Name: フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぶ マウス胚の卵黄嚢造血前駆細胞とその子孫の同定法。フローサイトメトリーとタモキシフェン誘導運命マッピング系を用いて、組織定着マクロファージの発生と分化を追跡し、免疫学における造血前駆細胞の理解を深める。

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著者たちはFrederic Geissmann教授とChristian Schulz教授に洞察力のある議論に感謝します。博士ハナ・ガーナー博士は原稿を批評的に読むために、Xavier Montagutelli博士とJean Jaubert博士と、動物飼育支援のためのInstitut Pasteur動物施設の職員、 Amgen ScholarのPascal DardenneとVytaute Boreikaiteは、技術的な支援をしています。 EGP研究所での研究は、パスツール研究所、CNRS、Cercle FSER（FRM、Institut PasteurおよびREVIVEコンソーシアムからの出発パッケージです.LIはREVIVEコンソーシアムのPhDフェローシップの支援を受けています。

動物手順は、Institut Pasteur（CETEA）の認可された機関による動物介護および使用委員会に従って実施された。 CSF1R MeriCreMer ローザ LSL-YFP胚における子宮内パルス標識で 1 <ol><li> 4-ヒドロキシタモキシフェンのストック溶液（OH-TAM、50mg / mL）を調製する。 <ol><li>煙霧の下で、OH-TAMの25mgバイアルを開き、250μLのエタノール（100％）を加える。 </li><li> OH-TAM溶液を先端が切り取られた2mLのマイクロ遠心管に移し、最大速度で10分間ボルテックスする。 </li><li>ソニケーター浴中で30分間超音波処理する。 </li><li> 50mg / mLのストック溶液を得るために、ヒュームドゥの下で250μLのPEG-35ヒマシ油を添加する。 注：PEG-35ヒマシ油は、疎水性分子を結合し、それらを水性溶媒に可溶化する両親媒性特性を有する溶媒である。 </li><li>ボルテックスで約5分間超音波処理浴中で最高速度で30分間超音波処理する。 </li><li>アリコートマイクロ遠心チューブあたり90μL（4.5mg）（注射1アリコート）。 </li><li>前述の13のように、4℃で1週間または-20℃で長期間保存してください。 </li></ol></li><li> プロゲステロン（10mg / mL）の原液を調製し、 <ol><li> 100mgのエタノール250μLを25mgのプロゲステロンに加えて、煙霧の下で10mg /100μLの懸濁液を調製する。やさしくボルテックス。 </li><li>ボンベの下に10mg / mlのプロゲステロン溶液を作るために2250μLのオートクレーブされたヒマワリ油を加える。 </li><li>最高速度で約5分間ボルテックスし、4℃で保存します。解決策は保存されたときに明確であることに注意してください。 </li></ol></li><li> タモキシフェン投与 注：胚形成は​​、胚プラグ形成日を胚の日（E）0.5とみなして推定した。組換えは、E8.5での単回注射によって誘導される妊娠したCsf1r MeriCreMer女性 12 。タモキシフェン投与後の中絶率を低下させるために、プロゲステロン1gあたり37.5μgのOH-TAMを補給する。午後1時に注入する（午前中に観察される膣栓用）。 <ol><li>注射の朝、10分間（または完全に再懸濁するまで）OH-TAM溶液のアリコートを超音波処理する。 </li><li>煙霧の下で360μLのNaCl 0.9％を加えて10mg / mLのOH-TAM溶液を得、完全に渦流する。溶液が透明になり、完全に再懸濁するまで超音波処理する（少なくとも30分）。 </li><li>プロゲステロンを室温まで予熱する。 </li><li> 450μLのOH-TAMと225μLのプロゲステロンをマイクロ遠心チューブに混合する。ボルテックス。 </li><li>少なくとも10分間超音波処理し、25G針を有する1mLシリンジに負荷する。 </li><li>動物施設では、妊娠している女性を体重測定する（ Csf1r MeriCreMerメスは近親交配FVB遺伝的背景にあり、典型的な体重は25および33g）。 </li><li>計算した体積をゆっくりとマウスに注入して腹腔内注射を行う。針を抜いた後、穿刺傷を静かに押し、腹部をマッサージしてOH-TAMを分配する。 注：OH-TAM注射用量は75mg / kgであり、プロゲステロン用量は37.5mg / kgである。 表1は、妊娠した雌に注入する量を示す 。 </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>マウスの体重（g） </td><td>ミックスから注入する総量（μL） </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 281 </td></tr><tr><td> 26 </td><td> 292 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 303 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 315 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 326 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 338 </td></tr><tr><td> 31 </td><td> 348 </td></tr><tr><td> 32 </td><td> 360 </td> &lt;/ tr&gt; <tr><td> 33 </td><td> 371 </td></tr><tr><td> 34 </td><td> 382 </td></tr><tr><td> 35 </td><td> 394 </td></tr></tbody></table> 表1：4-OH-タモキシフェン（OH-TAM）の注射容量。プロゲステロン1gあたり37.5μgを補充したOH-TAM（体重1g当たり75μg）のE8.5での単回注射に必要な容量。 2.卵黄サック（YS）および胎児肝（FL）の解剖注：長期培養に使用される場合を除いて、胚を操作する場合、厳密な無菌技術は必要ありません。それにもかかわらず、作業領域は清潔で、吸収紙の下に箔で覆われていなければならない。 <ol><li>氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）および消化混合物（1mg / mLコラゲナーゼD、100U / mLデオキシリボヌクレアーゼI（DNase I）および3％ウシ胎児血清を含有するPBS）を調製する。 </li><li>妊娠した女性を屠殺する所要の妊娠日（ 例えば、胚段階E10.5）での大脳の脱臼。 </li><li>性器のちょうどの皮膚にピンチをはさみ、はさみで正中線に小さな切り口を作ってください。毛皮を使わずに体の壁を完全に露出させるために、肌を頭の方に引き寄せます。腹部の筋肉を切って内臓を露出させ、腸を押して2つの子宮角を露出させる。 </li><li>中型の鈍い鉗子で、卵巣に付着した脂肪パッドをつかみ、静かに子宮を引きます。子宮角の子宮頸部レベルで切断し、ホーンを腹腔から持ち上げます。脂肪パッドを外して子宮角を完全に解放し、両側の卵巣から角を切る。 </li><li> 10ミリリットルのペトリ皿に氷冷PBSにホーンを入れてください。急速に一方の端（子宮頸部の端）に子宮筋層をつかみ、筋層と脱落膜組織の間に細かいハサミをスライドさせて、周囲の脱落膜組織で胚を解放する。 注：筋肉は急速に収縮する傾向があります抽出のために、このステップはできるだけ速くなければなりません。 </li><li> Reichertの膜と胎盤を切断するために1組の細かい鉗子を使用してください。 </li><li> ゆっくりと卵黄嚢を取り出し、消化混合物0.5mLを含む24ウェル組織培養プレートに入れる。 注：この段階で、胚の血液を収集することができます。 <ol><li>臍および卵管を切断した直後に、胚を10mMの氷冷エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む12ウェル組織培養プレートに移す。鮮明なはさみを使って胚を断頭し、できるだけ組織を細かくすることを制限しようとする。氷上で10〜15分間インキュベートし、血液を含むEDTAを収集する。 </li></ol></li><li>胚周囲の羊膜を除去する。 </li><li>ステージ&lt;E11.5の場合、より良い胚のステージングおよびより良い時間分解能（各体節ペアは約1時間30分以内に発生する）のために体節ペアの数を数えます。 </li><li>胚の頭を切る鉗子や細かいはさみ。 0.5 mLの消化混合物を含む24ウェルプレートにヘッドを移す。 注：後期の神経外胚葉および脳を、フローサイトメトリー分析のためにさらに解剖する。注意深く周囲の血管叢を取り除く。 </li><li>後肢の上の胚を切断し、前肢を除去する。 </li><li> 肝臓を隔離するには、細かい鉗子のペアを使用して胸郭を開きます。心臓に前方にピンチし、体から器官を解放するために2番目の鉗子を使用しながら静かに引っ張りなさい。 <ol><li>心臓と腸から胎児の肝臓を慎重に分離します。胎児の肝臓を、0.5mLの消化混合物を含む24ウェルプレートに移す。解剖顕微鏡下で転送を注意深く監視する。 </li></ol></li><li>ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ（PCR）によって遺伝子型決定のために尾部（または他の胚部分）を収集する。 注：フローサイトメトリーを用いた類似の分析のために、他の組織および器官をE10.5胚から採取することができる。ブラッドヘッドスキー大動脈 - 生殖腺 - 中腎症領域（AGM）、心臓および神経外胚葉をE10.5で収集することができる。後の段階で、肺、腎臓、脾臓および膵臓も採取することができる。異なる発達段階でのAGMの解剖の詳細な説明は、以前に記載されている14 。 </li></ol>フローサイトメトリー用の胚組織の処理<ol><li> 37℃で30分間、消化混合物中に置かれた器官をインキュベートする。 </li><li> FACSバッファー（0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および1mM PBS中の2mM EDTA）6mlで満たした6ウェル組織培養プレートに入れた100μmのストレーナーに組織および酵素溶液を移す。 2mLシリンジの黒いゴム製のピストンを静かにつぶして機械的に解離させ、単一細胞懸濁液を得る。 注：これ以降、すべてのステップは4℃で実施する必要があります。 </li><li>パスツールピペットで細胞懸濁液を収集し、15mLチューブに移す。 </li><li> Spi4℃で320×gで7分間インキュベートした。上清を吸引により捨てる。 </li><li> ペレットを60μLのFcブロッキングバッファー（FACSバッファーで1/50に希釈したCD16 / CD32ブロッキング抗体）に再懸濁する。 <ol><li>丸底96マルチウエルプレートに1ウェル当たり50μLの単一細胞懸濁液を移す。氷上で少なくとも15分間インキュベートする。 注：少量のサンプルを取り扱う場合は、5 mLポリスチレンFACSチューブで染色を行うこともできます。 </li><li>残りの10μLを5mLポリスチレンFACSチューブに移し、各組織からサンプルのプールを得る。このプールはコントロール（ すなわち、染色されていないサンプルおよび各蛍光色素の蛍光マイナス1（FMO）コントロール）として機能します。各蛍光マイナス1（FMO）コントロール（蛍光色素1つにつき1つ）あたり50μLのプールを96マルチウェルプレートに移す。 注：各FMOコントロールには、抗体パネルのすべての蛍光色素結合抗体が含まれていますが、それは測定されている。 FMOは、ゲート境界を識別し、マルチカラーパネルのスペクトル重なりを制御するために使用されます。異なる組織間のバックグラウンドおよび自己蛍光の変動に正確に対処するためには、各組織のサンプルプールからこれらの対照を調製することが重要である。 YFP発現のための適切なコントロールは、Cre遺伝子欠損胚由来の試料であり、これはPCR遺伝子型決定によって確認される。 </li></ol></li></ol>表面抗原染色<ol><li> 抗体混合物をFACS緩衝液中で調製する（表2）。 1サンプルにつき50μLの抗体混合物を調製する。 <ol><li>次の蛍光色素結合抗体を使用してください：抗CD45.2（クローン104）;抗CD11b（クローンM1 / 70）;抗F4 / 80（クローンBM8）。抗AA4.1（クローンAA4.1）;抗Kit（クローン2B8）;および抗Ter119（クローンTer119）。 </li><li> FACSバッファー中のFMOコントロール用に6つの抗体ミックスを調製する。コントロールサンプルあたり50μLの抗体ミックスを調製する。 NOTE：抗体混合物中の抗体希釈液は、材料表に示された最終濃度より2倍濃縮されています。 6つの蛍光色素結合抗体を有するパネルについては、6つのFMOコントロールが準備される。 表2は、1つのチューブに対する抗体混合物およびFMO対照の組成を示す 。 </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="7">抗体の体積（μL）（最終体積50μL） </td></tr><tr><td>抗体</td><td>クローン</td><td>抗体混合物</td><td> FMO CD45.2 </td><td> FMO CD11b </td><td> FMO F4 / 80 </td><td> FMO AA4.1 </td><td> FMOキット</td><td> FMO Ter119 </td></tr><tr><td>抗CD45.2 </td><td> 104 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td>抗CD11b </td><td> M1 / 70 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td>抗F4 / 80 </td><td> BM8 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td>抗AA4.1 </td><td> AA4.1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td>アンチキット</td><td> 2B8 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td>抗Ter119 </td><td> Ter119 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="2"> FACSバッファー</td><td> 45.5 </td><td> 46.5 </td><td> 46 </td><td> 46.5 </td><td> 46.5 </td><td> 46 </td><td> 46 </td></tr></tbody></table>表2：染色に使用する抗体の量とFluorescent-1（FMO）のコントロール。最終容量50μLに必要な抗体の容量（μL）。 <ol start="2"><li>抗体混合物50μLを96-マルチウェルプレート中の試料に加える（染色中の最終体積は100μLである）。ゆっくりと2回上下にピペットし、氷上で30分間インキュベートする。 </li><li> 96-マルチウェルプレートを4分間320xgで7分間スピンし、上清を捨てる。 200μLのFACS緩衝液に再懸濁する。 </li><li> 150μLのFACSバッファーで2回洗浄操作（ステップ4.3）を2回繰り返します。 </li><li>サンプルおよびコントロール（FMOおよび未染色プールサンプル）を、70μmのストレーナーを通して5mlのポリスチレンチューブに濾過する。取得まで氷上に保管してください。 </li></ol>フローサイトメトリーによるEMPおよびYS由来マクロファージの同定注：このプロトコールは、4レーザーフローサイトメーターイク405nmの紫色レーザー、488nmの青色レーザー、562nmの黄色レーザー、および638nmの赤色レーザーを使用しています。 <ol><li>製造元の指示に従って結合した各抗体の補償ビーズを調製する。レーザー強度を最適化するために、染色されていないサンプルと補正ビーズを使用してください。 </li><li>ゲート境界を特定するには、各抗体のFMO（Fluorescence-Minus One）コントロールを使用します。 </li><li>死細胞を排除するために、採取の1分前に1μLのDAPI（1mg / ml）をチューブ（200μLの染色された細胞懸濁液を含む）に加える。強いDAPI信号と前方散乱パラメータ（FSC）を使用して、死んだ細胞や残骸を排除します。 注：フローサイトメーターのソフトウェアを使用して、取得中にゲートを描きます。補償マトリクスおよび分析は、市販の他のソフトウェアを用いてサンプルを取得した後に行うことができる。 </li><li>合計イベントから生細胞および二重識別を行うために、前方散乱および側方散乱（FSC対SSC）を用いる。 </li><li>まず、赤血球（Ter119 + ）を除外し、前駆細胞（Kit + ）と造血細胞（CD45 + Kit neg ）を同定するために、娘細胞ゲノムを樹立するためにログスケール軸に蛍光ドットプロットを作成する（ 図1参照）。 </li><li>蛍光ヒストグラムを作成して、YS（ 図2 ）、胎児肝臓（ 図3 ）および脳（ 図4 ）における異なる同定された集団間のYFPの標識効率を定量化する。 </li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。

造血前駆細胞の異なる波は、時間的枠内で部分的に重複するため、免疫細胞に対する発達造血の各波の寄与を分析することは、技術的に非常に困難です。 タモキシフェン誘導性Creシステムは、時間的に誘導性の様式で特定の細胞にタグを付け、 エクスビボまたはインビトロの培養または移植を必要とせずに、胚または成体で系統分析を行う機会を提供する。タモキシフェン誘導性Cre株では、細菌性Creリコンビナーゼとヒトエストロゲン受容体のリガンド結合ドメイン（CRE-ER）の突然変異型との間、または改善された単一点突然変異体Creと2つのマウスエストロゲン受容体の間に融合遺伝子が作製される（Mer-iCre-Mer）。 Creのエストロゲン受容体との融合は、Hsp90によるCreの細胞質の隔離をもたらし、それによって核のCre媒介組換えを防止する。タモキシフェン（TAM）はthによって代謝されるe-肝臓を4-ヒドロキシタモキシフェン（OH-TAM）、エストロゲン受容体に対する結合親和性の高い活性代謝物に変換する。融合CreへのOH-TAM結合は、Hsp90との相互作用の破壊...

発達中の骨髄系子孫が成人期にとどまる造血前駆細胞のいくつかの連続するが重複する波が存在する。まず、単能性「プリミティブ」前駆体は、E7.5、E8.25間のマウス卵黄嚢1,2に出現し、任意の単球の中間ことなく、胚性マクロファージを生じます。原始前駆細胞に由来するマクロファージが、小膠細胞として成人の脳に存続するかどうかは、活発な研究の対象である。第二に、E8.5の卵黄嚢にErythro-Myeloid Precursors（EMPs）が生じ、血流に入り、胚を定着させる。 EMPはRUNX1依存性内皮への造血転移3、4における卵黄嚢造血内皮から出てきます。 EMPは卵黄嚢内のマクロファージに分化することができるが、それらはまた、胚の日（E）9 5から胎児肝をコロニー化し、赤血球、巨核球、マクロファージ、単球顆粒球および肥満細胞に分化する6 。 EMP由来のマクロファージは、発達および成人組織において増殖能力を示す。非常に少ないが、その分化経路7、8について知られているようEMP-由来のマクロファージが分化の単球の段階をバイパスするかどうかはまだ議論の余地があります。最後に、造血幹細胞（HSC）は、大動脈 - 生殖腺 - 中胚葉領域から適切な胚内のE10.5に出現し、胎児の肝臓に移動する。長期再増殖能を有するHSCは、E11（42体節ペア段階）の後にのみ検出される9 。そこでは、最終的な造血が出生後の生活の間、血液細胞産生の優勢な部位になる骨髄に移行し始めるまで、それらは拡大してE12.5と区別される10 。 spこれらの胚性造血前駆細胞の波の特定の寄与を区別する能力をこれまで妨げていた。 EMPおよびHSCの両方がRunx1依存的に産生され、転写因子Mybおよび増殖因子受容体Csf1r（コロニー刺激因子1受容体、マクロファージコロニー刺激因子受容体としても知られる）を発現するが、EMPは、 インビトロおよびインビボのリンパ電位の欠如、それらの長期再増殖能の欠如および系譜マーカーSca-1 11の表面発現の欠如により、HSCが減少した。遺伝的運命マッピングモデルは、細胞特異的かつ時間特異的な方法で胚性前駆細胞を標的とすることができるため、マクロファージの個体発生を特徴づけるために必要とされる。ここでは、2つの系統を区別するために実験所で使用されている運命マッピングプロトコールを提示するほとんどの成人組織に見出されるマクロファージ：HSC由来の浸潤マクロファージおよびHSC非依存性の常在マクロファージ。 組織常在性マクロファージはCSF1R 12サイトカイン受容体を発現するMybの非依存性前駆細胞に遡ると3つの相補性運命マッピング戦略6を用いて、E8.5-E10.5で胚中に存在しているされています。胎児HSCを標識せずに卵黄嚢造血を研究するために、改良されたCreリコンビナーゼおよび2つのマウスエストロゲン受容体（Mer-iCre-Mer）のタ​​モキシフェン誘導性融合タンパク質を発現するトランスジェニック株Csf1r MeriCreMerを使用するCsf1rプロモーター。したがって、Creリコンビナーゼは、限られた時間枠の間にCsf1r発現細胞において活性である。 lox-STOP-loxカセット（ Rosa26 LSL-eYFP ）の下流に蛍光タンパク質を含むレポーター株と一緒に使用すると、誘導の時点で存在する細胞の遺伝的標識化だけでなく、それらの子孫の遺伝的標識化も含む。卵黄嚢単能性「原始」前駆細胞または胎児性HSCを標識せずに、活性形態のタモキシフェン、4-ヒドロキシタモキシフェン（OH-TAM）、EMPおよびマクロファージを標識したE8.5での投与。これにより、我々は、胚発達中のEMPおよびその子孫の免疫表現型を特徴付けるとともに、卵黄嚢由来マクロファージの成体マクロファージプールへの寄与を評価した。原始前駆細胞由来のマクロファージもまた、このアプローチを用いて標識されているかどうか、およびそれらが成体マクロファージプールに寄与できるかどうかを特徴付けるために、さらなる研究が必要である。

<table><tbody><tr><td>#5ストレート鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>MC19 / Bパスケフウルフスプリングはさみ&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15371-92</td><td></td></tr><tr><td>8.5 cm ストレートハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウスキット-PE (クローン 2B8)</td><td>BD Pharmingen</td><td></td><td>553355 1/200 希釈 FACs バッファー</td></tr><tr><td>アンチマウス CD45.2 APC-Cy7 (クローン 104)</td><td>ソニー</td><td>1149120</td><td>1/100 希釈 FACs バッファー</td></tr><tr><td>アンチマウス AA4.1-APC (CD93, クローン AA4.1)</td><td>eBioscience</td><td>17-5892</td><td>FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119)</td><td>Biolegend</td><td>560512</td><td>1/200 dilution in FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>123137</td><td>1/100 dilution in FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70)</td><td>BD Pharmingen</td><td>552850</td><td>1/200 dilution in FACs Buffer</td></tr><tr><td>抗マウス CD16/CD32 (マウス BD Fc ブロック、クローン 2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Fischer Scientific</td><td>12559069</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Fischer Scientific</td><td>11570506</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼ I</td><td>Σ</td><td>D4527-20KU</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル組織培養プレート</td><td>ダッチャー ドミニク</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12ウェル組織培養プレート</td><td>ダッチャー ドミニク</td><td>353224</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル組織培養プレート</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td><td></td>ック 11874235 <td></td></tr><tr><td>96ウェル U字型底部組織培養プレート</td><td>Dutscher Dominique 353227</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;シリンジプラスチパック2mL&nbsp;</td><td>ダッチャードミニク</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>ナイロングリッド100&マイクロ;mセルス</td><td>トレーナーDutscher Dominique</td><td>352360</td><td></td></tr>ナイロン<tr><td>グリッド70&マイクロ;m細胞ス</td><td>トレーナーDutscher Dominique</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>15 mlファルコンチューブ</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Stericup GPミリポアろ過キット、0.2 &mu;m</td><td>Dutscher Dominique</td><td>51246</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Σ</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>(Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg</td><td></td> ΣH7904-25MG <td></td><td>タモキシフェンとその誘導体を準備し、使用する際には、特別な注意を払う必要があります。常に適切な個人用保護具</td></tr><tr><td>を使用してください</td><td>プロゲステロン</td><td>Sigma P3972</td><td>常に適切な個人用保護具を使用してください</td></tr><tr><td>PEG-35 ひまし油 (Kolliphor/Cremophor EL)</td> <td>Sigma</td><td>C5135</td><td></td></tr><tr><td>ひまわり油</td><td>Sigma</td><td>S5007-250ML</td><td></td></tr><tr><td>エタノール&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>24103-1L-R-D</td><td>常に適切な個人用保護具を使用し、ヒュームフードの下で使用</td></tr>してください <tr><td>EDTA</td><td>シグマ</td><td>E9884-500G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI、1 ML (水中で 1 MG/ML)</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>10116287</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 フロー サイトメーター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>B75408</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX デイリー QC フルオロスフィア</td><td>ベックマン・コールター&nbsp;</td><td>B53230</td><td></td></tr><tr><td>VersaComp 抗体キャプチャービーズキット (2x5 mL)</td><td>ベックマン・コールター&nbsp;</td><td>B22804</td><td></td></tr><tr><td>FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J</td><td>ジャクソン研究所</td><td>19098</td><td></td></tr><tr><td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td><td>ジャクソン研究所</td><td>6148</td><td></td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

マクロファージは、免疫系の本来の腕に由来する専門的な食細胞である。定常状態では、成人組織において固着したマクロファージが感染および組織損傷の最前線のセンチネルとして働く。他の免疫細胞は、骨髄に位置する造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）から連続的に再生されるが、常在性マクロファージとして知られている系譜は、骨髄HSPCからの入力なしに組織内で自己維持されることが示されている。この系統は、脳におけるミクログリア、肝臓におけるクッパー細胞、および表皮におけるランゲルハンス細胞によって例示される。腸および結腸層固有層は、HSPC非依存性常在マクロファージを欠いている唯一の成人組織である。最近の研究では、常在マクロファージが、胎児造血幹細胞（HSC）とは異なる前駆細胞からの胚性卵黄造血に由来することが確認されている。卵黄嚢の確定的な造血、e赤血球系前駆細胞（EMP）は、赤血球系細胞および骨髄系細胞、特に常在性マクロファージを生じる。 EMPは、E8.5とE10.5の発達の間の卵黄嚢内でのみ産生され、循環が連結すると早期に胎児肝臓に移動し、少なくともE16.5まで拡大して分化する。彼らの子孫は赤血球、マクロファージ、好中球および肥満細胞を含むが、EMP由来マクロファージのみが成人期まで組織内に存続する。 EMP出現の一時的性質およびHSC世代との時間的重複は、これらの前駆体の分析を困難にする。我々は、フローサイトメトリーによってインビボで EMPおよびEMP由来細胞を特徴付けるために、マクロファージサイトカイン受容体Csf1rプロモーターの発現に基づくタモキシフェン誘導性運命マッピングプロトコールを確立した。

遺伝的運命のマッピングは、Rosa26-LSL-eYFPレポーターを保有するオスと交尾したCsf1r-Mer-iCre-MerメスへのOH-TAMのE8.5での投与によって達成された。 OH-TAMの存在下では、停止カセットの切除は、 Csf1rを発現する細胞においてYFPの永続的発現を導く 。我々は、E10.5の胚から2つの造血組織：卵黄嚢および胎児肝臓および非造血組織、神経外胚葉を集めた。単一細胞懸濁液は、酵素的および機械的解離によって得られ、サンプルは、蛍光結合抗体で染色した後、フローサイトメトリーによって分析した。死細胞および二重線を排除した後、単一細胞懸濁液を分析した（ 図1 ）。すべてのゲートは、Fluorescence Minus One（FMO）コントロールを使用して定義した。分析の明瞭性を向上させるために、赤血球排除（Ter119 +細胞）も実施することが推奨される（ 図1B </strong&gt;）。細胞表面マーカーKit（前...

浸潤しているマクロファージは、循環前駆細胞から成体組織に継続的に動員されるが、常在マクロファージは発達中に組織を播種し、前駆細胞からのさらなる入力なしに維持される。常在マクロファージの前駆細胞は最近同定された。ここでは、常在性マクロファージ前駆細胞の遺伝子運命マッピングのための方法を提示する。

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

この実験の全体的な目的は、マウスのタモキシフェン誘導性運命マッピングシステムとフローサイトメトリーを用いて、生体内の卵黄嚢造血前駆細胞およびその子孫細胞を特性評価することです。これにより、造血幹細胞とは異なる造血前駆細胞の発達と分化に関する、免疫学分野における重要な疑問への回答に寄与することが期待されます。本手法の主な利点は、限られた時間枠内で標識された造血前駆細胞と、組織常在性マクロファージなどの子孫細胞を、発生期から成体期にかけて追跡・モニタリングできる点にあります。一般的に、この方法に不慣れな方は、胚組織における細胞数の多さと、同時に処理するサンプルの量の多さに苦労します。実験を開始するには、まず、摘出したマウスの子宮角を、約30 mLの氷冷PBSを満たした10 mmのペトリ皿に移します。その後すぐに、子宮角の頸管側で子宮筋層を掴み、筋層と脱落膜組織の間に細いハサミを滑り込ませて、胚を放出させます。次に、精密ピンセットを用いてライヒタ膜を取り除き、胎盤を除去します。卵黄嚢を慎重に剥離し、0.5 millilitersの消化液を満たした24-weld組織培養プレートに移します。臍帯血管および卵黄動静脈を切断した後、直ちに胚を2 millilitersの10 millimolar氷冷EDTAを満たした12-weld組織培養プレートに移します。鋭い微細剪刀を用いて胚から頭部を切り離した後、体と頭部を氷上で10～15分間インキュベートし、胚を取り出して血液を含むEDTAを回収します。次に、胚を包んでいる羊膜を除去します。その後、胚から後肢および異所性肢を除去します。精密ピンセットを用いて胸腔を開きます。次に、心臓の前方を把持し、別のピンセットで内臓を体から切り離しながら、組織をそっと牽引します。解剖顕微鏡下で、胎児肝臓を心臓および腸から分離します。その後、器官を0.5 millilitersの消化液を満たした24ウェルプレートに移します。胎児肝臓を同定するには、心血管系との解剖学的接続を確認することが重要です。胎児肝臓はこの発生段階にあり、胚が若ければ若いほど、解剖はより困難になります。初代細胞懸濁液を調製するために、採取した臓器を消化液に入れ、37 °Cで30分間インキュベートします。酵素溶液中の組織を、1 mLのFACSバッファーを満たした6ウェル組織培養プレートの1ウェル上に設置した10 µmストレーナーに載せます。2 mmシリンジの黒色ゴムピストンを用いて、組織を穏やかに押し潰すように解離させ、単一細胞懸濁液を得ます。次に、パストールピペットで細胞懸濁液を吸引し、15 mLチューブに移します。懸濁液を4 °C、320 ×gで7分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引して廃棄します。次に、新鮮なFcブロッキングバッファーを調製し、ペレットを60 µLで

identification-erythromyeloid-progenitors-their-progeny-mouse-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

直接収穫したてのマウスの骨髄、脾臓や胎児の肝臓における分化段階特異的マウス赤血球前駆細胞と前駆体の同定と分子解析のためのフローサイトメトリー法。アッセイは、細胞表面マーカーCD71、TER119、およびセルサイズに依存しています。...

CD71/TER119フローサイトメトリーアッセイを用いてマウス赤血球前駆細胞の同定と解析

フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit...

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

この議定書は、赤芽球摘出プロセスの可視化を提供し、フローサイトメトリーマルチスペクトルイメージングフローによりオルソ赤芽球を除核の集団を同定する新規な方法を説明します。...

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる除核イベントにおけるマウス赤芽球亜集団エンリッチの同定

識別し、並べ替え (MAC および FACS) 蛍光と磁気の組み合わせを使ってマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の 6 のサブセットを分離する方法を示します。このプロトコルは、体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化)、養子の転送実験生体内RNA ・...

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

ここでは、フローサイトメトリーによる腹膜、脾臓、および骨髄組織におけるマウス免疫B細胞区画の不均一性の単純な分析について説明する。プロトコルは、他のマウス組織に適応し、拡張することができます。...

マウスB細胞の発達におけるフロー細胞量測定

ここでは、マウス骨髄細胞を表現型造血幹および前駆細胞に単離および染色するための簡単なプロトコルと、支持するニッチ内皮および間葉系幹細胞について説明します。内膜および中枢骨髄領域に位置する細胞を濃縮する方法も含まれる。...

マウス骨髄造血幹・前駆細胞および間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析

ここでは、初期バースト形成ユニット赤血球(BFU-e)およびコロニー形成ユニット赤血球(CFU-e)前駆細胞を新鮮なマウス骨髄および脾臓から直接前向きに単離するための新しいフローサイトメトリー法について説明します。単一細胞トランスクリプトームデータに基づいて開発されたこのプロトコルは、組織のすべての赤血球前駆細胞を高純度で分離した最初のプロトコルです。...

フローサイトメトリーによるマウス組織からのバースト形成ユニットおよびコロニー形成ユニット赤血球前駆細胞の同定と単離(英語)

この記事では、胸腺沈降前駆細胞を特徴づけるためのin vivoおよびin vitroの方法論について、そのT細胞子孫の世代数、表現型、および数の動態を分析することによって説明しています。...

胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ

ここでは、心臓と筋肉の前駆細胞とその微小環境の生物学を研究するための咽頭弓の培養プロトコルを提示します。...

咽頭アーチのex vivo培養は、ハートと筋前駆細胞とそのニッチを研究します

フローサイトメトリーを用いたマウス精子細胞の選別戦略を記述します。精子細胞は、円形(精子形成ステップ1-9)、早期伸長(精子形成ステップ10-12)、後期伸長(精子形成ステップ13-14)、細長い精子細胞(精子形成ステップ15-16)の4つの高純度集団に分類されます。DNAの染色、サイズ、および顆粒度が選択パラメータとして使用されます。...

フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

学ぶ マウス胚の卵黄嚢造血前駆細胞とその子孫の同定法。フローサイトメトリーとタモキシフェン誘導運命マッピング系を用いて、組織定着マクロファージの発生と分化を追跡し、免疫学における造血前駆細胞の理解を深める。

フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

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