フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

この実験の全体的な目的は、マウスのタモキシフェン誘導性運命マッピングシステムとフローサイトメトリーを用いて、生体内の卵黄嚢造血前駆細胞およびその子孫細胞を特性評価することです。これにより、造血幹細胞とは異なる造血前駆細胞の発達と分化に関する、免疫学分野における重要な疑問への回答に寄与することが期待されます。本手法の主な利点は、限られた時間枠内で標識された造血前駆細胞と、組織常在性マクロファージなどの子孫細胞を、発生期から成体期にかけて追跡・モニタリングできる点にあります。

一般的に、この方法に不慣れな方は、胚組織における細胞数の多さと、同時に処理するサンプルの量の多さに苦労します。実験を開始するには、まず、摘出したマウスの子宮角を、約30 mLの氷冷PBSを満たした10 mmのペトリ皿に移します。その後すぐに、子宮角の頸管側で子宮筋層を掴み、筋層と脱落膜組織の間に細いハサミを滑り込ませて、胚を放出させます。

次に、精密ピンセットを用いてライヒタ膜を取り除き、胎盤を除去します。卵黄嚢を慎重に剥離し、0.5 millilitersの消化液を満たした24-weld組織培養プレートに移します。臍帯血管および卵黄動静脈を切断した後、直ちに胚を2 millilitersの10 millimolar氷冷EDTAを満たした12-weld組織培養プレートに移します。

鋭い微細剪刀を用いて胚から頭部を切り離した後、体と頭部を氷上で10～15分間インキュベートし、胚を取り出して血液を含むEDTAを回収します。次に、胚を包んでいる羊膜を除去します。その後、胚から後肢および異所性肢を除去します。

精密ピンセットを用いて胸腔を開きます。次に、心臓の前方を把持し、別のピンセットで内臓を体から切り離しながら、組織をそっと牽引します。解剖顕微鏡下で、胎児肝臓を心臓および腸から分離します。

その後、器官を0.5 millilitersの消化液を満たした24ウェルプレートに移します。胎児肝臓を同定するには、心血管系との解剖学的接続を確認することが重要です。胎児肝臓はこの発生段階にあり、胚が若ければ若いほど、解剖はより困難になります。

初代細胞懸濁液を調製するために、採取した臓器を消化液に入れ、37 °Cで30分間インキュベートします。酵素溶液中の組織を、1 mLのFACSバッファーを満たした6ウェル組織培養プレートの1ウェル上に設置した10 µmストレーナーに載せます。2 mmシリンジの黒色ゴムピストンを用いて、組織を穏やかに押し潰すように解離させ、単一細胞懸濁液を得ます。

次に、パストールピペットで細胞懸濁液を吸引し、15 mLチューブに移します。懸濁液を4 °C、320 ×gで7分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引して廃棄します。

次に、新鮮なFcブロッキングバッファーを調製し、ペレットを60 µLで再懸濁します。その後、単一細胞懸濁液50 µLを96ウェル丸底プレートのウェルに分注します。プレートを氷上で少なくとも15分間インキュベートします。

次に、懸濁液の残りの10 µLを5 mLポリスチレンFACSチューブに移し、異なる組織に由来するサンプルのプールを作成します。各フルオロクロムのFMOコントロール用に、このプールの50 µLを96ウェルプレートに移します。抗原表面染色の手順に進むため、6種類のフルオロクロム抗体セットを用いて、抗体溶液とFACSバッファーを調製します。

次に、FMOコントロール染色に使用する6種類の抗体溶液とFACSバッファーを準備します。その後、96ウェルプレート内のサンプルに抗体溶液を50 µLずつ加えます。緩やかなダブルピペッティングでサンプルを混合し、プレートを氷上で30分間インキュベートします。

96ウェルプレートを4°Cで320×gで7分間遠心分離し、上清を除去します。200 µLのFACSバッファーで細胞を洗浄し、もう一度プレートを遠心分離します。プレートを反転させて上清を除去する際は、細心の注意を払ってください。

細胞が剥がれるのを防ぐため、96ウェルプレートを手首を鋭く一度だけ動かして反転させる必要があります。最後に、70 µm ストレーナーを用いて、組織およびコントロールサンプルを6 mm ポリスチレンチューブにろ過します。これでフローサイトメトリー分析を実施できます。

非赤血球系の生細胞単一細胞集団を用いて、前駆細胞マーカーであるkitおよび造血細胞マーカーであるCD45の発現を解析した。標的集団内において、KIT陽性CD45陰性、KIT陽性CD45低発現、およびKIT陰性CD45陽性の3つの異なる細胞サブポピュレーションが区別された。

卵黄嚢のkit陽性前駆細胞において、CD45陰性およびCD45低発現の細胞集団の両方に、黄色蛍光タンパク質（YFP）を発現するAA4.1陽性細胞が含まれており、これは未熟なKIT陽性前駆細胞がCD45の発現に関わらず、まずAA4.1を発現することを示している。肝臓および脳におけるAA4.1陽性かつYFP陽性の細胞は、KIT陽性CD45低発現の前駆細胞集団にのみ認められ、これらは卵黄嚢前駆細胞に由来して循環している前駆細胞である可能性が極めて高い。マクロファージはkit陰性CD45陽性の集団に見られ、F480 bright CD11 B陽性細胞として同定された。

卵黄嚢、肝臓、および脳内のマクロファージは、単回の4-hydroxy tamoxifen投与によって効率的に標識されており、これはそれらがENP由来であることを示唆しています。この手順に習熟すれば、適切に実施することで細胞の分離と染色は3〜4時間で完了できます。この手順を行う際は、サンプルを採取した直後から常に氷上に保持することが重要です。

新鮮なFACSバッファーは毎日調製し、ろ過してください。この手順に従い、Rosa MTMGやRosa confettiなどの他のmashレポーター株またはflux株を使用することで、ラベル後の細胞の脱分化およびプロト相のポテンシャルに関するさらなる疑問を検討することが可能です。