Name: アイスアフィニティー精製を用いた氷再結晶阻害とアイソレーションの評価による植物の氷結合タンパク質の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学ぶ アイスアフィニティー精製を用いて耐寒性植物から氷結合タンパク質を同定する方法。氷再結晶阻害活性を評価し、複雑な精製工程なしで天然抽出物からIBPsを単離できます。

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1.スプラット装置のセットアップ<ol><li>エチレングリコール（水中50％v / v）を有する温度プログラム可能な循環水浴を埋めます。 注：緑の自動車のエチレングリコールを使用することができます。 </li><li>外部チャンバを組み立てるために、二重壁のガラスボウルに水浴を接続する絶縁プラスチック管を使用します。発泡スチロールでガラスボウルを絶縁し、プラスチックシャーレのふたでカバーしています。光源はガラスチャンバーを通して見ることができるようにポリスチレン容器の底に3-4インチの穴を開け。 </li><li> 10倍の接眼レンズをカメラポートと4X偏光対物レンズを取り付けた解剖顕微鏡の外部チャンバーを、マウント。外部チャンバの底部における偏光フィルムの追加の部分を配置します。 </li><li>レトルトスタンドの基部にチューブの下に位置する冷却ブロックと共に、大型ポリスチレン容器内レトルトスタンドと場所に1〜1.5メートルチューブ（〜5cmの直径）をクランプします。 </li></ol> IRIの解析のためのネイティブのタンパク質抽出物の調製<ol><li>微光条件（6時間明/ 18時間暗）下で、4℃で最大1週間凍結耐性草または他の凍結耐性の植物種、冷順応植物におけるIBPSの発現を誘導します。これは、すでに低い温度条件と順化期間にさらされているフィールドから採取されたサンプルには適用されません。 </li><li>茎の基部に切断することにより、葉組織の約0.1グラムを得、次いで1.5 mLチューブに入れます。すぐに使用するまで-80℃で液体窒素や店舗でサンプルを凍結点滅。 </li><li>細胞を溶解するために、液体窒素下で乳鉢と乳棒を用いて微粉末に組織サンプルを挽きます。液体窒素は、均質化プロセス中に蒸発していないことを確認してください。 </li><li>直ちに氷上に地面サンプルを配置し、液体窒素が完全に蒸発することができます。天然タンパク質extractiの1 mLを加え10mMトリス - 塩酸を含む緩衝液に、25mMの塩化ナトリウム（pH7.5）を、使用直前に追加した2つのEDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤有します。ピペットは、混合します。渦ありません。 注：溶解物二次代謝産物が含まれている場合は、追加の添加剤は、（説明を参照）を使用する必要があります。 </li><li>穏やかに4℃でサンプルを一晩（18-24時間）を振ります。 4℃での残りのステップを行います。 </li><li> 5分間〜16,000×gでサンプルを遠心分離することにより、細胞破片を除去します。可溶性画分を保持し、細胞残屑が続く場合、さらに5分間遠心します。清澄化サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。 </li></ol> 3.スプラットアッセイ事前実験を設定します<ol><li>偏光フィルムと設定外部チャンバーにヘキサン100mLを注ぎ、水分がスライド上に構築防ぐために5~6乾燥ビーズを加えます。浴をカバープレートに真空グリースを少量加え、密封を確保し、ヘキサンの蒸発を防ぐためにねじれ。 </lI&gt; <li>実験を開始する前に、間-4℃から-6°Cプログラマブル水浴を用いて約2~3時間のヘキサン浴を冷却します。実験を開始する前に温度計をヘキサンの温度を確認してください。 </li><li>直接プラスチックチューブ以下ポリスチレンボックスに冷却ブロックを配置し、ドライアイスで完全に実験を開始する前に40分を覆います。 </li><li>アッセイを開始する前に、チューブが水平であることを確認してください。決定するために、ここで、冷却ブロック上のサンプルを水で手順、最初のテストを削除して（後述のように）サンプルがマーカーで低下する場所を示すであろう。 </li><li>冷たいブロックの上からドライアイスを除去し、水で決定されたドロップマークをガラス顕微鏡カバースライドを置きます。 </li><li>直ちにアッセイを開始する前に、光源をオンにし、ガラス容器の底部に形成された任意の氷を掻き取ります。ない限り、氷の結晶に光源を維持しないでくださいヘキサンを加熱防止するために可視化されています。 </li></ol>スプラットアッセイを行う4。 <ol><li>余分な油を除去ペーパータオルを使用して、液浸油自動ピペット（1-20μL）に固定された使い捨てチップを浸し。このステップでは、サンプルが落ちるのではなくピペットの外側に付着することができます。 注：ピペットから余分な油を削除するには、油滴が可視化が困難、氷の結晶の上に形成されないことを確実にするために重要です。 </li><li>直接サンプルを解放する前に、プラスチック製のチューブを超えるサンプルと場所ピペットのピペット10μL。サンプルは、氷の結晶の単層を作成し、ガラスカバースライドに当たったときの異なる「スプラット」音が聞こえるする必要があります。 </li><li>迅速かつ慎重にピンセットを使用して、コールドブロックから顕微鏡スライドを削除し、偏光フィルムの上に、ヘキサン浴に置きます。 </li><li>顕微鏡で見ると、ビューや広告の分野に顕微鏡スライドを置きますちょうど対物レンズ交差分極は、高コントラスト氷晶の可視化を可能にするようになっています。 40倍に倍率を調整します。 </li><li>顕微鏡にカメラを取り付け、氷の結晶の明確な可視化を可能にし、画像をキャプチャするために、「マクロ」に設定を調整します。 注：氷の結晶が成長できるようにするために1時間まで待機して鮮明な画像を与えることができます。 </li><li>繰り返しは、すべてのサンプルに対して4.1から4.5を繰り返します。典型的には、ヘキサンチャンバ内の異なる試料で最大6枚のスライドを置きます。 </li><li>光源をオフにし、ヘキサン浴上でプラスチック板を配置し、密封を保証します。氷の結晶が（特定のアッセイ内で一貫アニーリング期間を維持しながら、12〜24時間）を一晩アニールすることを可能にします。上記のようにインキュベーション後、氷のフィルムの画像をキャプチャします。 注：一部のサンプルは、より迅速に他より再結晶化します。いかなる再結晶は12時間後に明らかでない場合は、24時間までないrecrystalliことを保証するために結晶をアニールすることを可能にしますzationが発生します。 </li></ol> 5.スプラットアッセイデータ分析<ol><li>コンピュータに写真をアップロードして、直接、アニール前と後の氷の結晶の大きさを比較します。ないIRIの活動なしのサンプルが著しく大きい氷結晶を形成する再結晶であろう一方、氷の再結晶化活性を有するサンプルは、成長しないであろう。光の干渉は、大きな氷の結晶がわずかに異なる色合いで表示されますので、参照しやすいようになります。 </li></ol> 6.アイスアフィニティ精製機器のセットアップ<ol><li>エチレングリコールとの温度プログラム可能な循環水浴を記入してください。グリーン自動車エチレングリコールを使用することができます。 </li><li>絶縁プラスチックチューブ15を用いて、中空、黄銅プローブにバスを接続します。 </li><li> 150mLのビーカーは、ぴったり合うことができるそこにポリスチレン容器を構成します。真鍮コールドフィンガーのために中央に穴の開いた容器用の蓋を作成します。 </li></ol> 7。アイスアフィニティ精製のための試料の調製<ol><li> 2.1節で説明したように冷たい順応植物組織。 </li><li> 20 mLチューブに接地バイオマス（ステップ2.3）の〜100〜150グラムを収集し、直ちに凍結点滅。サンプルは、使用前に-80℃で保存することができます。 </li><li>セクション2.3から2.5に記載されたサンプルを準備します。葉組織の再懸濁のために：1つの比（天然のタンパク質抽出バッファーmLの組織のMG：1）を使用します。内因性プロテアーゼによってIBPSの劣化を避けるために、追加のプロテアーゼ阻害剤錠剤を使用してください。 注：2または1：3（組織のMG：天然のタンパク質抽出緩衝液のmL）で組織サンプルがあまりに濃厚である場合、1の比を調整します。 </li><li>細胞破片を除去し、チーズクロスの2層、3回通って溶解物をふるいです。 4℃で40分間30,000×gで遠心分離することにより破片をペレット。 </li><li>天然のタンパク質抽出緩衝液を用いて120 mLに試料の体積を増加させます。アイスアフィニティ精製のために直ちにに溶解産物を使用してください氷結合活性の損失を避けます。 </li></ol>アイスアフィニティ精製を実施8. <ol><li>精製前に、-0.04℃/ hの速度で-0.5℃〜-3℃で冷却するためにプログラム可能な水槽セット。 注：冷却速度は、サンプルの初期量に応じて調整することができます。 </li><li> -0.5℃に氷の指を冷却し、続いて冷たい蒸留水を含む50 mLチューブにそれを沈めます。氷の核形成を促進するために、いくつかの氷片を追加し、指の上に形成する氷の薄い層を許容します。このプロセスは、典型的には20〜30分を要します。 注：氷でコーティングされた指の上の任意の塊が前にサンプルに置くことに手袋をはめた手で平滑化されなければなりません。氷層が-0.5°Cで形成していない場合は、-0.75°Cまで温度を下げます。 </li><li>マグネチックスターラーの上にポリスチレン容器に小さな磁気撹拌棒を含む150mLのガラスビーカーに試料を置き。氷の指があることを確認します中心と液体試料中に少なくとも半分を下げました。コンテナを封印。 </li><li> 24時間ごとにチェックし、プログラムは約2日間実行を許可します。サンプルの50％が凍結されたら、プログラムを停止します。氷の半球へのIBPSの取り込みは、「アイス・エッチング」になります。 注：精製実験は、プログラムの実行は、それに応じて調整する時間の長さより大きなサンプル量を使用して行うことができます。 </li><li> 、氷の半球を除去し、4℃にプローブを温めるために、非結合タンパク質を除去し、次いで4℃で解凍し、蒸留水で半球をすすぎます。 注：ほとんどのIBPSは、水中で安定ではなく、適切な緩衝液（ すなわち、50mMトリス-HCl、pHが8または50 mMの重炭酸アンモニウム、pHを8）を解凍処理（約1mL / 2時間）の間、定期的に追加する必要があります。氷の半球は、アルミホイルで包み、前解凍に-20℃で保存することができます。 </li><li>氷の半球はまだ含まれている場合sの顔料は、またはサンプル精製を高めるために、繰り返しが8.1から8.5に2-3回を繰り返します。 注：IBPの濃度は、精製の複数回以下の低くてもよいが、精製されたサンプルはMSを用いて分析される場合、純度が収率よりも価値があります。十分な材料が使用可能である場合、アイスアフィニティ精製の3ラウンドをお勧めします。 </li></ol> IBPS 9.識別<ol><li> IBPSを氷半球の解凍以下大量に含まれているので、サンプルを濃縮します。小さなタンパク質の損失を回避するために、3,000 Daの分子量カットオフを有する遠心濃縮管を用い〜1-3 mLに組織の〜100グラムを含むサンプルを濃縮しました。 </li><li> MSのためのサンプルを送信する前に、このようなBCAやBradfordアッセイのようなタンパク質定量アッセイを用いてタンパク質濃度を決定します。そのようなSDS-PAGE等の電気泳動によってサンプルの純度を推定します。 SEへ前IRI活性の精製タンパク質を試験活性タンパク質は、精製および濃縮工程を経て保持されていることを確認するために、MSのためnding。 </li><li>質量分析10のために直接濃縮サンプルを使用します。 </li></ol>

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著者は、開示することは何もありません。

IBPの分析および精製を成功させるためには、これらのタンパク質のいくつかの温度感受性を理解することが重要である。特定の植物IBPは、0℃以上の温度では不安定になり、アンフォールディング、沈殿および不活性が生じる。活性なIBPを得るためには、植物を低温室（〜4℃）で処理し、実験中に試料を氷上に置くことがしばしば重要である。全細胞粗溶解物を使用する場合に考慮すべきもう一つの要因は、内因性プロテアーゼによるタンパク質の分解である。植物において、IBPの発現は一般的に低く、したがってタンパク質収量の損失は、将来の実験または分析に不十分な物質をもたらす可能性がある。信頼性の高いプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加することで、タンパク質抽出中に迅速に作業することで、このようなタンパク質の損失を減らすことができます。さらに、低温馴化期間は、実験室で成長させたIBPの最大蓄積について最適化することが重要である植物。 IBPSでの作業別の一般的な問題は、アッセイの多くは温度と湿度に敏感であるということです。 IRIの分析に関しては、顕微鏡カバースライド上の水分の蓄積は、氷の結晶の可視化を困難に氷の層...

アイス結合タンパク質（IBPS）は、植物1、昆虫2、魚3、および微生物4を含む多くの生物で発見されている保護タンパク質の多様なファミリーです。これらのタンパク質の重要な特徴は、特異的かつ効率的に彼らの成長を修正、氷の結晶に吸着する独自の機能です。 IBPSは、いくつかの文書のプロパティを持つ2つの最もよく特徴付けられる熱ヒステリシス（TH）と氷再結晶化阻害（IRI）を有します。 TH活動がより容易に凍結不寛容な動物で生産さIBPSで観察されます。凍結を防ぐために、生物の循環又は間質液の凝固点の低下のこの活性は、結果。これとは対照的に、必然的に氷点下の温度で凍結する凍結耐性の生物では、IBPSが低いTH活性を有すると思われます。低TH活動にもかかわらず、高IRIの活動は、氷の叫びを制限しますスタル成長は、多くの場合、これらのタンパク質で観察されます。凍結耐性の生物の場合、このIRIの活動は、おそらく外区画中の氷の制御不能な成長から細胞を保護するのに役立ちます。 「マットレスボタン」モデルはIBPS氷結晶5の成長を防止するメカニズムを説明するために使用することができます。このモデルでは、IBPSは、具体的には水分子のみバウンドIBPSの間の空間に成長する氷の結晶格子と組み込むことができるように、間隔を置いて氷結晶表面に吸着します。これは、追加の水の分子の取り込みが不利になり、曲率、ギブズ-トムソン効果6によって説明することができるイベントを作成します。アンカー包接水仮説は、氷の結晶の表面にIBPSの特異的結合のための機構を提供することにより、REO中の特異的にタンパク質氷結合部位に位置する荷電残基の存在は、結果水分子のrganizationので、氷の結晶格子7の一つ以上の面を一致させます。 TH活性は、溶融の間の差を測定し、IBPの存在下で単氷結晶の温度を凍結することによって定量することができます。 TH活性はIBPS、（程度の典型的には一部のみ）植物IBPSによって生成ローTHギャップの活性を評価する広く受け入れられている方法であるが、通常は、高タンパク質濃度、特殊な装置やオペレータの経験を必要とします。非IBPS氷結晶成長を制限することができるが、それはすべてのIBPSによって共有性であり、したがって、IRI活性について試験することは、特に低TH活性を有するものについて、IBPSの存在のために有効な初期画面です。この活性を試験するために使用される方法は、タンパク質試料がフラッシュするかどうかを決定するための時間の期間にわたって観察される小さな氷結晶の単分子層を生成するために凍結させる「スプラットアッセイ」として知られています氷の結晶の成長が制限されています。 IBPSの存在のソース組織試料をスクリーニングするために使用される他の方法とは異なり、この技術は10〜100 ngの範囲で低タンパク質濃度にも適用することが、容易に製作装置を利用し、迅速かつ容易に解釈されるデータを生成します。しかし、このアッセイはTHの決意と氷晶成形によって従うべきIBPSの初期画面を提供することを強調することが重要です。 天然タンパク質の単離は、多くの場合、目的のタンパク質の構造的および生化学的特性に関する情報を必要とする、困難です。氷のためのIBPSの親和性は、精製目的のための基質として氷を使用して、これらのタンパク質の単離を可能にします。分子の大部分は、大quantitを欠いて、氷の結晶の成長、高度に精製された試料中のIBPサンプル結果の存在下で氷半球の遅い成長中に先に氷 - 水境界に押されているのでタンパク質および溶質を汚染するIES。この方法は、昆虫8、9、10、11の細菌、魚12および植物13、14からIBPSを同定するために使用されてきました。また、この方法によって達成IBP富む画分はまた、下流の生化学的分析のために使用することができます。本稿では、タンパク質の存在、および氷アフィニティー精製を用いてタンパク質の単離を確認するIBPS、IRI活性の分析の誘導および抽出により植物におけるIBPSの識別を概説します。

<table><tbody><tr><td>1.5 mLマイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャー</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>調整可能なラボジャッキ</td><td>フィッシャー</td><td>S63080</td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップ遠心分離機</td><td>Desaga MC2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真鍮プローブ</td><td>カスタムビルド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カメラ/カメラポート</td><td>キヤノン</td><td></td><td>パワーショット SX110 デジタルカメラ; カスタムビルド顕微鏡ポート</td></tr><tr><td>チーズクロス</td><td>ピュアワイプ/フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>06-665-25A</td><td></td></tr><tr><td>濃縮チューブ (0.5 mL)</td><td>EMD ミリポア</td><td>UFC501008</td><td></td></tr><tr><td>濃度チューブ (15 mL)</td><td>EMD ミリポア</td><td>UFC900308</td><td></td></tr><tr><td>コニカル チューブ (50 mL)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM12502</td><td></td></tr><tr><td>冷却ブロック</td><td>VWR</td><td>13259</td><td>金属製の加熱ブロックを使用</td></tr><tr><td>除湿機</td><td>Whirlpool</td><td></td><td>50 pint Energy Star 除湿器; 地元のサプライヤーから購入</td></tr><tr><td>Dessciation beads</td><td>t.h.e. Dessicant/VWR</td><td>EM-DX0017-2</td><td>6-8 メッシュサイズ; 100% 解</td></tr><tr><td>剖顕微鏡</td><td>オリンパス東京</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二重壁ガラスボウル</td><td>ジェネリック</td><td></td><td>地元のラボガラス製品サプライヤーから購入</td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td>ジェネリック</td><td></td><td>地元の供給業者をご利用ください。 危険&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA-プロテアーゼ阻害剤錠剤</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>11836170001</td><td>ロシュ cOmplete ミニ</td></tr><tr><td>エチレングリコール</td><td>ジェネリック</td><td></td><td>グリーン 自動車用エチレングリコールは、地元の金物店 (すなわち ホームデポ)から購入できますヘ</td></tr><tr><td>キサン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>296090</td><td>無水、95%; 危険</td></tr><tr><td>浸漬油</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>56822</td><td></td></tr><tr><td>JA10/20遠心分離機</td><td>ベックマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>の大きいプラスチック ペトリ皿</td><td>ジェネリック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>ジェネリック</td><td></td><td>使用 ローカル供給業者; 危険&nbsp;</td></tr><tr><td>磁気攪拌板</td><td>ハンナインスツルメンツ</td><td>HI190M</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバースライド</td><td>フィッシャー</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックチューブ</td><td>ジェネリック</td><td></td><td>地元の金物店から PVCパイプを購入</td></tr><tr><td>偏光フィルム</td><td>エドモンドオプティクス</td><td>43-781</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンフォーム</td><td>ジェネリック</td><td></td><td>ポリスチレンの輸送箱から構成可能</td></tr><tr><td>Poreclain乳鉢と乳棒</td><td>フィ</td><td>ッシャーFB961</td><td></td></tr><tr><td>PVPP</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>77627</td><td>110 &micro;m粒度</td></tr><tr><td>レトルトスタンド</td><td>フィ</td><td>ッシャー12-000</td><td></td></tr><tr><td>小型攪拌子</td><td>フィ</td><td>ッシャー14-513-51</td><td></td></tr><tr><td>温度プログラムウォーターバス</td><td>VWR</td><td>13271-118</td><td></td></tr><tr><td>真空グリース</td><td>ダウ・コーニング/シグマ・アルドリッチ</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>ビニールチューブ</td><td>汎用</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

アイスアフィニティー精製を用いた氷再結晶阻害とアイソレーションの評価による植物の氷結合タンパク質の同定

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

アイス結合タンパク質（IBPS）は、氷点下の温度にさらされ、特定の生物によって合成されるストレス誘導タンパク質のファミリーに属しています。細胞外の氷の結晶が成長する際の植物では、凍結による損傷は、形質膜と可能な細胞死の破裂が生じ、発生します。氷晶のIBPSの吸着は、それによって細胞の損傷を減少させる、氷再結晶化阻害（IRI）として知られるプロセスによって、さらなる成長を制限します。 IBPSはまた、平衡融点以下の溶液の凝固点を低下させる能力、熱ヒステリシス（TH）活性として知られている特性を実証します。これらの保護特性は、産業用、医療や農業用途におけるその潜在的な使用のために小説IBPSの同定に関心を高めてきました。この論文は、1）を通じて誘導およびIBPSの抽出植物組織、2）IRI活性の抽出物のスクリーニング、および3）単離およびpurifを植物IBPSの同定を記載しますIBPSのication。低温暴露によってIBPSの誘導後、抽出物は、標準的な光学顕微鏡を使用して氷の結晶成長の観察を可能にする「スプラットアッセイ」を使用して、IRIの活性について試験されます。このアッセイは、低タンパク質濃度を必要とし、迅速に得られ、容易に氷結合活性のための初期画面を提供し、解釈された結果を生成します。 IBPSは、「アイスアフィニティ精製」と呼ばれる技術により、氷に吸着するIBPSの性質を利用して汚染タンパク質から単離することができます。植物抽出物から採取した細胞溶解物を使用して、氷の半球はゆっくりと真鍮のプローブ上に成長させることができます。これは、多結晶氷の結晶構造にIBPSが組み込まれています。 IBPのない先験的生化学的または構造的知識を必要とする、この方法は、活性タンパク質の回収を可能にします。氷精製されたタンパク質画分は、PEPの識別を含む下流の用途に使用することができます質量分析および天然タンパク質の生化学的分析によって潮配列。

セットアップを容易にするために、 図1 図2は 、それぞれ、IRI解析及び氷アフィニティー精製のために使用される機器の視覚的表現として含まれます。 IBPSとないマスタード雑草から収集した抽出物を使用して、IRI分析の結果を図3に示されています。これらの結果は、凍結耐性をされていないマスタード雑草から収集した抽出物は、IBPS存在の欠如に起因する氷の結晶の成長を制限することができなかったことを示しています。対照的に、ペレニアルライグラスからIBPSを含むトランスジェニック植物で見られる小さな氷晶は、実質的に氷の結晶の成長を制限します。 図4は、精製二ラウンド後IBPSを発現ペレニアルライグラス抽出物を使用して成長させた氷半球を示します。精製の第一ラウンドの高い後hemispheに氷エッチング表面再I...

この論文では、凍結耐性植物の氷結合タンパク質の同定について、氷再結晶阻害活性の評価とその後の氷親和性精製を用いた天然IBPの単離について概説する。

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

このプロトコルの全体的な目的は、氷結合能の検討および氷アフィニティー精製を用いた天然ペプチドの単離により、植物から新規の氷結合タンパク質（IBP）を同定することです。この手法は、植物の耐凍性、特に氷結合タンパク質に関する分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、複雑な精製方法を用いることなく、天然抽出物から氷結合タンパク質を単離できることです。装置のセットアップを概念的に把握することが困難な場合があるため、本手法の視覚的な実演は極めて重要です。まず、テキストプロトコルに記載されている通りにスプラット装置をセットアップしてください。耐凍性草本やその他の耐凍性植物種において氷結合タンパク質（IBPs）の発現を誘導するために、低光条件下、4°Cで最大1週間、植物を低温順化させます。茎の基部で切断し、1.5 mLチューブに入れることで、約0.1 gの葉組織を得ます。サンプルを直ちに液体窒素で急速凍結し、使用時まで-80 °Cで保存します。細胞を溶解させるため、液体窒素下で乳鉢と乳棒を用いて組織サンプルを微粉末状にすり潰します。ホモジナイズ工程の間、液体窒素が蒸発しないようにしてください。粉砕したサンプルを直ちに氷上に置き、液体窒素を完全に蒸発させます。その後、1 mLのネイティブタンパク質抽出バッファーを加え、ピペッティングして混ぜ合わせます。サンプルを4°Cで一晩緩やかに振盪し、以降の操作も同じ温度で行います。翌日、サンプルを約1,600 ×gで5分間遠心分離し、細胞残渣を除去します。上清（可溶性分画）を回収し、細胞残渣が残っている場合はさらに5分間遠心分離します。清澄化したサンプルは、使用時まで-20°Cで保存可能です。偏光フィルムをセットした外部チャンバーに100 mLのヘキサンを注ぎ、スライド上の水分蓄積を防ぐために乾燥剤ビーズを5〜6個加えます。次に、バスを覆うプレートに少量の真空 그리스を塗布し、ヘキサンの蒸発を防ぐため、密閉されるようしっかりとねじって固定します。実験開始の40分前に、冷却ブロックをプラスチックチューブの直下のポリスチレンボックスに配置し、ドライアイスで完全に覆います。アッセイを開始する前に、チューブが水平であることを確認してください。その後、冷却ブロック上のドライアイスを取り除きます。まず、サンプルが冷却ブロックのどこに落下するかを確認するため、この手順を水でテストしてください。オートピペットに取り付けたディスポーザブルチップを浸漬油に浸します。これにより、サンプルがピペットの外側に付着せず、落下するようになります。余分な油はペーパータオルで拭き取ってください。次に、10 µLの水を吸引します。水を放出する前に、ピペットをプラスチックチューブの真上に配置してください。水が冷却ブロックに当たると、はっきりとした「パシャッ」という音がし、氷結晶の単層が形成されます。次に、水で決定したドロップマークの上にガラス製顕微鏡カバーガラスを配置します。アッセイを開始する直前に光源を点灯させ、ガラスチャンバーの底に形成された氷をかき出します。その後、水と同様にサンプルを用いてスプラットアッセイを行い、サンプル10 µLをカバーガラス上に滴下して、氷結晶の単層を作成します。ピンセットを使用して、コールドブロックから顕微鏡スライドを迅速かつ慎重に取り出し、偏光フィルム上のヘキサンバスに配置します。顕微鏡で観察しながら、顕微鏡スライドを視野に入れ、直交ニコル下で氷結晶が高コントラストで可視化されるように対物レンズを調整します。顕微鏡にカメラを取り付け、設定をマクロに調整して氷結晶を鮮明に可視化し、画像を撮影します。すべてのサンプルについてこれらの手順を繰り返します。通常、異なるサンプルを入れたスライドを最大6枚までヘキサンチャンバーに配置します。完了したら、光源をオフにします。次に、ヘキサンバスの上にプラスチックプレートを置き、密閉して、氷結晶を一晩アニールさせます。インキュベーション後、前と同様に氷膜の画像を撮影します。前述と同様に植物組織を寒冷順化させた後、粉砕したバイオマスを約100～150 g、20 mLチューブに回収します。サンプルを直ちに急速冷凍し、使用まで-80°Cで保存します。以前と同様にサンプルの調製を行い、葉組織の再懸濁には1:1の比率を用います。内因性プロテアーゼによるIBPの分解を防ぐため、プロテアーゼ阻害剤タブレットを追加してください。細胞のデブリを除去するため、溶解液を2層のチーズクロスで3回ろ過します。4℃で30,000 ×gで40分間遠心分離し、デブリをペレット化します。その後、ネイティブタンパク質抽出バッファーを用いてサンプルの液量を120 mLまで増やし、氷結合活性の低下を防ぐため、直ちに氷親和性精製に使用してください。アイスフィンガーを-0.5 °Cまで冷却した後、冷たい蒸留水を入れた50 mLチューブに浸します。氷の核形成を促進するために砕氷を少量加え、フィンガー上に薄い氷の層を形成させます。この工程には通常20分から30分かかります。小型のマグネチックスターラーバーを入れた150 mLのガラスビーカーにサンプルを入れ、それをマグネチックスターラー上のポリスチレン容器に設置します。アイスフィンガーが中心に位置し、液体サンプルの中に少なくとも半分まで浸かっていることを確認してください。その後、容器を密閉します。プログラムを約2日間走らせ、24時間ごとに確認します。サンプルの50%が凍結したら、プログラムを停止します。IBPが氷の半球に組み込まれると、アイスエッチングが生じます。氷の半球を除去するには、プローブを4°Cまで温めます。次に、未結合のタンパク質を除去するために、半球を蒸留水で洗浄し、4°Cで解凍します。氷の半球にまだ色素が含まれている場合、またはサンプルの純度を高める場合は、精製ステップを2〜3回繰り返します。ここに示されているのは、IBPsを含まないバッファーコントロールから採取した抽出液と、IBPsを含まない野生型Arabidopsis thalianaからの抽出液です。18時間後、バッファーコントロールおよびA.thaliana抽出液では氷結晶の成長を抑制できません。対照的に、寒冷順化させたLolium perenne由来のIBPsを発現する形質転換A.thalianaの抽出液で見られる小さな氷結晶は、氷結晶の成長を大幅に抑制しています。1回目の精製後、半球表面に高度なアイスエッチングが見られることは、IBPが氷に吸着し、氷結晶の成長を修飾したことを示しています。さらなる溶質、色素、および不純物タンパク質を除去するために、2回目の氷親和性精製を行い、より透明な氷の半球を得ました。この手順に続き、ナノリットル浸透圧計を用いて氷の形状と熱ヒステリシスを評価することで、氷結合タンパク質のさらなる特性解析が行えます。さらに、ペプチド配列を特定するために、分離した分画を質量分析に供することができます。

identification-plant-ice-binding-proteins-through-assessment-ice

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ここでは、出芽酵母でのタンパク質複合体を識別するための新しい定量的プロテオミクスの手法を説明します。本研究では、我々は、高い特異性でERタンパク質、Scs2pの結合パートナーを同定するためにタンデム質量分析が続くアフィニティー精製と一緒にSILACメソッドを使用している。...

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

また、不凍タンパク質として知られている氷結合タンパク質（IBPS）は、氷の成長を阻害し、組織の凍結保存に使用するための有望な添加剤です。...

アイス結合タンパク質の調査用のLabVIEWオペ新規ナノリッター浸透圧計

ここでは植物性タンパク質複合体の精製および特性評価のためのプロトコルを記述します。私たちは、複雑な内部に単一のタンパク質を免疫沈降によって、私たちはその翻訳後修飾とその相互作用パートナーを識別できることを実証している。...

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

不凍タンパク質(AFP)は、氷の特定の平面に結合して、氷の成長を防ぐか、または遅くします。蛍光ベースの氷面親和性(FIPA)分析は、AFP結合した氷面の決定のためのオリジナルの氷エッチング法の改変である。AFPは蛍光標識され、巨視的な単氷結晶に組み込まれ、UV光下で可視化されます。...

蛍光ベースの氷面アフィニティーによる不凍タンパク質の氷結合平面の決定

このプロトコルは、アフィニティ キャピラリー電気泳動キャピラリー電気泳動と荷電配位子の高速バインド スクリーニングによる蛋白質のサンプルの特性を兼ね備えています。天然変性タンパク質などの柔軟な構造を持つタンパク質は、異なる conformers...

AtHIRD11 本質的な障害とキャピラリー電気泳動と親和性キャピラリー電気泳動による金属イオンへの結合の解析

Biolayer 干渉計、等温滴定型熱量計、x...

糖タンパク質 x 線結晶構造解析および生物物理学的手法によって、免疫グロブリンフォールドのキャラクタリゼーション

彼らは生きた細胞から分泌される、単一ラベルのない蛋白質のリアルタイム光検出のためのプロトコルを提案します。これは干渉散乱 (iSCAT) 顕微鏡は、様々...

無料のラベル画像の単一蛋白質細胞から分泌される生活 iSCAT 顕微鏡を介して

このプロトコルは、イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドに結合するタンパク質の同定に焦点を当てています。これは、アガロースまたは磁気ビーズにストレプトアビジンを介して固定化されたバイオチン化イノシトールリン酸塩またはリンオイノシチドとの親和性クロマトグラフィーを使用しています。イノシトールリン酸塩またはホスオイノシチド結合タンパク質は、ウェスタンブロッティングまたは質量分析によって同定される。...

アフィニティクロマトグラフィーによるインノシトールリン酸塩またはホスホイノシチド相互作用タンパク質の同定

ここで説明する近接標識法は、ニコチアナベンタミアナ葉組織におけるNLR免疫受容体のTIRドメインの相互作用パートナーの同定のための方法である。また、ニコティアナおよび他の植物種におけるこの技術を用いて、関心のある他のタンパク質間の相互作用を同定するための詳細なプロトコルも提供される。...

タンパク質相互作用ネットワークのインプランタ同定のためのTurboIDベースの近接標識

本稿では、マイクロシードを用いてI3C(5-アミノ-2,4,6-トリヨードイソフタル酸)で誘導体化したタンパク質結晶を生成し、まばらなマトリックススクリーンで新しい結晶化条件を生成する方法を紹介します。トレイは液体分配ロボットを使用して、または手で設定することができます。...

ランダムマイクロシードマトリックススクリーニングによるI3Cによるタンパク質結晶の誘導体化

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植物におけるタンパク質間相互作用のためのAirIDベースの近接標識

学ぶ アイスアフィニティー精製を用いて耐寒性植物から氷結合タンパク質を同定する方法。氷再結晶阻害活性を評価し、複雑な精製工程なしで天然抽出物からIBPsを単離できます。

アイスアフィニティー精製を用いた氷再結晶阻害とアイソレーションの評価による植物の氷結合タンパク質の同定

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