一次繊毛を研究するために一次ニューロスフェア培養物を使用して

この手順の全体的な目標は、初代神経幹細胞と前駆細胞のニューロスフェアベースの培養方法を利用して、初代繊毛の生合成と輸送を研究することです。この方法は、繊毛の生合成や一次繊毛への繊毛分子の輸送など、一次繊毛分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。初代神経幹細胞では、神経前駆細胞とニューロン。

この手法の主な利点は、神経幹細胞、神経前駆細胞、ニューロンの初代細胞基準を使用して、一次繊毛の文脈で生合成と毛様体経路を分析できることです。一般的に、この方法に不慣れな人は、神経幹細胞の培養が初心者にとって技術的に難しいため、苦労するでしょう。この方法のデモンストレーションは、重要なステップを観察することで、側脳室の解剖やニューロスフェアの培養、一次繊毛の定量化などのステップを簡単に学ぶことができるため、重要であることを示します。

この手順は、全マウント解剖法を使用して成体マウスから解剖した外側腹側の脳室下ゾーンから開始します。SVZを含む組織を1.5ミリリットルのチューブに入れます。PBSに500マイクロリットルの0.05%トリプシン-EDTAを加え、水浴中で摂氏37度で15分間インキュベー

インキュベーション後、500マイクロリットルの停止培地を追加し、1ミリリットルの先端を使用して20〜30回静かにピペットで動かします。ピペッティング中に気泡を形成しないようにしてください。この後、細胞をGの500倍で8分間スピンダウンします。

上清を捨て、1ミリリットルのPBSを加え、1ミリリットルの先端を使用して5回穏やかにピペッティングして細胞を再懸濁します。Gの500倍で8分間遠心分離します。次に、1ミリリットルの先端を使用して培地を吸引し、1ミリリットルの基礎培地を追加します。

細胞をカウントした後、1 SVZの細胞を10 cmの皿に10 cmの皿に10 mmのNSC培地でプレートし、5%の二酸化炭素で摂氏37度で培養します。5〜7日後、ニューロスフェアを観察できます。付着したニューロスフェアの細胞を免疫染色して解析するには、複数のニューロスフェアを含む培地1ミリリットルを1.5ミリリットルのチューブに移し、Gの500倍で8分間スピンダウンします。

培地を取り出した後、球体を4%パラホルムアルデヒドで15分間固定します。パラホルムアルデヒドを除去した後、球体を30%スクロースと一晩インキュベートします。そして、再び遠心分離します。

PBSで洗ってください。その後、前回と同様に遠心分離した後、上清を取り除いて廃棄します。次に、1ミリリットルの先端をカットしたピペットを取り付け、500マイクロリットルのOCT溶液をニューロスフェアにピペットで取り付けます。

ニューロスフィアを含むOCT溶液を使い捨てプラスチック凍結金型に移します。次に、型をドライアイスで少なくとも15分間凍結します。クライオスタットで切片を切断します。

ニューロスフェアの幹細胞を可視化するために、幹細胞マーカーNestinに対して免疫染色を行います。ニューロスフェアの一次繊毛を可視化するには、ARL13Bに対する免疫染色を行います。この実験は、接着性の解離神経幹細胞をポリ-L-リジンおよびラミニンでコーティングされたカバースリップに播種してから1〜2日後に開始します。

実験井の培地を飢餓培地に変更し、制御井戸の新鮮なNSC培地に変更します。さらに24時間インキュベートします。翌日、細胞をPBS中の4%パラホルムアルデヒドで室温で15分間固定します。

固定後、PBSで室温で5分間ずつ2回洗浄します。次に、標準的なプロトコルを使用して免疫蛍光法を実行します。カバースリップを取り付け液で取り付けます。

その後、スライドグラスを暗所で室温で一晩乾燥させます。翌日、複合顕微鏡で必要な倍率で画像を取得します。顕微鏡カメラと対物レンズは、付属のソフトウェアを使用して制御する必要があります。

0.5〜0.8ミクロン間隔で十分なz切片を取ります。接着細胞における繊毛局在の定量解析には、DAPIチャネルを表示して、コンフルエント細胞を含む3〜8つの連続したフィールドを選択します。各フィールドから大量の画像を取得します。

ImageJを使用して一次繊毛の数を定量化します。「Plugins Analyze」ダイアログボックスを開き、「Cell Counter」ツールを選択して、GPCR陽性繊毛の細胞をカウントします。カウントとエクスポートの目的で、同じ実験のすべての画像に同様の画像強度とコントラストパラメータを使用します。

解離した細胞をNSC培地または飢餓培地で培養してから24時間後、GPR161(緑)、ARL13B(赤)、DNAを青で固定し、免疫染色しました。GPR161陽性繊毛は、左側の対照細胞と右側の飢餓細胞で観察されます。これらの拡大図に見られるように。

白い矢印と矢印は、それぞれGPR161陽性と陰性の繊毛を示しています。この画像は、ARL13B陽性繊毛細胞の定量を示しています。定量化は、1つの実験の2つの技術的反復からそれぞれ2つの視野から実行されます。

ARL13B陽性繊毛細胞の割合は、飢餓時に増加します。この画像は、制御細胞および飢餓細胞におけるARL13B陽性繊毛におけるGPR161の局在化の定量化を示しています。ARL13B陽性繊毛に局在するGPR161の割合も、飢餓時に増加します。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間未満で完了できます。この手順に続いて、腫瘍発生における繊毛の役割などの追加の質問に答えるために、原発腫瘍由来細胞を培養する別の方法を実行できます。その開発後、この技術は、一次繊毛の分野の研究者が一次神経圏ベースのシステムにおける繊毛生合成と輸送を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、ニューロスフェアベースの培養物に由来する神経幹細胞、神経前駆細胞、ニューロンの一次繊毛の分析方法について十分に理解できるはずです。