Name: 偏光ゾーンの伝播を遮断するように並置されたイオン交換膜との間のイオン濃度分極のマージ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学ぶイオン濃度分極を用いたバイオエージェントのプレコンセントレーション法。2枚のイオン交換膜間でICPゾーンを閉じ込め、低濃度バイオマーカーの検出感度を向上させる革新的なマイクロ流体デバイスの作製と応用。

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この作業は、韓国科学技術研究院の内部基金(2E26180)と、韓国国立研究財団(NRF-2015M3A9E202888)の資金提供を受けた次世代生物医学デバイスプラットフォームプログラムによって支援されました。

陽イオン交換膜に統合されたマイクロ流体チップの1製作<ol><li> シリコンマスターの準備 <ol><li>設計シリコンマスターの二種類：陽イオン交換樹脂及びポリジメチルシロキサン（PDMS）を有するマイクロチャネルを構築するための他のパタ​​ーニングのための1つ。 注：詳細ジオメトリは、ステップ1.3.1と1.4.1で説明します。 </li><li>従来のフォトリソグラフィまたはディープ反応性イオンエッチング27のいずれかを用いてシリコンマスターを作ります。 </li><li> 30分間真空瓶にトリクロロシラン（〜30μL）とマイクロパターンシリコンマスターをSilanize。 注意：トリクロロシランは可燃性であり、急性毒性（吸入、経口摂取）を持っている自然発火性液体です。 </li></ol></li><li> PDMS鋳型の調製 <ol><li> 10に硬化剤とシリコーンエラストマーベースを混ぜる：1の比率と、この未硬化のPDMSを有するカップを置きます気泡を除去するために30分間真空瓶中の（4-のシリコンウェハ上に微細構造を複製するための30から40 mL）で。 注：シリコーンベースは、ビニル基と白金系触媒で終わるシロキサンオリゴマーが含まれています。硬化剤は、3個のケイ素-水素結合28を有するオリゴマーを架橋含ま。 </li><li>シリコンマスター上の未硬化PDMSを注ぎ、ブロアーで気泡を除去し、対流式オーブン中で2時間80℃でPDMSを治します。 </li><li>シリコンマスターから硬化PDMSを外し、適切にナイフでPDMSを形作る（ 図2a-Bに示すように、IV、形状を乗）。 </li></ol></li><li> 陽イオン交換膜をパターニング <ol><li>二つの平行なマイクロチャンネルに垂直にPDMSモールドの半分をカットし、2.0 mmの生検パンチとPDMSチャネルの両端に穴をパンチ。 注：カチオン選択性膜をパターニングするためのPDMSモールドは2パーを持っています対立マイクロチャネル（幅：100ミクロン、高さが50μm、チャネル間の距離：100ミクロン; 図1a）。金型の元の形状は、切断線に沿ってスライスした金型をミラーリングすることによって想像することができます。 L字型マイクロチャネルは重複せずに2つの穴を打ち抜くために推奨されています。 </li><li>スライドガラスとPDMSモールドテープで送風機をきれいにし、それらの間の可逆的な添付ファイルを作成するために、スライドガラス上に金型を置きます。 </li><li>マイクロパターニング技術29によれば、ステップにスライスされたチャネルの開放端にカチオン交換樹脂1.3.1のリリース〜10μL（ 図1B）。パンチ穴に注射器ヘッドを置き、プランジャ（ 図1b中の黒矢印）を引き出します。穏やかな負圧は、陽イオン交換樹脂を引っ張るし、樹脂を2つのチャネルを充填します。 注：マイクロチャネルの高さは15以上であることが推奨されます81;メートル、樹脂の高粘度は、チャネルを埋めるために高い圧力を必要とするため。パターン化されたイオン選択性膜が1μmより厚くなりますので、一方、高さが100μmを超えないことが良好です。このような厚い膜は、膜とPDMSチャンネル13との間のギャップを作成することができます。 </li><li>パターン化された樹脂に触れずにPDMSモールドを取り外し、樹脂中の溶媒を蒸発させるために95℃で5分間加熱器のスライドガラスを置きます。 注：パターン化された膜の厚さは、&lt;1ミクロンよりも通常小さいです。金型を静かにオープンエンド側（ 図1bの点線矢印）に金型を蝶番により剥離されます。これは、樹脂を充填した後、金型に1分未満をデタッチするのが最善です。金型は、数分後に取り外された場合には、より厚い膜を得ることができ、それらは毛管作用に凹形状を有するであろう。 </li><li>不要はがしカミソリの刃を持つパターン化膜の一部、分離した2つのラインパターン（ 図1c）を作ります。 注：ここで使用される陽イオン交換材料が強くガラスに接着されていないパターンを意味し、グループをペルフルオロ化しています。したがって、単純なブレーディング法は、簡単に、膜の不要な部分を削除することができます。 </li></ol></li><li> マイクロチャネルの統合と膜パターニング基板 <ol><li>マイクロチャネルの両端にある2つの穴と膜パターンがステップ1.3で作製した膜パターニング基板にPDMSチャネルを接合した後に配置される他の2穴パンチ。 注：PDMSマイクロチャネルは、1チャンネル（：50〜100μmで、高さ、幅10μm）を持っていますが、それは、隣接チャネル（ 図1D）の端部に接合されています。 </li><li> W 100と50ミリトールで40秒間、直ちに酸素プラズマ処理後の膜パターニングされた基板にPDMSマイクロチャネルを結合。 注：マイクロチャネルの中央に垂直にパターン化された膜を配置します。 </li></ol></li></ol> 2. ICP前濃縮<ol><li> 実験の準備 <ol><li> 1-100のKCl、1mMのNaClを含む、種々の試験溶液を調製し（pH約7）、1 mMのNaClおよび0.2mMの塩酸（pH約3.7）、1 mMのNaClおよび0.2mMのNaOHで（pHが混合物の混合物〜 10.3）、および1×リン酸緩衝生理食塩水。 </li><li>試験溶液に負に帯電した蛍光色素（〜1.55μM）を追加します。 注：帯電した染料は、電流30に寄与しないように、追加の色素の濃度は、塩イオン（&lt;10μM）のそれよりもはるかに低くあるべきである、31。 </li><li>チャネルの1リザーバ内の試料溶液をロードし、溶液を用いてチャネルを埋めるために、他の容器に負圧を加えます。 rで流体力学的に2つのリザーバを接続しますチャンネル（ 図2A）に沿った圧力勾配を排除する大きな液滴eleasing。 </li><li>リザーバ内のICP効果を補償するために、シリンジまたはピペットを使用して、緩衝液（1 MのKClまたは1 M​​ NaCl）で、陽イオン交換パターンに接続された2つのリザーバを充填します。 </li><li> 2パターン化膜（右に左リザーバとカソードにアノード）を横切って、貯水池でワイヤを配置し、ソース測定ユニット（ 図2a）とそれらを接続します。 </li></ol></li><li> ICP現象とICPの予備濃縮の可視化 <ol><li>倒立落射蛍光顕微鏡上のICPデバイスをロードします。電圧（0.5100 V）を印加し、ソース測定ユニットと電流応答を測定します。 </li><li>電荷結合素子カメラで蛍光画像をキャプチャし、イメージングソフトウェア32を使用して蛍光強度を解析します。 </li></ol></li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

我々は、10,000倍を実現し、製造プロトコルおよび印加電圧（0.5から100 V）、イオン強度（1-100 mM）の、およびpH（3.7から10.3）の範囲内の時空間的に定義されたプレコンセントレータのパフォーマンスを記載しています10分以内に染料やタンパク質の予備濃縮。以前のICPデバイスなど、予備濃縮性能は高い電圧でかつ低いイオン強度で良好となります。ここで検討することができますつの追加のパラメータは、2陽イオン交換膜との間の距離です。我々は、膜間の距離を大きくした場合、電界は、予備濃縮速度26の減少が得られ、同じ印加電圧下で低下します。 この研究で使用されマイクロパターニング技術29は、陽イオン交換樹脂をパターニングするための堅牢な方法であるので、マイクロ流体システムにイオン交換材料を統合するための金の標準的な方法の一つとなっています。 Nevertheless、短い膜間の距離（数百マイクロメートル未満）を有する2つの並置された陽イオン交換膜を製造することが必要です。ステップ1....

イオン濃度分極（ICP）は、イオン濃度勾配1、2と追加の電位降下を生じ、選択透過膜にイオン濃縮とイオン減少の間に生じる現象をいいます。この濃度勾配は線形であり、より高い電圧が印加されると、膜上のイオン濃度は、（レジームを限定する）がゼロに近づくまでは（オームレジーム）急になります。この拡散制限条件に、勾配（および対応するイオン流束）を最大化することが知られている/ 1を飽和させました。電圧（または電流）をさらに増加すると、この従来の理解を超えて、overlimiting電流がゾーン境界1,3の平坦空乏領域と非常にシャープな濃度勾配を用いて、観察されます。フラットゾーンは、非常に低いイオン濃度を有するが、表面伝導電気osmoti<html> C流（EOF）、及び/又は電気浸透不安定性は、イオンフラックスを促進しoverlimiting電流3、4、5を誘導します 。 6、7、8、9および/または予備濃縮をフィルタリング静電バリアが、10、11を標的とするように興味深いことに、平坦な空乏ゾーンが働きます。 （電気的中性を満足するための）荷電粒子の表面電荷をスクリーニングするイオンの不十分な量があるので、粒子は、この空乏領域を通過し、従って、その境界で整列することができません。この非線形ICP効果は、膜10、11、12、13の様々なタイプの一般的な現象であります&gt; 14およびジオメトリ6、15、16、17、18、19、20、21。研究者は、濾過6、7、8の種々のタイプを開発することができた理由は、9 非線形ICPを使用して10、11デバイスを予備濃縮。 でも、このような高い柔軟性と堅牢性と、まだ非線形ICPデバイスの動作条件を明確にする実用的な課題です。 ICPの非線形政権はすぐに陽極に向かって移動する陰イオンの変位を引き起こす陽イオン交換膜を介して、陽イオンを除去します。としてその結果は、フラットな空乏ゾーンは、ショックの伝播22を彷彿とさせるその、すぐに伝播します。マニら。このダイナミックな脱イオン（または枯渇）23に衝撃を与えると呼ばれます。指定された検知位置にターゲットを前濃縮するために、イオン欠乏ゾーンの拡大を防止することは、例えば、帯域拡張24に対してEOFまたは圧力駆動流を適用することによって、必要です。 Zangle ら。 図22は、一次元モデルでICP伝播の条件を明確にし、それは非常にように電気泳動移動度17、イオン強度18、pHを25に依存し、。これは、適切な動作条件は、試料条件に応じて変更されることを示しています。 ここでは、spatiotemp内の目標を前濃縮小説ICPプラットフォームのための詳細設計および実験プロトコルを提示します経口位置26を定義しました。イオン欠乏ゾーンの拡大は関係なく、動作時間の、割り当てられた位置に固定予備濃縮プラグを残して、イオン富化ゾーンによって印加される電圧、イオン強度、およびpHが遮断されます。この詳細なビデオプロトコルは、マイクロ流体デバイス内に陽イオン交換膜を統合すると、従来に比べて新しいICPプラットフォームの予備濃縮の性能を実証するために最も簡単な方法を示すことを意図しています。

<table><tbody><tr><td>シルガード 184 シリコーン エラストマー キット</td><td>ダウ コーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリクロロシラン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>175552</td><td>毒性</td></tr>の高い<tr><td>ナフィオン パーフルオロ樹脂、20 重量%</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td>527122</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>71394</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>60121</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 カルボン酸、スクシンイミジルエステル</td><td>Invitrogen</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>イソチオシアネート共役アルブミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9771</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水、1x</td><td>Wengene</td><td>LB004-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>荷電結合デバイスカメラ</td><td>Hamamtsu Co.</td><td>ImageEM X2</td><td></td></tr><tr><td>ソース測定ユニット</td><td>ケースレー・インスツルメンツ</td><td>2635A</td><td></td></tr><tr><td>Covance-MP</td><td>Femto Science</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

偏光ゾーンの伝播を遮断するように並置されたイオン交換膜との間のイオン濃度分極のマージ

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

イオン濃度分極（ICP）現象は、低存在量の生体試料を前濃縮するための最も有力な方法の一つです。 ICPは、荷電した生体分子（ すなわち、イオン欠乏ゾーン）用の非侵襲性の領域を誘導し、ターゲットは、この領域の境界上に予備濃縮することができます。 ICPと高い予備濃縮性能にもかかわらず、非伝播イオン欠乏ゾーンの運転条件を見出すことは困難です。この狭い動作ウィンドウを克服するために、我々は最近、時空間固定予備濃縮のための新しいプラットフォームを開発しました。イオンのみの枯渇を使用する方法を先行するとは異なり、このプラットフォームはまた、イオン欠乏ゾーンの伝播を停止するICP（ すなわち、イオン濃縮）の反対の極性を使用しています。空乏ゾーンで濃縮ゾーンに直面することで、2ゾーンが合流し、停止します。本稿では、この時空定義されたICP platfを構築するための詳細な実験プロトコルを記述しますORMと従来のものとそれらを比較することにより、新しいプラットフォームの前濃縮ダイナミクスを特徴づけます。定性的なイオン濃度プロファイルと、現在の時間応答が正常にマージされたICPおよびスタンドアローンICPとの間の異なるダイナミクスを捕捉します。のみ〜5 Vで予備濃縮の場所を修正することができ、従来とは対照的に、新しいプラットフォームは、運転条件の広い範囲内の特定の場所で目標凝縮プラグを生成することができます：電圧（0.5から100 V）、イオン強度（1-100 mM）の、およびpH（3.7から10.3）。

膜一体型マイクロ流体の予備濃縮の模式的な製造工程は、 図1に示されています。製造の詳細な説明は、プロトコルに記載されています。時空間的に定義プレコンセントレータ26のデザインやデバイスの画像は、従来の予備濃縮11（ 図2）のものと対比されます。時空定義予備濃縮でICP現象は、電流-電圧-時間応答と蛍光強度プロファイル（ 図3-4）の観点から検討しました。単一の膜プレコンセントレータ3、11とICP現象と同様に、三つの異なるレジーム（オーミック、制限、およびoverlimiting）は電流-電圧曲線で観察された：0.5〜1 V（オーミックおよび制限）と5 V（overlimiting） 。しかし、従来にない現在の回復がありました電流 - 時間曲線にイオン濃縮として...

関係なく、動作条件、ICP帯の伝播を停止することができる新規なイオン濃度分極（ICP）プラットフォームのためのプロトコルを説明します。プラットフォームのこのユニークな能力は、ICP現象の2極性があるイオン減少および濃縮を、マージを使用することにあります。

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

この実験の全体的な目的は、2枚の同一のイオン交換膜の間にイオン濃度分極（ICP）領域を閉じ込めることで、バイオ剤を濃縮することです。この手法は、センサーの検出限界を下回る低存在量のバイオ分子をどのように検出するかといった、この分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、操作条件に関わらず、非常に特定の衝突部位においてICP領域と濃縮されたバイオ剤を生成できることです。本手順を開始するには、一般的なフォトリソグラフィまたは深反応性イオンエッチングを用いて、ポリジメチルシロキサンマイクロチャネルおよびカチオン選択性膜成形用のシリコンマスターを作製します。シリコンマスターを、約30 µLのトリクロロシランと共に真空デシケーターに入れます。デシケーターを密閉し、シリコンマスターを30分間シラン化します。次に、シリコーンエラストマーベースと硬化剤を重量比10:1で混合し、未硬化のPDMSを作製します。この混合物を真空下で30分間脱泡させます。その後、脱泡した未硬化PDMSをシリコンマスター上に流し込みます。ハンドブロワーを用いてPDMSから気泡を取り除き、その後、PDMSモールドを80 °Cで2時間硬化させます。硬化したPDMSコンポーネントをシリコンマスターから剥離させます。ナイフを使用して、各コンポーネントを長方形に成形します。次に、陽イオン選択性膜のモールドのエッジから、あらかじめ作製したマイクロチャネルに向かって2本のラインをカットします。2 mmのバイオプシーパンチを使用して、各L字型チャネルの末端に穴を開けます。陽イオン交換膜モールドのマイクロマシン表面にあるガラススライドを、アクリル粘着テープとブロワーで清掃します。モールドの清潔な面をガラススライドの上に置き、モールドをスライドに可逆的に密着させます。L字型チャネルの末端に接するように、10 µLの陽イオン交換樹脂をガラススライド上に配置します。マイクロチャネルの穴の上にシリンジのチップを当て、プランジャーをゆっくりと引いて樹脂をチャネル内に引き込みます。樹脂チャネルを満たしてから1分以内に、スライド上のパターン形成済み樹脂に触れないよう注意して型を外します。溶媒を蒸発させるため、スライドを95 °Cで5分間加熱します。カチオン交換樹脂の不要な部分をカミソリで取り除き、L字型のカチオン選択性膜を作成します。次に、バイオプシーパンチを使用して、PDMSマイクロチャネルコンポーネントのあらかじめ作製したマイクロチャネルの両端に2.0 millimeterのリザーバーを穿孔します。続いて、L字型メンブレンの両端に対応する位置に、PDMSにさらに2つの穴を穿孔します。PDMSマイクロチャネルコンポーネントとメンブレンパターン基板を、100 watts、50 sで40秒間、酸素プラズマ処理します。基板の処理面をPDMSマイクロチャネルの処理面に重ね、カチオン選択性メンブレンがマイクロチャネルを横切り、PDMSの穴と一致するように配置します。デバイスの組み立てを完了させるため、必要に応じて緩やかに圧力をかけ、PDMSコンポーネントを基板に密着させます。実験を開始するために、濃度とpHが異なる複数のテスト用イオン溶液を用意します。1 Mの塩化カリウムまたは塩化ナトリウムの緩衝液を調製します。各試験溶液に、電気電流への寄与が無視できるほど十分に低い濃度になるよう、少量の陰電荷蛍光染料を加えます。最初の試験溶液をマイクロチャネルの一方のリザーバーに注入します。もう一方のマイクロチャネルリザーバーに緩やかな負圧をかけることで、溶液をマイクロチャネル内に引き込みます。チャネル内の圧力勾配を解消するため、テスト溶液の大きな液滴を両方のマイクロチャネルリザーバーに配置します。次に、ICP効果を補正するため、カチオン選択性膜リザーバーを選択した緩衝液で満たします。ICPチップを、電荷結合素子（CCD）カメラを搭載した倒立共焦点蛍光顕微鏡にセットします。左側の膜リザーバーにアノードを、右側の膜リザーバーにカソードを接続します。電極をソースメジャーユニットに接続してください。ソースメジャーユニットを用いてデバイスに電圧を印加し、電流応答を測定します。電圧印加中のチップの蛍光画像を取得します。実験後、適切なイメージングソフトウェアを用いて蛍光強度を解析します。本手法を用いてマイクロ流体プレコンセントレーターを作製し、さまざまなテスト溶液に対応する蛍光強度プロファイルの電流・電圧・時間応答を調査しました。従来の単一膜濃縮器と同様に、3つの異なる電圧領域が観察されました。オーム領域および限界領域では、カチオン選択性膜において線形の濃度勾配が形成され、約1秒後に合流しました。単一膜濃縮器とは異なり、過限界領域では、ICPゾーンが1秒未満で合流し、蛍光イメージングによって枯渇ショックが観察されました。これに対応する導電率の低下が、電流の時間応答に反映されました。その後、電流は回復しました。この現象は、限界電流以上の領域における複数の電圧で観察されました。この電流の回収は、電圧印加中に濃縮プラグを隔離する陽イオン選択性膜の間に形成されたICPゾーンによる連結輸送に起因すると考えられます。従来のICP濃縮装置では、枯渇ゾーンと濃縮プラグがマイクロチャネルに沿って自由に伝播するため、このような電流の回収は見られませんでした。時空間的に定義された濃縮装置において、イオン強度の増加や酸性度および塩基性の変化により濃縮プラグの相対強度は低下しましたが、プラグの閉じ込めは維持されていました。前濃縮に向けた追加試験により、より狭いチャネルに幅広のカチオン交換膜を用いることで、このような不利な条件下でもICP前濃縮を促進できることが示されました。この手法を習得し、適切に実施すれば、30分で完了させることが可能です。本手法の開発後、電気動力学分野の研究者がマイクロ流体システムにおける応用を探索するための道が開かれました。このビデオを視聴することで、マイクロ流体システム間にイオン交換材料を統合する方法と、このプラットフォームを用いてバイオエージェントを前濃縮する方法について深く理解できるはずです。

merging-ion-concentration-polarization-between-juxtaposed-ion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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