Name: 3Dプリントガイドとリングスタッキング法を用いたエンジニア血管移植片のスケーリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T11:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぶ、3Dプリントガイドとリングスタッキング法を用いた血管移植片のスケーリング技術。平滑筋細胞を積層し、冠動脈寸法に合わせた様々なサイズの血管を確実に作製する方法です。

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著者らは、組織学、細胞培養液の一部との親切な援助のために私たちの仲間のラムラボの同僚アマルChishtiとBijalパテルに感謝したいと思います。資金はスタートアップ資金と心臓血管研究所のシード・グラント（MTL）、ウェイン州立大学ナノメディシンフェローシップ（CBP）によって提供されました。

1.細胞培養の準備<ol><li>商業的に購入したヒト大動脈平滑筋細胞を利用します。 </li><li> 88.6％とからなる平滑筋細胞増殖培地中で細胞を維持する231培地、0.1％の組換えヒトインスリン（RH-インスリン）、組換えヒト線維芽細胞増殖因子（RH-FGF）、組換えヒト上皮細胞増殖因子（RH-FGF）の各々アスコルビン酸; 5％ウシ胎児血清（FBS）およびL-グルタミンの各;そして、1％抗生物質/抗真菌剤。 注：各増殖因子、FBSおよびL-グルタミンは、血管メディア増殖キットとして購入されます。 </li><li>細胞が約90％コンフルエントと組織播種のための準備が整うまで、メディアごとに48時間を変更します。 </li><li>拡張のためのメディアの変化との間でインキュベーター中で細胞を保管してください。 </li></ol> 3Dプリント挿入とカスタムシリコーン成形プレートの調製<ol><li> 3Dは、プレートインサートを印刷するための市販の3Dプリンタ（ 例えば 、レプリケータミニ）を使用します。 <ol><li>オペアンプを使用してください印刷された外殻とポストの3Dモデルを作成するために、このようなブレンダーとしてソースの3D設計ソフトウェアアン。 </li><li> 3Dプリンタのソフトウェアへの移植を可能に.STLフォーマットを経由して、モデルのドライバファイルをエクスポートします。 </li><li> 3Dプリンターにロードされたポリ（乳酸）フィラメント（PLA）を使用して印刷柱と外殻を生成します。 </li><li>次の印刷、30分を行う各インサートを滅菌するために、70％-100％のエタノール溶液に浸します。 </li></ol></li><li>ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）のシリコーンポリマーのポリマー混合物をベースと室温で10分間脱気し、混合物を可能に1:10の硬化剤を準備します。 <ol><li> 、（35ミリメートル）小さい（60ミリメートル）、中間、および大規模（100ミリメートル）として使用シャーレのサイズを定義します。 </li><li> 2 mLを、4 mLおよびそれぞれ、小中間および大プレートに未硬化のシリコーンの6 mLを加え、シャーレの底面全体を横断薄層を作成します。 </li><li> PDMSを注ぐことにより、小さなプレートのための投稿を作成します。7mm高さの100mmプレートとは、約2~3時間、60℃のホットプレート上で硬化させます。次に、円筒状の支柱をパンチアウトするために5ミリメートル生検パンチを使用します。各PDMSシリンダーを確保し、各小板の中央にするために、未硬化PDMSの少量を使用してください。 </li><li>プレートの底にPDMSの硬化を完了する前に、中間および大規模なプレートについては、3Dはそれぞれ、各中間および大型プレートに集中直径ポスト10ミリメートルと20ミリメートルを印刷置きます。大規模なプレートの場合は、さらに3Dプリント外殻をポストから直径等距離では約66.7ミリメートルを置きます。 <ol><li>各皿は、ポリマーの脱ガスのための18時間を可能にする、約2〜3時間、60℃のホットプレート上で大気中で硬化させます。 図1に見られるように、適切な領域と向きでプレートに印刷されたコンポーネントを修正しました。 </li></ol></li><li>すべてのPLAの内部に30分間、30％の蒸留水で70％エタノール溶液を添加その後、滅菌のためのTESと各プレートをカバーしています。 </li><li>慎重に各プレートからのエタノールを吸引空気乾燥させ。 </li><li>その蓋、フェイスアップの隣に生物学的安全キャビネット（BSC）内の各プレートを配置します。滅菌を完了するために30分間BSCの下でUV光にプレートし、蓋を公開します。滅菌技術は、UV曝露後のすべての工程を用いて行われます。 </li></ol></li></ol>平滑筋細胞とプレートのメンテナンスで播種フィブリンハイドロゲルの調製、 <ol><li>それぞれ、小中間および大型プレートサイズの0.5 mLを、1.1 mLおよび1.81ミリリットルの量の成長培地+ 0.01％のTGF-β1を含むフィブリンゲル溶液を混ぜます。 <ol><li>それぞれ、100 U / mLのストックから、それぞれ、小中間および大型プレートのメディアに、40μL、88.4μLとトロンビンの145μLを追加します。ゆっくりとそのトロンビンが均等にメディア内で混合されていることを確認するために手で各プレートを旋回させます。 </li><li>次に、160を追加1; L、354μLおよび580μLのフィブリノゲンは、20 mg / mlでの在庫から、滴下円それぞれ、小中間および大プレートにトロンビンメディア混合物に、それぞれ。ゆっくりでも層に混入し、ヒドロゲルの分布を確認するために手で旋回。 </li><li>ヒドロゲルは、室温で10〜15分間硬化させます。 </li></ol></li><li>標準的なプロトコルに従って、平滑筋の150mm細胞培養プレート中で増殖する細胞と遠心分離をトリプシン処理。 231培地、1％FBSおよび1％抗生物質/抗真菌 - 得られたペレットを98％からなる分化培地3mLに再懸濁されるべきです。 <ol><li>積極的に任意の細胞塊を破壊するために2 mLのピペットで上下に滴定により細胞を混ぜます。血球計数器を用いて細胞をカウントし、/ mLで、小中間および大型プレート用、それぞれ2×10 6細胞/ mL、1.0×10 7細胞/ mLおよび1.4×10 7細胞の細胞懸濁液を作成します。 </li><li>各細胞懸濁液intの1 mLを加え50 mLコニカルに対応するOAは、小さな中間および大型の標識。希望するそれぞれの追加の組織のリングのために、このように、追加の50 mLコニカルを設定します。 </li><li>それぞれ、各小中間および大血管のための2 mLを、4 mLおよび5 mLの最終播種量を得るために、各円錐形に分化培地を追加します。その後、慎重に滴ずつそれぞれ対応するプレートで準備ヒドロゲルの上に細胞溶液をピペット。 </li><li> 37℃インキュベーターで5％CO 2に代えプレート。 </li></ol></li><li>分化培地を各プレート毎に48〜72時間を変更します。より大きな板の場合には、大細胞播種密度を補償することごとに48から24時間を変更した後、24時間後に最初にメディアを変更します。 <ol><li>リングが完全にポストに向かって収縮していますように2〜4日後に、それぞれ、各小中間および大きいリングに10μL、20μLおよびTGF-β1の35μLを追加します。 TGF-βへの曝露後; 1、少なくとも24時間、リングを扱うことする準備が整いました。 </li></ol></li></ol>血管構築とメンテナンスの4アセンブリ<ol><li>最終的な血管構造物の製造前に、特殊な容器が完成容器を保持するために作成されます。 <ol><li>小血管のために、50mLのポリカーボネートコニカルチューブの上から2インチのセクションを切断することにより、リングの積み重ねのための背の高い板を作成し、PDMS 35ミリメートルプレートにカットエッジを接着。プレートの蓋として円錐形の蓋を使用してください。 </li><li>プレートを積み重ね、中間および大血管背の高いリングのために、背の高い板壁として機能するように縦方向に2.5インチのセクションに1.75インチの直径のポリカーボネートチューブをカット。背の高いプレート底部は、2インチ直径の円形片に0.125インチ厚のポリカーボネートシートを切断します。アクリル溶剤セメントを使用して、円形の切​​断片をポリカーボネート管部分に結合します。背の高い板用の蓋として60ミリメートルのペトリ皿から蓋を使用してください。 </li><li> 3DのpRINTポスト5、直径10から20mm、長さ50mm。 </li><li>各コンテナに未硬化のシリコーンの10ミリリットルを追加します。 PDMSの完全な硬化に先立ち、中央にそれぞれ、小さな中間、および大規模な容器にステップ4.1.3で作成した各ポストを配置します。 </li><li> 2-3時間、60℃にホットプレートセットに硬化させます。 </li><li> 30分間、30％蒸留水で70％エタノール溶液で滅菌します。 </li><li>慎重に各容器からエタノールを吸引した後、BSCで空気乾燥させ。次に、その蓋、フェイスアップの隣に配置、各プレートとフード内のコンテナを配置します。さらに滅菌のための追加の30分間BSCの下でUV光にコンテナを公開します。 UV照射後のすべてのステップで滅菌技術を使用してください。 </li></ol></li><li>非常に微細な鉗子を使用して、慎重にそのポストから各きつく巻か平滑筋ヒドロゲルリングを削除し、背の高いポストとその対応するより大きな容器に移します。 <ol><li>のペアを使用しますそれぞれの手で鉗子とは、ポストからリングの片側を持ち上げ、その後、他の。内腔を保護し、維持するために注意してください。 </li><li>背の高いポストに最初の1辺、リングのもう一方の側をスライドさせる、この両手方式で転送を実行します。穏やかな、緩やかな動きを使用して、円周方向に働いて、ゆっくりと背の高いポストの上にリングを押し下げます。所望の血管の長さは、各リングが完了構築物の長さの約1〜ミリ加えると、得られるまで、続いて組織リングスタック。 </li></ol></li><li>ポストは、作業面と平行になるように背の高い3Dプリントポスト上に位置決めリングのスタックを使用すると、プレートを回します。 <ol><li>マイクロピペットを用いて、それぞれ、各小中間および大血管の外表面に軽く100 U / mLの濃度でトロンビンの40、80および160μLを追加します。トロンビンを添加しながら、ゆっくりと構築物の全ての表面の均一な被覆を確実にするためにプレートを回転させます。これは、構築後の初期日にリングスタック構造体を固定するために利用フィブリン糊のベースになります。 </li><li>次に、迅速に構築体を回転させながらマイクロピペットを用いて、それぞれ、各小中間、および大規模な構築物の20mg / mLの濃度でフィブリノゲンの40、80および160μLを追加します。トロンビンおよびフィブリノーゲンはすぐに一度混合固いゲルに設定してください。短い硬化時間に、可能な限り迅速かつ均等にフィブリノゲンを適用します。 </li></ol></li><li>構築物を保持する各コンテナに分化培地の20 mLを加え。 37℃のインキュベーターに置き容器が必要になるまで。 3〜5日毎のメディアを変更します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

リングスタッキングメソッド現在の血管組織工学構築物の技術上の複数の利点を提供します。 RSMは、単にポストと外殻寸法をカスタマイズすることによって、任意の大きさの人間の血管を生成するように適合され得ます。私たちの方法は、ヒトの細胞でのみ構成されるポリマーフリー工学血管の開発を可能にし、迅速に身体の自然な創傷治癒過程で見つかった支持体材料を劣化させます。ポリマーグラフトは、診療所に再狭窄を引き起こすことが知られており、操作された移植片に含まれている場合に問題となる可能性があります。細胞播種数は、それぞれ異なるサイズの組織のリングのために変更する必要があります。播種数は近似および/または推定することが可能なシード表面積に対する細胞数のグラフは、図5に示されています。なお、ここで使用される細胞型は、ヒト大動脈平滑筋細胞であることに留意すべきです。異なる細胞型にRSMを適合させるために、セルの大きさおよび増殖速度が取り込まれる必要があります考慮し、最適な播種密度を決定しました。例えば、我々はまた、RSMを用いて、ヒト線維芽細胞のリングを作成している、少なくとも細胞の数を約2倍の平滑筋細胞と比較して必要とされるこ...

冠動脈疾患（CAD）の処置において、患者自身の血管バイパス手術用移植材料として回収します。しかし、多くの場合、病気の患者は、自分自身に寄付する実行可能な船を持っていない、と彼らが行う場合には、ドナー部位は、かなりの追加的な害を引き起こし、感染の重大なリスクがあります。 1操作された血管移植片は、この必要性を満たすことができます。スケーラビリティは、患者の血管のサイズ要件の広い範囲を満たすために、エンジニアリング船の最も重要です。しかし、エンジニアリング船舶のための本方法は、容易に拡張されず、一般的に複雑な金型またはポリマー足場の再製造を必要とします。ほとんどの操作された移植片血管線維芽細胞、平滑筋、または内皮細胞を播種されたポリマー管状足場を利用してのいずれか。または組織管を作成するために、マンドレルの周りに細胞シートをロール。臨床試験における二工学血管移植片は、脱細胞化に基づいていますDポリマー-ECMプラットフォーム。血管の修復に使用できる2、3、4ポリマー移植片は、既に持続ポリマーの存在とグラフトの長期適用の主な課題として生じる可能性が開存性の問題を有することが知られています。管状の型は様々なサイズで血管を生成するためにカスタムモールドのための追加の設計及びツールの製造を必要とする手順、完全に細胞容器を製造するために使用される5、6、7、8、9、10、11、12、13れています。 本明細書に記載される方法は、容易に拡張操作血管を作成するための新規な技術を包含しますカスタマイズ可能な3Dプリント挿入と伝統的な培養プレートを使用して移植片。 14細胞は、中央ポストと外殻のインサートを有するプレートに播種します。ポストコントロールは直径ルーメンと自己集合組織のリングにに細胞単層を可能にします。リングの外殻を制御する厚さ、および最終的な容器のこのように壁の厚さ。完成した組織のリングは、その後、管状血管移植片を形成するように積層されています。この方法の利点は、「リングスタッキング法」と呼ばれる任意の接着細胞タイプは、単に修正ガイドを挿入することによって生成することができるプレートの設定および組織環または所望の用途に必要な任意のサイズの管に播種することができることです。組織のリングを作成する組織工学における比較技術は、15、スケールに難しいまま各所望の大きさのために金型の再製造を必要とする16。さらに、この方法を用いて作製血管グラフトを生産することができ2-3週間でdは、数週間では速く、他の操作された容器に比べて。 図6は、診療所では、この時間のずれが悪化している患者の治療に有意な差を作ることができます。

<table><tbody><tr><td>ヒト大動脈平滑筋細胞&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-012</td><td>血管平滑筋細胞</td></tr><tr><td>Medium 231</td><td>Gibco (Life Technologies&nbsp;</td><td>M-231-500</td><td>血管平滑筋細胞に特化した培地</td></tr><tr><td>ヒト大動脈平滑筋細胞成長キット&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PSC-100-042</td><td>血管平滑筋細胞の生存率を維持するための成長因子</td></tr><tr><td>Replicator Mini 3D printer&nbsp;</td><td>メーカーボット&nbsp;</td><td>N/A</td><td>3Dプリンター</td></tr><tr><td>ポリ(乳酸)3Dインク(PLA)</td><td>MakerBot&nbsp;</td><td>N/A</td><td>3Dプリンターフィラメント</td></tr><tr><td>ポリ(ジメチルシロキサン) (PDMS)</td><td>Ellworth Adhesives&nbsp;</td><td>3097358-1004</td><td>接着プレート部品用ポリマー</td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Hyclone Labratories, Inc.</td><td>SH30256.01</td><td>フィブリンゲル成分</td></tr><tr><td>トロンビン&nbsp;</td><td>シグマライフサイエンス</td><td>F3879-5G</td><td>フィブリンゲル成分</td></tr><tr><td>トランスフォーミング成長因子-ベータ1&nbsp;</td><td>コラーゲン産生を刺激する</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td>成長因子</tr><tr><td>血球計算盤&nbsp;</td><td>ハウサーサイエンティフィック株式会社</td><td>3200</td><td>セルカウンティング用</td></tr><tr><td>ポリカーボネートチューブ&nbsp;</td><td>米国のプラスチック&nbsp;</td><td>PCTUB1.750X1.625</td><td>背の高いリングスタッキングプレートを作るための材料</td></tr><tr><td>ポリカーボネートシート&nbsp;</td><td>ホームデポ</td><td>409497背</td><td>の高いリングスタッキングプレートを作るための材料</td></tr><tr><td>接着ポリマー溶剤&nbsp;</td><td>SCIGRIP</td><td>10799</td><td>背の高いリングスタッキングプレートを作るための材料</td></tr><tr><td>インストロン 5940</td><td>インストロン</td><td>N/A</td><td>引張試験機</td></tr><tr><td>U-Stretch</td><td>Cell Scale</td><td>N/A</td><td>引張試験機</td></tr><tr><td>平滑筋アクチン&nbsp;</td><td>MA5-11547</td><td>Thermo Fisher</td><td>antibody</td></tr><tr><td>トロポミオシン</td><td>MA5-11783</td><td>Thermo Fisher</td><td>antibody</td></tr></tbody></table>

3dプリントガイドとリングスタッキング法を用いたエンジニア血管移植片のスケーリング

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

冠動脈疾患は、数百万人のアメリカ人に影響を与え、死の主要な原因です。利用可能な自家血管移植片の不足により、人工移植片は、患者の治療のための大きな可能性を提供します。しかし、操作された血管移植片は、一般に容易に拡張されない時間がかかり、高価な練習を構成する、異なるサイズをカスタマイズするためにカスタムモールドまたはポリマーチューブの製造を必要とします。人間の動脈は、約2.0〜38ミリメートルから約0.5〜2.5ミリメートルから壁の厚さで内腔直径の範囲です。我々は、血管平滑筋細胞（SMC）とここに実証所望の細胞型の組織の可変サイズのリングは、内腔の直径を制御するために、中央ポストのガイドを使用して作成することができる」は、環スタッキング法」と呼ばれるメソッドを作成しましたそして、外殻は、血管壁の厚さを決定します。これらの組織のリングは、その後、血管の自然な形状を模倣、管状構造物を作成するために積層されています。容器の長さがbのことができますeは、単に必要な長さを構成するのに必要な環の数を積層して合わせ。私達の技術を用いて、血管に類似した管状の形態の組織は、容易に診療所および患者のニーズを満たすために寸法および長さの多様で製造することができます。

ここで実証されたリングスタッキング法（RSM）がスケーラブルであることを示し、3つの異なる工学血管移植片の大きさ（ 図1）の製造です。適用性を証明するために、3つの異なる容器のサイズは、動脈左前のため、実際の人間の血管サイズに相関を選択した（小;直径ルーメン= 4ミリメートル）17、（中間;直径ルーメン= 10ミリメートル）大動脈降順と上行大動脈（大規模;直径= 20ミリメートル）18ルーメン 。壁の厚さは約500μmの小さなリングのため、約1500ミクロンの両方の中間と大きなリングのです。実証された各容器は、小さな容器では約6ミリメートルと中間と大型船舶のための9ミリメートルの長さに等しくする、6リングを積み重ねることによって構築されています。長さは、個々のリングの壁の厚さに基づいています。 組織学的分析は、明らかにしまし...

スケーラブルな設計された血管は、臨床適用性を改善するであろう。簡単にかなりの3Dプリントガイドを使用して、血管平滑筋のリングは、血管移植片を形成し、筒状に作成して積層しました。移植片は、単純に、3Dプリントガイドサイズを変更することによってヒト冠状動脈寸法の範囲を満たすような大きさにすることができます。

3Dプリントガイドとリングスタッキング法を用いたエンジニア血管移植片のスケーリング

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

本手法の全般的な目的は、あらゆるサイズのエンジニアリング血管を、堅牢かつ一貫して作製することです。この技術により、信頼性と有効性の高い血管のエンジニアリングが可能になります。本技術の主な利点は、あらゆるサイズの血管を容易かつ確実に作製できることです。この手法のアイデアは、組織のチューブをどのように構築するかを議論していた際に、道路トンネルを一度に1セグメントずつ建設することに例えたことから得られました。3Dプリントインサートを準備するには、まず35、60、または100 mmのペトリ皿の底に、それぞれ2、4、または6 mLの未硬化シリコンを薄く層状に加えます。35 mmプレート用のポストを作成するには、別の100 mmプレートにPDMSを高さ7 mmまで注ぎ、ホットプレートを用いて60 °Cで2〜3時間加熱します。PDMSが硬化した後、5 mmのバイオプシーパンチを使用して円柱状のポストを作成します。少量の未硬化PDMSを用いて、各35 mmプレートの中央に円柱を固定します。100 mmプレートでは、ポストから等距離になるように、直径約66.7 mmの3Dプリント製アウターシェルを配置します。60 mmおよび100 mmプレート底部のPDMSが硬化する前に、直径10 mmおよび20 mmの3Dプリント製ポストを、それぞれ60 mmおよび100 mmプレートの中央に配置します。これらのディッシュを60 °Cのホットプレート上で2〜3時間室空気にさらして硬化させ、その後18時間ポリマーの脱気を行います。脱気が完了した後、すべてのプレートの内側を70%エタノールで滅菌し、各プレートを30分間蓋をして密閉します。その後、各プレートからエタノールを慎重に吸引し、風乾させます。プレートが乾いたら、対応する蓋を上向きに置いた状態でバイオセーフティキャビネットへ移し、UVライトを30分間照射して滅菌を完了させます。フィブリンハイドロゲルを調製するには、まず、フィブリンゲルとTGF Beta 1を添加した増殖培地を、35 mm、60 mm、および100 mmの培養皿にそれぞれ0.5、1.1、および1.81 mLずつ加えます。次に、35 mm、60 mm、および100 mmのプレートにそれぞれ40、88.4、および145 µLのトロンビンを加え、各プレートを手で静かに回して混ぜ合わせます。トロンビンが均一に分散したら、35 mm、60 mm、および100 mmのプレート内のトロンビン含有培地混合液に、それぞれ160、354、および580 µLのフィブリノゲンを円を描くように滴下し、プレートを静かに回してハイドロゲルを均一に分散させます。ハイドロゲルを室温で10〜15分間硬化させます。次に、150 mm細胞培養プレートで拡大培養した目的の平滑筋細胞をトリプシン処理し、遠心分離によって剥離した細胞を回収します。ペレットを3 mlの分化培地で再懸濁し、2 mLピペットを用いて細胞を激しくピペッティングし、細胞塊を分散させます。カウント後、細胞を2 × 10⁶、1 × 10⁷、および1.4 × 10⁷ cells/mLの分注量に分け、対応する培養プレートに従ってラベルを貼った50 mlコニカルチューブに入れます。各チューブに分化培地を加え、35 mm、60 mm、100 mmの各プレートに対して、最終的な播種量をそれぞれ2 mL、4 mL、5 mLにします。その後、細胞懸濁液を各対応プレートの調製済みハイドロゲル上に慎重に滴下し、細胞培養インキュベーター内で拡大培養します。2〜4日後には、リングがポストに向かって完全に収縮します。したがって、10、20、または35 mLのTGF Beta 1を、それぞれ35、60、および100 mmのリングに加えます。35 mm血管用の血管構築物を組み立てるには、50 mLポリカーボネート製コニカルチューブの上部から2インチのセクションを切り出し、その上端をPDMS接着剤で35 mmプレートに接着して、リングを積層させるための高いプレートを作成します。60および100 mm血管用の高いリング積層プレートについては、直径1.75インチのポリカーボネートチューブを長さ2.5インチのセクションに切り分け、それを高いプレートの壁として使用します。背の高いプレート底面を作成するために、厚さ 0.125 inch のポリカーボネートシートを直径 2 inch の円形に切り出します。アクリル溶剤セメントを使用して、ポリカーボネートチューブのセクションを切り出した円形パーツに接合します。直径 5 mm、10 mm、および 20 mm、長さ 50 mm のポストを3Dプリントします。次に、各容器に未硬化のシリコンを10 mL加え、PDMSが完全に硬化する前に、35、60、100 mmの各容器の中央に3Dプリントしたポストを配置します。そして、これらのディッシュを60 °Cのホットプレートの上に2〜3時間置きます。PDMSが硬化した後、先ほど実演したように70% ethanolでプレートを滅菌し、続いてエタノール滅菌後に乾燥させた容器をUVライトに30分間曝露させます。次に、2組の非常に精密なピンセットを使用して、きつく巻かれた平滑筋ハイドロゲルリングの片側を、次にもう一方を注意深くポストから持ち上げます。その後、リングの片側を、次にもう一方を、対応する一つ上のサイズの容器にある高いポストに注意深くスライドさせます。円周方向に沿って、緩やかで段階的な動きでリングをポストに沿ってゆっくりと押し下げ、目的の血管の長さが得られるまで、さらに組織リングを積み重ねていきます。すべてのリングを積み重ねたら、ポストが作業面に平行になるようにプレートを回転させ、プレートをゆっくりと回転させながら、35、60、100 mmの各容器の外表面にそれぞれ40、80、160 µLのThrombinを静かに加えます。次に、構造体を速く回転させながら、35、60、100 mmの各構造体にそれぞれ40、80、160 µLのFibrinogenを、できるだけ迅速かつ均一に加えます。ThrombinとFibrinogenは混合後、速やかに凝固して硬いゲルになります。次に、各コンストラクト容器に分化培地を20 mL加え、必要になるまで37 °Cのインキュベーターに保管します。組織学的解析により、すべてのリングサイズにおいて高い細胞密度が認められ、小型リングの外縁には少量の残留フィブリンゲルが観察されました。大型リングでは、細胞成分にフィブリンゲルが散在しており、中型および大型リングの両方でコラーゲン産生の兆候が認められました。α-smooth muscle Actin（α-平滑筋アクチン）およびTropomyosin（トロポミオシン）の発現に関する組織リング解析の結果、すべてのリングサイズにおいて両抗体ともに陽性であることが示され、平滑筋表現型が維持されていることが確認されました。引張試験では、3種類すべてのリングサイズにおいて、リングおよび血管サイズの増大に伴い強度が上昇するという一貫した傾向が認められました。また、各種リングサイズを作成するための細胞播種数も、播種表面積と相関していました。これらの血管構成体は、血管と灌流システムの接続部でわずかな漏出が見られるのみで、100から417 ml/minの流量で最大5分間のフローに耐えることができます。この手法に習熟すれば、適切に実施することで、リングを1時間で作製することが可能です。この手順を行う際は、ゲルの凝固と適切なリング形成を確実にするために、ハイドロゲルの構成成分を十分に混合することが重要です。本手順に従い、他の細胞種を用いてリングを作成するなど、他の手法を適用することで、異なる種類の組織を工学的に作製することが可能です。このビデオを視聴することで、リング積層法を用いて様々なサイズの血管組織を作製する方法について、十分な理解を深めることができるはずです。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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