Cで1時間インキュベートした後、前述と同様にウェルを3回洗浄します。あらかじめ調製した洗浄済み濃縮ビオチンHRP溶液を用い、ビオチンHRPストック溶液を1:10,000に希釈し、その溶液を96ウェルプレートの各ウェルに80µLずつ加えます。調製したビオチンサンプルを各ウェルに20µLずつ加え、プレートを37°Cで1時間インキュベートし、固定化されたSA結合部位をめぐって遊離ビオチンとビオチンHRPの間で競合的結合をさせます。前述と同様にウェルを3回洗浄した後、50 millimolar 酢酸ナトリウム、1% TMV、および3% 過酸化水素を1,000:10:1の比率で混合し、20 milliliterの溶液を調製します。この溶液をプレートの各ウェルに200 microlitersずつ加え、アルミホイルで蓋をして室温で15分間インキュベートします。その後、各ウェルに2 molar 硫酸を50 microliters加えて反応を停止させます。最後に、プレートリーダーを用いてOD 450を測定します。設計された誘導性E.coli MG1655野生型細胞を、最小培地、およびDTBおよび/またはIPTGを添加した最小培地で培養し、モニタリングした。これらのプロットは、24時間にわたって5分ごとに測定されたOD 600の値を示している。本実験では、設計された細胞をIPTGで誘導した際の誘導プロファイルを測定するため、bioB遺伝子の代わりに蛍光タンパク質mCherryを用いた。これらの結果は、誘導可能な遺伝子ネットワークの有効性を示すものである。ここに、間接的および直接的な機能化表面スキームの両方において、ビオチンの濃度変化に応答したOD 450における光学信号をプロットした。本実験では、誘導されたエンジニアリング細胞の産物を用いて、機能化表面を化学的に修飾した。野生型細胞、pKE1-lacI-bioBプラスミドを含む非誘導細胞、およびpKE1-lacI-bioBプラスミドを含む誘導細胞について、間接的コントロールスキームで機能化された表面を用いて測定した異なるビオチン濃度を示す。習得後、細胞の遺伝子工学的改変は2日で完了し、直接的および間接的な表面機能化の手法は、適切に実施すればそれぞれ5時間で完了できる。この手順を行う際は、細菌細胞培養のコンタミネーションを避け、光退色を防ぐために機能化中に表面を遮光させることが重要である。このビデオを視聴することで、直接的および間接的な制御スキームの両方において、表面を機能化する方法を十分に理解できるはずです。エチジウムブロマイドを取り扱う際は非常に危険であるため、この手順を実施する間は、常に手袋を着用するなど、適切な予防策を講じることを忘れないでください。

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Bioengineering

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