ゼブラフィッシュにおけるPseudocapillaria のキリ、マイコバクテリウム属、アエロモナス サルモニシダ環境スクリーニング

このサンプリング技術の全体的な目標は、健康モニタリングに使用される魚の数を減らし、検疫で輸入品をスクリーニングする場合を含め、病原体検出の回転率、コスト、感度を最適化することです。この手法は、避難コロニーの健康法を定義するのに役立ちます。この方法は、治療効率を読んだり評価したりする際に便利なツールです。

この手法の主な利点の1つは、検疫中の輸入品のスクリーニングとトリアージです。これは、水生施設のバイオセキュリティ計画を強化します。プロトコルを開始するには、再循環システムからきれいな8リットルのタンクをセットします。

サンプから供給される約8リットルの水でタンクを満たします。システムからバイオメディアの2つのセラミックビーズまたはスポンジキューブをスクリーニングに追加します。次に、施設内の優勢な遺伝的背景の野生型の魚を使用して、1リットルあたりダニオレリオを行うために1つを追加します。たとえば、A B.少なくとも6匹の魚を選択します。

一日一回魚に餌をやります。ゼブラフィッシュ施設で使用されるすべての食事に歩哨がさらされるように、食事を変えてください。水の交換を行うには、バイオメディア中のセンチネルを一時的なタンクに移します。

センチネルタンクを完全に空にして清掃します。センチネルタンクにサンプ水のみを補充し、センチネルとバイオメディアを元に戻します。センチネルを4か月間サンプ水にさらした後、2-フェノキシエタノールの過剰摂取溶液に浸すなどの承認された方法で魚を安楽死させます。

死亡を確認するためには、眼蓋運動停止後10分間待ちます。鉗子で死体をつかみ、特定された容器で摂氏マイナス80度で完全に凍結します。プラスチック製のシャフトで滅菌済みの乾いた綿棒を準備し、手袋を着用します。

綿棒で拭く表面を見つけます。流れの少ないサンプ表面、水面のサンプ壁を選択し、表面への容易なアクセスを妨げるアイテムをすべて取り除きます。次に、外装を取り外して綿棒を抜き、滅菌綿の先端を空気にさらします。

サンプの壁を5〜10センチメートルにわたって綿棒で拭き取り、サンプの水面レベルで水とバイオフィルムを吸収します。次に、綿棒を覆うか、先端を滅菌遠心分離チューブに折ります。サンプルにラベルを貼り、PCR検査に送るか、マイナス80°Cで凍結します。

顕微鏡によるスラッジ分析を行うには、60ミリリットルのシリンジを使用して、サンプの底にあるスラッジを吸引します。サンプルを15ミリリットルのチューブに分割します。キャップをねじ込み、チューブにラベルを付けます。

15ミリリットルのチューブを重力の175〜250倍で、スイングバケット付きの遠心分離機で10分間遠心分離します。チューブをデカントします。デカンテーション後、沈殿物を保持します。

次に、227グラムのグラニュー糖と177ミリリットルのお湯をマグネチックスターラーで混合して、砂糖飽和溶液を準備します。チューブの半分まで砂糖飽和溶液を入れます。キャップをねじ込み、沈殿物を溶液と完全に混合します。

チューブを遠心分離機のスイングバケットに入れ、上部まで砂糖飽和溶液で満たします。各チューブの上部にカバーグラスを1つそっとセットして、砂糖飽和溶液に接触させます。各60ミリリットルのサンプルの4本のチューブは、遠心分離中にカバーガラスが落下して壊れた場合に備えていることに注意してください。

スピンが完了したら、カバーガラスを持ち上げてスライドガラスにセットし、鉛筆またはマーカーペンでスライドにラベルを付けます。カバーガラスの破損が多すぎる場合は、チューブの大部分を砂糖飽和溶液で満たし、チューブを遠心分離します。砂糖飽和溶液を上部まで満たし、カバーグラスをそっとセットして30分間待ちます。

顕微鏡で偽のcapillaria tomentosaの卵を探します。バイポーラプラグを400倍の倍率で識別します。P.tomentosaの卵のために検疫中の輸入動物をスクリーニングするには、オスとメスのDanio rerioをタンクにセットし、タンク内の産卵トレイを追加しますが、ここでは糞便を収集するために使用します。

1週間後、増殖装置を取り外し、前述したように回収した汚泥を増殖装置に回収する。タンクまたはサンプの底にあるスラッジを60ミリリットルのシリンジで吸引し、サンプルを60ミリリットルのチューブに移します。チューブをネジの上部で閉じ、チューブにラベルを付けます。

シリンジは廃棄してください。60ミリリットルのチューブを振って、15ミリリットルを15ミリリットルのチューブに移します。チューブをネジの上部で閉じ、チューブにラベルを付けます。

15ミリリットルのチューブを重力の175〜250倍で、スイングバケット付きの遠心分離機で10分間遠心分離します。チューブをデカントし、沈殿物をチューブに保持します。外装を取り外して綿棒を抜き、滅菌綿の先端を空気にさらします。

チューブ内の沈殿物を15秒間綿棒で拭きます。綿棒を裏に覆うか、先端を滅菌遠心分離チューブに折ります。サンプルにラベルを付けます。

マイナス80°Cで凍結し、PCR検査に送ってください。試験した115匹の魚のサンプスワブ法を使用して、Mycobaterium chelonaeはサンプルの5%で検出され、Mycobaterium haemophilumはサンプルの3%で検出され、特定された唯一の病原種でした。同じシステムから、49のサンプスワブから5つの菌類種の存在が明らかになりました。

オッズ比は、表面サンプスワブ技術が、ゼブラフィッシュ施設のマイコバクテリウムをスクリーニングするためにセンチネルを単独で使用する代わりに貴重な代替手段であることを示しています。環境サンプルは、魚、汚泥、表面サンプルで検出されたAeromonas親水性のスクリーニングにも使用され、提案された技術が魚のビオトープをスクリーニングする能力を裏付けています。Mycobacterium chelonae と Mycobacterium fortuitum は、魚のサンプルよりも表面のサンプスワブで PCR によってより頻繁に検出されます。

一度マスターすると、サンプリングは数分で完了し、pseudocapillaria tomentosaの卵の検出は1時間で行うことができます。この技術により、環境スクリーニングは日常的な健康モニタリングプログラムの重要な部分になります。これらの方法は、細菌のバイオフィルムと細菌感染との関係など、魚の病理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。