Name: ゼブラフィッシュにおけるPseudocapillaria のキリ、マイコバクテリウム属、アエロモナス サルモニシダ環境スクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュの病原体検出法。サンプスワブとPCRを用いてMycobacteriumやAeromonasを迅速にスクリーニングし、従来のセンチネル法より高感度で検出可能。水産バイオセキュリティの強化に貢献する。

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著者は、彼らの技術的なヘルプと重要な入力をフランシス Crick 研究所の BRF 水泳チームに感謝したいと思います。この作品は、そのコアは癌研究イギリス (FC001999)、英国の医学研究評議会 (FC001999) および Wellcome の信頼 (FC001999) から資金を受け取るフランシス Crick 研究所によって支えられました。

1 プレろ過の暴露についての循環システムの番兵します。
<ol><li>
循環システムからクリーンな 8 L タンクを設定します。サンプから水でそれを埋めます。2 セラミック ビーズを追加またはシステムから画面 (図 1) のバイオ-メディアのキューブをスポンジします。1-2 D. 学/L (すなわち、12 魚) を追加します。施設、たとえば株式会社の支配的な遺伝的背景の野生型魚を使用します。
	<ol>
<li>次のように少なくとも 6 魚を選択: 少なくとも 1 人の女性と 6 ヶ月以下の年齢、一人の女性と生後 18 カ月の上の 1 人の男性と 1 人の女性 6 と 18 ヶ月の間 1 人の男性の男性 1 人。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
一日一回をフィードします。(例えば、乾燥ダイエット、ブラインシュリンプ) 歩哨がゼブラフィッシュ飼育施設で使用されているすべての食事にさらされているかどうかを確認するダイエットを異なります。4 ヶ月間週に 3 回月曜日、水曜日、および金曜日、すなわち、上の水を変更します。
	<ol>
<li>水の変更を行うには、するには、一時的にタンクに歩哨とバイオ メディアを転送します。センチネル タンクを完全に空し、それをきれいに。排水水だけでセンチネル タンクを補充します。歩哨とバイオ メディアを戻します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ヶ月水を排水するため歩哨を公開します。2-フェノキシエタノール (3 mL/L) の過剰摂取溶液中浸漬などの承認された方法で魚を安楽死させます。</li>
	<li>
死を確認するためには、蓋の動きの停止後 10 分を待ちます。
	<ol>
<li>死体をピンセットでつかむし、識別されたコンテナーで-80 ° C で完全フリーズします。これは PCR12,15で使用されます。</li>
		<li>また、カット、tailat 尾柄、腹部壁をニックし、4% ホルマリンで設定。 注意: は、手袋を使用し、病理のドラフターします。サンプル容器にラベルを付けます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 排水綿棒
<ol><li>プラスチック製のシャフトで滅菌乾燥綿棒を使用します。手袋を着用します。綿棒 (水の表面に壁排水) に表面を見つけて、表面に簡単にアクセスを防止するすべての項目を削除します。低流量での排水面を選択します。</li>
	<li>
外側の包装を外して綿棒を抜くし、空気に滅菌綿棒を公開します。綿棒のクロス汚染を避けるため、テストされていない表面に触れないように注意することによって。
	<ol>
<li>サンプ壁水と排水の水表面のレベルにバイオ フィルムを吸収する 5-10 cm 以上、綿棒します。</li>
		<li>バックの綿棒をシースまたは滅菌遠心管に先端を破る。サンプルのラベルまたは PCR テストを送信する-80 ° C で凍結</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. タンクの下部にユスラウメ卵の検出
<ol><li>
顕微鏡による汚泥の分析
	<ol>
<li>60 mL シリンジ9を使用して、排水または歩哨を含む魚を保持、タンクの下部に汚泥を吸引します。15 mL チューブにサンプルを分割します。スクリュー キャップ式のチューブを閉じてチューブをラベルします。</li>
		<li>糖飽和溶液を準備 (比重 = 1.27) マグネチックスターラー14177 mL のお湯にグラニュー糖の 227 g を混合することによって。</li>
		<li>175 250 x g スイング バケツ、遠心分離機で 10 分で 15 mL チューブを遠心します。チューブをデカントし、管内の堆積物を維持します。</li>
		<li>糖飽和溶液を半管を埋めます。スクリュー トップ チューブを閉じて、ソリューションに堆積物を徹底的にミックスします。</li>
		<li>遠心分離機スイング バケツにチューブを置き、上に飽和糖溶液でそれらを埋めます。1 つのカバー ガラス各チューブの上にゆっくりと飽和糖溶液との接触を設定します。</li>
		<li>175 250 x g で 10 分いくつかのカバーのガラスが落ちると破るための遠心分離の間に、遠心分離、各 60 mL サンプルの 4 つの管です。カバーのガラスを持ち上げ、スライド ガラス上に設定。鉛筆やマーカーのペンを使ってスライドにラベルを付けます。<ol>
<li>あまりにも多くのカバー ガラス破損が発生した場合に備えて糖飽和溶液、175 250 x g で 10 分間遠心管のほとんどを埋めるため糖飽和溶液を先頭にいっぱい、カバーガラスをそっと置きます。30 分待ちます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>(図 2およびビデオ 1) 顕微鏡13 ユスラウメ卵を探します。倍率 400 ×6でバイポーラ プラグを識別します。 注: 卵のサイズは 57 78 μ m 長と 27 39 μ m 径16,17。1 つの肯定的なスライドは肯定的な宣言する 60 の mL のサンプルのために十分に注意してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
スクリーニング輸入動物検疫ユスラウメの卵のための
	<ol>
<li>タンクの男性と女性のD. 学を設定します。タンクに通常収穫が生み出された卵を保持、糞便 (図 3) を収集するためにここでそれを使用するためのデバイスを追加します。 注: たとえば、フル 1 L 飼育槽 (外部タンクとおろしの底と内側のタンク) は水没 13 リットル タンク、繁殖装置出入りする魚のための無料アクセスを許可します。</li>
		<li>1 週間後繁殖デバイスを削除し、ステップ 3.1「汚泥分析顕微鏡」で説明するように繁殖装置で回収した汚泥を収穫</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 汚泥堆積物の PCR
<ol><li>下部のタンクまたは 60 mL シリンジ9排水汚泥を吸引し、60 mL チューブにサンプルを転送します。そのスクリュー トップ チューブを閉じてチューブをラベルします。注射器を処分します。</li>
	<li>60 mL チューブを振るし、15 mL を 15 mL チューブに転送します。そのスクリュー トップ チューブを閉じてチューブをラベルします。</li>
	<li>175 250 x g スイング バケツ、遠心分離機で 10 分で 15 mL チューブを遠心します。チューブをデカント、チューブで沈殿物を保ちます。</li>
	<li>
外側の包装を外して綿棒を抜くし、空気に滅菌綿棒を公開します。綿棒のクロス汚染を避けるため、テストされていない表面に触れないように注意することによって。
	<ol>
<li>15 管内堆積物を綿棒 s。</li>
		<li>バックの綿棒をシースまたは滅菌遠心管に先端を破る。サンプルのラベル、-80 ° C で凍結し、PCR テスト送信します。 注: 45 mL 60 mL チューブ内に残ります。これは、保管できるユスラウメ卵の検出のため汚泥による顕微鏡による 3.1 の例では、PCR の結果を確認するための手順で説明するよう。汚泥の PCR は次のステップ 3.2 輸入動物をスクリーニングするために実行されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Watts, S. A., Lawrence, C., Powell, M., D'Abramo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vital+Relationship+Between+Nutrition+and+Health+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">The Vital Relationship Between Nutrition and Health in Zebrafish.</a> Zebrafish. 13, Suppl 1. 72-76 (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

重要なステップは、技術の限界とトラブルシューティングします。
年齢、性別、ひずみ、および歩哨の露出の長さが標準化されていません。これを表 1に示します。6 ヶ月、または高齢魚の以下の魚のほとんどのスクリーニングがありません。古い人口10,18,19,20で普及しているいくつかの病原体があるので若い魚に影響を与えるいくつかの病原体がある可能性があります。同様に、性別は、いくつかのレポートをいくつかの病原体21のジェンダー バイアスがあるにもかかわらずいくつかのセンチネルのグループの選択には考慮されません。提案手法は、監視する特定の病原体によるとひずみの選択肢を作ることができるがこれらの問題に対処しようと試みます。たとえば、TU がマイコバクテリウム属12,22, 検出を助けることができるが、歩哨、貯水池やディスプレイの臨床症状として作用するおそれがあります。露出の長さに関するゼブラフィッシュ国際センター10のアプローチの不十分な汚染期間見逃される可能性が病原体を検出する機会が増えます。長時間露出の必要性は、歩哨が容易に使用できないことを意味します。環境試料の添加には、いくつかの柔軟性とスクリーニング イベントの乗算ができます。たとえば、サンプリングできる各スクリーニング法の 4 ヶ月間隔で毎月場所を取る。これは、新たに導入された病原体が検出されるまでの時間の経過を減らすことができます。
環境スクリーニング技術は、環境中の病原体の検出に依存します。病原体は魚に当てる、したがってシステム水で希釈しました。水ろ過23によって病原体を取り込む可能性は探検されたないです。述べる方法病原体は魚とバイオ フィルムの検出を許可する汚染のしきい値に到達するために十分な時間を与えられている場合のみ有効であります。このテクニックの制限はサンプリング サイトの重要な選択によって最小化: 排水汚泥ではなくタンク内スラッジをサンプリングし、タンクや後のろ過ではなく、サンプの表面で水とバイオ フィルムをサンプリングします。それにもかかわらず、同じシステムからのすべてのサンプルは、同じ結果を与える可能性がありますは。ユスラウメの肯定的な結果は、別の分析 (病理、PCR、または汚泥分析) を使用して確認できます。文化または他の診断研究室、抗酸菌 PCR の肯定的な結果を確認できます。ただし、健康状態を確立し、さらにサンプル推薦される任意環境のスクリーニングから否定的な結果を確認します。
メソッドによって既存の/代替技術の意義:
ミコバクテリウム属は環境で共通、油溜めの彼らの存在は、その病原性12を想定していません。Mocho9を示した死亡率の監視が健康上の問題の開発を調査するための鍵となります。動物試料の使用は任意の獣医の調査に不可欠なままです。正常性の監視施設ですべての一般的な病原体の検出を意味し、これは環境スクリーニング技術の唯一の使用を達成することはできません。それにもかかわらず、診断ツールの感受性の欠如は、遅延したり、健康状態の正確な説明を防止することができます。歩哨の使用には、人口の一般的な微生物を検出するために必要な魚の数が減少、一方、感受性の欠如は環境スクリーニング5,23を含むメソッドの組み合わせを使用してに重量を追加します。確かにその環境と動物のサンプルはマイナス24,25をテストする必要は特定病原体フリーな状態は通常施設における種の不在で定義されます。
ミコバクテリウム属菌を識別するために排水綿棒結果では、魚のサンプルは偽否定的な健康状態につながる可能性がありますに依存する示します。6 テスト抗酸菌種説明として病原性やゼブラフィッシュ15といくつかの病原性の可能性がない塩素26として日常的に検疫で実行と卵表面の殺菌によってふるい落とされるでしょう。したがって、偽陰性にはラインを輸入して共同編集者のいくつかの影響があります。たとえば、 m. 合併した非定型だった魚サンプルの PCR による逃したが、油溜め綿棒 PCR の半分より多くはそれを検出しました。これらの抗酸菌が他と水システム27で成長する彼らの能力よりも塩素が発生しにくいことを考えると、非汚染の輸入設備のリスクです。行のインポートを許可するには、管理者を信頼し、彼らの輸出施設の健康レポートを比較する必要があります。ICLAS 性能評価プログラム28は齧歯動物では、プロセスへの鍵です。RESAMA ネットワークは、フランスD. 学11メートルの対し M. mucogenicumの検出を報告します。これらの抗酸菌は、我々 を使用する商業研究所のパネルでは提案されていません。ICLAS プログラムを拡張し、病原種29のリストと同様に、診断アッセイの調和を役に立つことと思います。
A. サルモニシダも塩素30その感受性はルーチンの卵表面の消毒中に可能性が高いその除去を動物をインポートするときに導入される可能性がある病原体です。排水、綿棒、汚泥結果環境スクリーニングをこの病原体を検出する使用ことができることを示します。ミコバクテリウム属のような他の細菌は、PCR23によって汚泥で検出されています。サンプルのこのタイプは特にもの小屋病原体の検出が可能です。たとえば、別の新しいアプリケーションは、ユスラウメの検疫における輸入魚を選別する汚泥分析です。寄生虫は、動物の健康13と腫瘍モデル16への脅威です。さらに、ルーチンのゼブラフィッシュ卵表面消毒に使用される塩素濃度は効率的な31ではありません。したがって、1 週間の売り上げ高と、魚の安楽死の輸入動物を選別する能力は、非常に魅力的なようです。この手法は、インポートの優先順位を許可することで検疫・検疫規則を影響します。意思決定プロセスは、輸出施設に蔓延している病原体、輸入魚からインポート施設10の健康状態を損なう危険性のサンプルで検出された病原体によると、設計されています。
将来のアプリケーションまたはこれらの技術を習得後の方向:
日常的隔離治療は選択されたオプションが、たとえこのような薬32,33,34,35,36の有効性は繁殖装置汚泥分析と評価できます。細菌と寄生虫の化合物をテストする環境のスクリーニングが使えるより一般的に、撲滅、魚ビオトープを含みます。環境スクリーニングの別のニッチ アプリケーションは、ライブで病原体の人口を監視37,38をフィードです。これらの技術の主要なアプリケーションは、ゼブラフィッシュ施設におけるモニタリングのための診断ツールボックスに貴重な追加としてですが。正確なコストと時間のおかげで健康状態、排水綿棒、汚泥分析の効率的な定義がセンティネル監視およびルーチンの検疫の練習に補足。これらの技術の将来は水産研究所健康レポートのルーチンの一部にです。

研究と動物福祉1,2を保護するために病原体の存在は、動物施設内で監視されます。ゼブラフィッシュ、状態監視の3,4,5,6,7,8,9,10,11 の場合しばしば分析動物死後病理、細菌文化、または分子法に依存しています。植民地動物だけをテストは、魚や低有病の病原体を検出する必要がある関連費用の数のために推奨される方法ではありません。したがって、汚染物質の高い負荷に動物の小さなグループを公開するをお勧めします。これらの魚は、プレろ過歩哨と呼ばれます。この露出ヶ月続く、それは動物介護のワークロードおよび/またはいくつかの特化したエンジニア リング ソリューションの増加を伴います。別の挑戦は、肥沃な動物は維持されるが、これは死体にルーチン試金と互換性がない検疫でインポートされた行のスクリーニングです。
我々 はここでスクリーニング水生システムの環境で (A. サルモニシダ マイコバクテリウム属とユスラウメ) 特定のゼブラフィッシュの病原体を検出するいくつかの方法について説明します。目的は、稼働状態の監視に使用される魚の数を減らすし、売り上げ高、コスト、および検出の感度を最適化します。このようなメソッドの動物の使用に代わるとスクリーニングの輸入検疫にいくつかのテクニックを適用できます。たとえば、Mocho9は (歩哨を含む)、ゼブラフィッシュではなく排水綿棒で PCR を行いより多くの病原性抗酸菌種を識別することができる、これは少ないサンプル数で得られました。浮選と顕微鏡を用いた槽汚泥をスクリーニングしてより感度とユスラウメ卵が検出された、同調査は、PCR および病理組織学的に魚をテストするのではなく。
表 1は、sentinel プログラム3,4,5,6,7,8,9,10 のさまざまな特性をまとめたものゼブラフィッシュ施設数で使用されます。プレろ過歩哨最初植民地魚タンクを通して回覧されている水を受け取るに対し、後ろ過歩哨は植民地魚と同じ方法で水を受け取る。たとえば、プレろ過歩哨は、排水の水を継続的に受けたのプロセス循環システムを設定できます。これは、1 つの部屋に多くの独立したシステムがある場合、オプションをできない場合があります。この場合、プレろ過歩哨の 1 つのタンクは、部屋全体を画面に使用できます。歩哨は、循環システムの静的なタンクとのみプレろ過水すなわち部屋内のすべてのシステムからの排水水使用して彼らの水を定期的に変更します。この手法は環境のスクリーニングの有効性との比較の基準として以下に示すです。提案のセットアップは、pH または窒素汚染の減少のような水質問題を制御する設計されています。
細菌環境スクリーニングの概念は、細菌はバイオ フィルムなどに水表面で排水の壁にある、下部タンクの汚泥検出仮説に依存します。サンプに思われる理想的なサンプリング ポイント循環養殖システム (水、糞便、飼料、および他の有機材料) は廃棄物収集からすべてタンク プレろ過から。油溜めの表面は容易に到達可能な多くの場合、拭き取りは高速で、(たとえば手袋) からサンプルのクロス汚染を避けるため無菌実行できます。コンセプトは、ゼブラフィッシュ システム9,12流行病原性抗酸菌属を識別するために使用されます。テクニックは後述し、もゼブラフィッシュ排水表面綿棒と汚泥のA. サルモニシダの検出を報告しています。
寄生虫卵の環境スクリーニング、マレーらによって検出に基づく13浮選法は、寄生虫の糞便14寄生虫卵の顕微鏡的スクリーニング定期的に使用されます。Mocho9および魚ビオトープの他の種を検出する手法が使えるサンプリング プロセスに代わるものを提案します。感染したD. 学合格ユスラウメ彼らの糞便の卵と汚泥で、タンクの底に残る寄生虫卵。そこの密度が水より大きい収集できます。卵の密度があまりにも環境のサンプルを処理する使用されます。遠心分離と最初の浮上は、重い物質から水と光の破片を分離します。2 回目の遠心分離は、管の表面に出現する寄生虫卵を許可する飽和砂糖溶液 (ユスラウメ卵の密度よりも大きい密度) に依存します。
タンクの底からユスラウメバイオ フィルム中の細菌のスクリーニングは、最初の遠心分離後に得られた底質汚泥試料のすべてのこれらの病原体のための PCR を実行することによって結合できます。これは、サンプリング時間を最適化します。メソッドを以下に示します。また、検疫のコンテキストでこれらのテクニックを使用する提案します。生きている保たれる必要が輸入のアダルト ゼブラフィッシュを画面に繁殖デバイスが検疫タンクに挿入されます。1 週間後糞便および繁殖デバイスで他の廃棄物を収集し、顕微鏡または PCR によって上映します。手法を以下に、いくつかのユスラウメの卵がこのコンテキストで顕微鏡検査によって検出されました。

<table><tbody><tr><td>アクアセド 250 mL</td><td>Vetark</td><td></td><td>2-フェノキシエタノール</td></tr><tr><td>チューブド滅菌ドライスワブ チップ</td><td>mwe</td><td>MW100</td><td>サンプ表面</td></tr><tr><td>BD Plastipak 使い捨てシリンジ 50mL エキセントリック</td><td>Becton Dickinson</td><td>300866</td><td>彼らは実際には 60 ml</td></tr><tr><td>遠心分離チューブ 15 mL コーニング</td><td>コーニング</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>Centaur 2卓上型遠心分離機、4 x 200 mL Swing&ndash;アウトローター(非密封)</td><td>三洋電</td>機<td>MSB020。CX1.5</td><td></td></tr><tr><td>カバー ガラス 22 mm x22 mm</td><td>Menzel-Glaser</td><td>MNJ-350-020H</td><td></td></tr><tr><td>プレーン スワブ 滅菌プラスチック アプリケーター レーヨン チップ付きホワイト キャップ</td><td>Sterilin Ltd サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F155CA</td><td>スラッジからのスワブ沈殿物</td></tr><tr><td>50 mL 自立型遠心分離チューブ CentriStar キャップ</td><td>コーニング</td><td>430921</td><td></td></tr><tr><td>インタンク産卵トレイセット</td><td>MBK Installations Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュにおけるpseudocapillaria のキリ、マイコバクテリウム属、アエロモナス サルモニシダ環境スクリーニング

Environmental Screening of Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp., and Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish Systems

健康監視システムを開発し、動脈分布アエロモナス サルモニシダ、マイコバクテリウム属Pseudocapillaria のキリなどの病原体に可能性があるために、ゼブラフィッシュ研究施設で使用動物の福祉と研究を損ないます。魚は通常分析事後微生物を検出します。歩哨の使用は監視の感度を改善するために、サンプリングする動物の数を減らすために推奨される方法です。循環システムからプレろ過センチネル タンクの設定を説明します。水の汚染を防ぐために、魚の人口を表す手法を開発を年齢、性別、および系統の慎重に選択。動物の最小数を使用するために環境を選別する技術は詳細も。腹部、結核菌 haemophilum、など、いくつかの流行の病原性抗酸菌種の検出を改善する表面排水綿棒にポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を使用します。結核菌 chelonae。別の環境法下部貯蔵タンクやユスラウメの卵を探すために排水の汚泥処理で構成されます。これは水中に繁殖デバイス輸入動物の保有物タンクに沈む検疫で適用することができます安価で高速な手法です。最後に、汚泥サンプルに PCR は適用は、 A. サルモニシダは油溜めの底と表面で検出します。一般に、これらの特定の病原体に適用されるこれらの環境スクリーニング技術は、プレろ過歩哨のテストと比較して感度の向上につながっています。

魚試料と比較して流行のミコバクテリウム属を識別するために油溜め綿棒の利点は、図 4の結果によってサポートされます。テスト 115 魚のM. chelonae , M. haemophilum検出されたサンプルの 3% と 5% でそれぞれ.その他の病原性抗酸菌種は確認されませんでした。同じシステムから 49 排水綿棒は、5 種の抗酸菌の存在を明らかにしました。M. chelonaeとM. 合併した非定型が検出されたことより頻繁 PCR による魚のサンプルよりも表面の油溜め綿棒で仮説とオッズ比が計算されます。これは 11 の各オッズ比の統計的に有意な (95 %ci: 29 に 4;p < 0.0001) と 306 (95 %ci: 18 に 5208;p = 0.0001)。結果は、表面排水綿棒テクニックがミコバクテリウム属のゼブラフィッシュ飼育施設の画面に歩哨の唯一の使用の貴重な代替であることを示す環境試料はまた使用されたA. サルモニシダの画面に。これらの細菌は、魚、汚泥や表面のサンプル (図 4) で検出されました。これはまた魚ビオトープを選別する提案手法の能力をサポートしています。
ユスラウメの卵を検出する汚泥分析に関する Mocho9卵が同じシステムから分析された汚泥の 93% で検出されたに対し PCR と病理組織学による魚肉の 27% で寄生虫が検出。ここでは、テクニックは、検疫審査を再現する挑戦されました。この中で、輸入動物サンプリングできず、バイオ セキュリティ管理に役立ちます、タイムリーに自分の健康状態を評価します。ユスラウメの肯定的な施設から不明な状態の魚がデバイスを繁殖 8 タンクに設定された: 16 魚/13 L タンク、7 遺伝子組換えと混在性別、野生型の 1 ラインの最大歳 4-24 ヶ月。汚泥は、デバイスから 1 週間後に収穫され、顕微鏡による分析します。ユスラウメの卵は、7 (88%) のサンプルで見られました。最後に、寄生虫の PCR 検出された排水綿棒と汚泥堆積物に試験的。4 のうち 6 汚泥試料 PCR 陽性と結果はすべて陰性であり表面の綿棒。汚泥スクリーニングがタンクの底に落ちる卵の能力に依存しているために、これは驚くべきことではありません。これはユスラウメの侵入のためD. 学水族館とメソッドがインポートされた動物のスクリーニングのために適応することができます画面に汚泥分析手法を使えることを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig1.jpg"> 図 1: 循環システムからプレろ過センチネル タンクします。8 L タンクは水とバイオ メディア システムの油溜めから画面をいっぱいに。2 つの白いセラミック バイオ メディア ビーズ (写真) の真ん中にタンクの下部に座る。12 魚は性別、ひずみ、年齢に従って選択され、センチネル タンクに追加されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig2.jpg"> 図 2: 顕微鏡による汚泥の分析中に検出されたユスラウメ卵。使用倍率は、400 X だった。矢印は、バイポーラ プラグを示します。スケールバー = 50 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig3.jpg"> 図 3: 分析のための汚泥を収集するために魚の保有物タンクに沈んでデバイスを育種します。画像の目的のためのベンチにこのタンクを設定します。それは循環システムのそれ以外の場合に設定されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55306/55306fig4.jpg"> 図 4: 魚、マイコバクテリウム属、 A. サルモニシダ、および PCR によるユスラウメの同定率表面排水綿棒と排水汚泥。割合は、各病原体種の肯定的な結果の数をテストされたサンプル数で除算によって取得されます。肯定的な結果の割合として魚、サーフェス、または汚泥サンプルの種類によって与えられるあり細菌の名前後示されます。ミコバクテリウム属菌の同定のため PCR によってテストされた 115 魚と 49 の表面排水綿棒データは、この研究の延長だから Mocho の9結果でコンパイルされます。魚がプロトコルのセクション 1 に従って主にプレろ過歩哨です。まれに、歩哨が利用できなかった場合の逃亡者と旧植民地魚 (> 18 ヶ月) サンプリングされました。ミコバクテリウム属のすべてのテストされたシステムは、魚、油溜め綿棒でテストされました。M. chelonaeとM. 合併した非定型が検出されたことより頻繁 PCR による魚のサンプルよりも表面の油溜め綿棒で仮説とオッズ比が計算されます。これは 11 の各オッズ比の統計的に有意な (95 %ci: 29 に 4;p < 0.0001) と 306 (95 %ci: 18 に 5208;p = 0.0001)。結核菌 marinumPCR のすべてのサンプルに対する否定的だった、従ってこれらの施設から欠席とみなされる、分析に含まれません。6 排水汚泥、14 の表面排水綿棒 12 魚がA. サルモニシダの存在を PCR で調べた。6 油溜めは、汚泥表面にユスラウメの存在を調べた。PCR のポリメラーゼ連鎖反応を =。CI = 信頼区間。* と * *; 統計的有意性を示すその他の比較は、統計的に有意でした。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/55306fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55306/55306vid1.jpg"> ビデオ 1: スキャンの卵ユスラウメ顕微鏡と。スライドは、3.1 の手順で説明するように、汚泥分析から取得されます。フィールドは、ユスラウメの卵を検出するスキャンされます。構造が認識されるより高い解像度で識別を確認するために拡大されます。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55306/video_scan_for_egg.avi" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>著者</td>
			<td>露出の開始時年齢します。</td>
			<td>露出の長さ</td>
			<td>サンプリング時代</td>
			<td>プリ/ポスト ろ過</td>
			<td>性別</td>
			<td>系統</td>
		</tr>
<tr>
<td>バートンら3
</td>
			<td>4 ヶ月</td>
			<td>6 ヶ月</td>
			<td>10 ヶ月</td>
			<td>プレろ過</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>ボルヘスら4
</td>
			<td>6 ヶ月</td>
			<td>6 ヶ月</td>
			<td>12 ヶ月</td>
			<td>プレろ過</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AB 野生型</td>
		</tr>
<tr>
<td>コリモアら5
</td>
			<td>できるだけ若い</td>
			<td>3 ヶ月</td>
			<td>< 6 ヶ月</td>
			<td>プレろ過</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>ガイスラーら6
</td>
			<td>4 ヶ月</td>
			<td>4 ヶ月</td>
			<td>8 ヶ月</td>
			<td>プレとポスト ろ過</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AB 野生型</td>
		</tr>
<tr>
<td>劉ら7
</td>
			<td>3 ヶ月</td>
			<td>1-6 ヶ月</td>
			<td>4-9 ヶ月</td>
			<td>プレとポスト ろ過</td>
			<td>N/A</td>
			<td>野生型</td>
		</tr>
<tr>
<td>Martinsら8
</td>
			<td>3 ヶ月</td>
			<td>3 ヶ月</td>
			<td>6 ヶ月</td>
			<td>プレろ過</td>
			<td>N/A</td>
			<td>野生型</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mocho9
</td>
			<td>< 6 ヶ月 6-12 ヶ月 > 18 ヶ月</td>
			<td>4 ヶ月</td>
			<td>7-24 ヶ月</td>
			<td>プレろ過</td>
			<td>1 女性と 1 男性 各年齢グループ</td>
			<td>AB 野生型</td>
		</tr>
<tr>
<td>マレーら10
</td>
			<td>3-4 ヶ月</td>
			<td>3ヶ月、6 ヶ月、1 年</td>
			<td>7、10、および 16 ヶ月</td>
			<td>プレとポスト ろ過</td>
			<td>N/A</td>
			<td>AB 野生型</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: ゼブラフィッシュ施設でセンチネル設定の比較。センチネル魚は、自分の年齢、性別、ひずみによると選択可能性があります。一定期間内に、公開され、前または後のろ過システムの水を受けます。2016 ゼブラフィッシュ ジャーナル3,4,5,6,7,8,9,の健康特集からコンパイル データ10。

このプロトコル説明排水綿棒の使用し、アエロモナス サルモニシダ、マイコバクテリウム属やなどの病原体を検出する歩哨の唯一の使用と比較して発見の増加につながるゼブラフィッシュにおける汚泥分析Pseudocapillaria キリ。検疫でユスラウメ卵を監視するシステムも提案する.

ゼブラフィッシュにおけるPseudocapillaria のキリ、マイコバクテリウム属、アエロモナス サルモニシダ環境スクリーニング

Health monitoring systems are developed and used in zebrafish research facilities because pathogens of Danio rerio such as Aeromonas hydrophila, ...

このサンプリング手法の全体的な目的は、健康モニタリングに使用する魚の数を減らし、検疫における輸入個体のスクリーニングを含め、病原体検出の回転率、コスト、および感度を最適化することです。この手法は、リフュージ（保護）コロニーの健康状態を定義するのに役立ちます。また、本方法は、治療効率の読み取りや評価を行う際に有用なツールとなります。この手法の主な利点の一つは、検疫における輸入個体のスクリーニングと選別が可能であることです。これにより、水産施設のバイオセキュリティ計画が強化されます。プロトコルを開始するために、循環システムから切り離した清潔な8 literの水槽を用意してください。サンプから採取した水約8Lでタンクを満たします。スクリーニング対象となるシステムから、バイオメディアのセラミックビーズまたはスポンジキューブを2個加えます。次に、施設内の主要な遺伝的背景を持つ野生型（例えばA Bなど）のDanio rerioを1Lあたり1匹の割合で投入します。少なくとも6匹の魚を選択してください。魚には1日1回給餌します。ゼブラフィッシュ施設で使用されているすべての飼料にセンチネル魚が曝露されるよう、飼料の種類を変更してください。換水を行う際は、バイオメディア内のセンチネル魚を一時的なタンクに移してください。センチネルタンクを完全に空にして洗浄します。センチネルタンクにサンプ水のみを補充し、センチネル個体とバイオメディアを戻します。センチネルを4か月間サンプ水に曝露させた後、2-phenoxyethanolの過剰投与溶液への浸漬など、承認された方法で魚を安楽死させます。鰓蓋の動きが停止してから10分待ち、死亡を確認します。ピンセットで死骸をつかみ、識別ラベルを貼った容器に入れて-80°Cで完全に凍結させます。プラスチックシャフト付きの滅菌乾燥スワブを用意し、手袋を着用してください。拭き取りを行う表面を確認します。流れの緩やかなサンプの表面、または水面のサンプ壁面を選択し、表面へのアクセスを妨げるものはすべて取り除きます。次に、外装を取り除いてスワブを鞘から出し、滅菌済みコットンチップを空気にさらします。サンプの壁面を5〜10 cmにわたってスワブし、サンプの水面レベルにある水とバイオフィルムを吸収させます。その後、スワブを鞘に戻すか、チップを折って滅菌遠心チューブに入れます。サンプルにラベルを貼り、PCR検査に送付するか、-80 °Cで冷凍保存してください。顕微鏡による汚泥分析を行うには、60 milliliterのシリンジを使用してサンプ sumpの底から汚泥を吸引します。サンプルを15 milliliterのチューブに分注します。キャップを締め、チューブにラベルを貼ります。スイングバケット式の遠心分離機を用い、15 mLチューブを175〜250 ×gで10分間遠心分離します。上清をデカンテーションで除去し、沈殿物を回収します。次に、227 gのグラニュー糖と177 mLの温水をマグネチックスターラーで混合し、糖飽和溶液を調製します。チューブの半分まで糖飽和溶液を満たします。キャップを締め、沈殿物と溶液を十分に混合させます。チューブを遠心分離機のスイングバケットに設置し、糖飽和溶液を上端まで満たします。各チューブの上にカバーガラスをそっと置き、糖飽和溶液に接触させます。60 milliliterのサンプルにつき4本のチューブを用意するのは、遠心分離中にカバーガラスが脱落して破損した場合に備えるためです。遠心分離が完了したら、カバーガラスを持ち上げてスライドガラスの上に置き、鉛筆またはマーカーペンでスライドにラベルを貼ります。カバーガラスの破損が多すぎる場合は、チューブの大部分を糖飽和溶液で満たして遠心分離してください。糖飽和溶液を上まで満たし、カバーガラスを静かにセットして30分間待ちます。顕微鏡を用いてPseudocapillaria tomentosaの卵を探します。400倍の倍率で、両極にあるプラグを確認してください。検疫中の輸入動物にP.tomentosaの卵がないかスクリーニングする場合、雄と雌のDanio rerioを水槽に入れ、水槽用産卵トレイを設置しますが、ここでは糞便を回収するために使用します。1週間後、飼育装置を取り除き、前述の方法で飼育装置内に蓄積した汚泥を回収します。タンクまたはサンプの底にある汚泥を60 mLシリンジで吸引し、サンプルを60 mLチューブに移します。チューブのスクリューキャップを閉め、チューブにラベルを貼ります。シリンジを廃棄します。60 milliliterチューブを振って混ぜ、15 millilitersを15 milliliterチューブに移します。チューブのスクリューキャップを閉め、ラベルを貼ります。スイングバケット付き遠心機を用い、15 mLチューブを175〜250 ×gで10分間遠心分離します。チューブの上澄み液を捨て、チューブ内の沈殿物を回収します。スワブの外装を取り除いて開封し、滅菌済み綿チップを空気にさらします。チューブ内の沈殿物を15秒間スワブで拭い取ります。スワブを鞘に戻すか、先端を折って滅菌遠心チューブに入れます。サンプルにラベルを貼ります。-80°Cで冷凍し、PCR検査に提出します。サンプポンプのスワブ法を用いて115匹の魚を検査した結果、サンプルの5%からMycobacterium chelonaeが、3%からMycobacterium haemophilumが検出され、これらが唯一の同定された病原種でした。また、同じシステムから採取した49件のサンプポンプスワブからは、5種のMycobacterium属菌の存在が明らかになりました。オッズ比により、表面サンプ sump スワブ法は、ゼブラフィッシュ施設における Mycobacterium のスクリーニングにおいて、センチネル魚のみを使用することに代わる有用な手法であることが示されました。また、環境サンプルを用いて Aeromonas hydrophila のスクリーニングを行ったところ、魚、汚泥、および表面サンプルから検出され、提案した手法が魚類のビオトープをスクリーニングする能力を持つことが裏付けられました。Mycobacterium chelonae および Mycobacterium fortuitum は、魚サンプルよりも表面 sump スワブを用いた PCR 法でより頻繁に検出されました。サンプリングの手法を習得すれば、わずか数分で完了し、Pseudocapillaria tomentosaの卵の検出は1時間以内に行うことができます。この手法により、環境スクリーニングを定期的な健康モニタリングプログラムの重要な一部とすることが可能です。これらの手法は、細菌バイオフィルムと細菌感染の関連性など、魚類病理学分野における重要な疑問の解決に役立ちます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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