アイスアフィニティー精製を用いた氷再結晶阻害とアイソレーションの評価による植物の氷結合タンパク質の同定

このプロトコルの全体的な目標は、アイス結合活性を試験し、アイスアフィニティー精製を使用して天然ペプチドを単離することにより、植物から新規のアイス結合タンパク質またはIBPを同定することです。この方法は、植物の凍結耐性、特に氷結合タンパク質の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、複雑な精製方法を使用せずに、天然抽出物から氷結合タンパク質を単離できることです。

この方法は、装置のセットアップを概念化するのが難しい場合があるため、視覚的なデモンストレーションが重要です。このプロトコルは、テキストプロトコルで説明されているように、splat装置のセットアップから開始します。凍結耐性のあるイネ科植物種やその他の凍結耐性植物種において、氷結合タンパク質(IBP)の発現を誘導するために、植物を低温で摂氏4度まで1週間、低照度条件下で低温順応させます。

茎の付け根を切ってから1.5ミリリットルのチューブに入れることにより、約0.1グラムの葉組織を入手します。サンプルを直ちに液体窒素で急速凍結し、使用するまで摂氏マイナス80度で保存します。細胞を溶解するには、液体窒素下で乳鉢と乳棒を使用して組織サンプルを微粉末に粉砕します。

均質化プロセス中に液体窒素が蒸発しないようにしてください。すぐに地上サンプルを氷の上に置き、液体窒素を完全に蒸発させます。次に、1ミリリットルの天然タンパク質抽出バッファーとピペットを加えて混合します。

サンプルを摂氏4度で一晩静かに振とうし、残りのステップを同じ温度で行います。翌日、サンプルを約1,600倍のGで5分間遠心分離することにより、細胞の破片を除去します。可溶性画分を保持し、細胞の破片が持続する場合はさらに5分間遠心分離します。

清澄化されたサンプルは、使用するまでマイナス20°Cで保存することができます。偏光フィルムをセットした外部チャンバーに100ミリリットルのヘキサンを注ぎ、スライドに水分が蓄積しないように5〜6個の乾燥ビーズを追加します。次に、バスを覆うプレートに少量の真空グリースを追加し、ねじってしっかりと密閉し、ヘキサンの蒸発を防ぎます。

実験開始の40分前に、プラスチックチューブの真下にあるポリスチレンボックスに冷却ブロックを置き、ドライアイスで完全に覆います。アッセイを開始する前に、チューブが水平であることを確認してください。次に、コールドブロックの上部からドライアイスを取り出します。

まず、この手順を水でテストして、サンプルが冷却ブロックのどこに落下するかを決定します。自動ピペットに貼り付けた使い捨てチップを浸漬油に浸すと、サンプルがピペットの外側に付着するのではなく落下します。ペーパータオルを使用して、余分な油分を取り除きます。

次に、10マイクロリットルの水を吸引します。水を放出する前に、ピペットをプラスチックチューブの真上に置きます。水が冷却ブロックに当たると、はっきりとしたスプラット音が聞こえ、氷の結晶の単層が形成されます。

次に、水で決定されたドロップマークにガラス顕微鏡カバースライドを置きます。アッセイを開始する直前に、光源をオンにし、ガラスチャンバーの底に形成された氷をこすり落とします。次に、水の場合と同様に、サンプルを使用してスプラットアッセイを実行し、サンプルの10マイクロリットルをガラスカバースライドに放出して、氷の結晶の単層を作成します。

ピンセットを使用して顕微鏡スライドをコールドブロックから迅速かつ慎重に取り外し、偏光フィルムの上のヘキサン浴に置きます。顕微鏡の下を見て、顕微鏡のスライドを視野に入れ、対物レンズを調整して、交差偏光によって高コントラストの氷結晶を視覚化できるようにします。カメラを顕微鏡に取り付け、設定をマクロに調整して、氷の結晶を鮮明に視覚化し、画像をキャプチャできるようにします。

すべてのサンプルについて、これらの手順を繰り返します。通常、ヘキサンチャンバーに異なるサンプルを含む最大6枚のスライドを配置します。終了したら、光源をオフにしてください。

次に、ヘキサン浴の上にプラスチックプレートを置き、しっかりと密閉し、氷の結晶を一晩アニールします。インキュベーション後、前回と同様に氷膜の画像を撮影します。前回と同様に植物組織を冷順化させた後、20ミリリットルのチューブに約100〜150gの粉砕バイオマスを採取します。

サンプルはすぐに急速冷凍し、マイナス80°Cに保ってから使用してください。前回と同様に、葉組織の再懸濁のために1対1の比率を使用してサンプルを調製します。内因性プロテアーゼによるIBPの分解を避けるために、追加のプロテアーゼ阻害剤錠剤を使用してください。.

細胞の破片を取り除くには、2層のチーズクロスで溶解物を3回ふるいにかけます。30, 000倍Gで40分間摂氏4度で遠心分離することにより、破片をペレット化します。次に、天然のタンパク質抽出バッファーを使用してサンプルの量を120ミリリットルに増やし、ライサードをすぐにアイスアフィニティー精製に使用して、アイス結合活性の損失を回避します。

アイスフィンガーをマイナス0.5°Cに冷却した後、冷たい蒸留水が入った50ミリリットルのチューブに浸します。氷の核形成を促進し、指に氷の薄い層が形成されるように、いくつかの氷片を追加します。このプロセスには通常20分から30分かかります。

サンプルを小さなマグネチックスターバーが入った150ミリリットルのガラスビーカーに入れ、マグネチックスターラーの上にあるポリスチレン容器に入れます。アイスフィンガーが中央に配置され、液体サンプルの少なくとも半分まで下がっていることを確認してください。次に、容器を密封します。

プログラムを約 2 日間実行し、24 時間ごとにチェックします。サンプルの50%が凍結したら、プログラムを停止します。IBPを氷の半球に組み込むと、氷のエッチングが発生します。

氷の半球を取り除くには、プローブを摂氏4度に温めます。次に、半球を蒸留水ですすいで未結合のタンパク質を取り除き、摂氏4度で解凍します。氷の半球にまだ顔料が含まれている場合、またはサンプルの精製を増やすために、精製手順を2〜3回繰り返します。

ここに示されているのは、IBPを欠くバッファーコントロールから収集された抽出物と、IBPを含まない野生型シロイヌナズナからの抽出物です。18時間後、バッファーコントロールとA.thaliana抽出物は氷の結晶成長を制限できなくなります。対照的に、低温順応Lolium perenneからIBPを発現するトランスジェニックA.thalianaの抽出物で見られる小さな氷の結晶は、氷の結晶の成長を大幅に制限します。

最初の精製ラウンドの後、半球表面の高度の氷エッチングは、IBPが氷に吸着し、氷の結晶の成長を変化させたことを示しています。追加の溶質、色素、および汚染タンパク質を除去するために、2回目の氷親和性が使用され、氷の半球がより透明になりました。この手順に続いて、氷結合タンパク質をさらに特徴付けるために、ナノリットル浸透圧計を使用して氷の形成と熱ヒステリシスを評価できます。

さらに、単離されたフラクションを質量分析に送って、ペプチド配列を同定することができます。