3Dプリントガイドとリングスタッキング法を用いたエンジニア血管移植片のスケーリング

この方法の全体的な目標は、あらゆるサイズの人工血管を堅牢かつ一貫して生成することです。この技術により、血管の信頼性が高く効果的なエンジニアリングが可能になります。この技術の主な利点は、あらゆるサイズの容器を簡単かつ確実に製造できることです。

この手法のアイデアは、組織のチューブをどのように設計するかを議論していたときに初めて思いつき、この手法を道路トンネルを一度に1セグメントずつ建設することに例えました。3Dプリントインサートを準備するには、まず、35mm、60mm、または100mmのシャーレの底に、それぞれ2mL、4mL、または6mLの未硬化シリコーンの薄層を追加します。35 mmプレート用のポストを作成するには、PDMSを別の100 mmプレートに7 mmの高さに注ぎ、ホットプレート上のPDMSを摂氏60度で2〜3時間加熱します。

PDMSが硬化したら、5mmの生検パンチを使用して円筒形のポストを作成します。未硬化のPDMSを少量使用して、シリンダーを各35mmプレートの中央に固定します。3Dプリントされた外殻を、100mmプレートのポストから等距離に直径約66.7mmに配置します。

60 mm プレートと 100 mm プレートの底部にある PDMS を硬化させる前に、直径 10 mm と 20 mm の 3D プリント ポストをそれぞれ 60 mm プレートと 100 mm プレートの中央に配置します。皿を60°Cのホットプレートで屋外で2〜3時間硬化させ、その後18時間のポリマー脱気を行います。脱気の最後に、すべてのプレートの内側を70%エタノールで滅菌し、各プレートを30分間覆います。

次に、各プレートからエタノールを慎重に吸引して、風乾させます。プレートが乾いたら、対応するフェイスアップの蓋の隣にある生物学的安全キャビネットに移します。材料をUVライトに30分間さらして滅菌を完了します。

フィブリンハイドロゲルを調製するには、まず、フィブリンゲルとTGFベータ1をそれぞれ35、60、および100mmの培養皿で補充した0.5、1.1、および1.81mLの成長培地を追加します。次に、35mm、60mm、100mmのプレートにそれぞれ40、88.4、145マイクロリットルのトロンビンを加え、各プレートを手で優しく攪拌します。トロンビンが均一に分布している場合は、160、354、および580マイクロリットルのフィブリノーゲンを滴様円運動で、それぞれ35、60、および100 mmプレートのトロンビン培地混合物に加え、プレートを静かに渦巻いてハイドロゲルを均一に分配します。

ハイドロゲルを室温で10〜15分間硬化させます。次に、目的の平滑筋細胞をトリプシンし、150 mmの細胞培養プレートに拡大し、分離した細胞を遠心分離して収集します。ペレットを3 mLの分化培地に再懸濁し、2 mLのピペットを使用して細胞を激しく粉砕し、細胞塊をバラバラにします。

カウント後、細胞を2/10 10〜6番目、1/10 10〜7番目、および1.4 x 10〜7番目の細胞に50 mLの円錐チューブに分割し、対応する培養プレートに従って標識します。各チューブに分化培地を添加して、各35、60、および100 mmプレートごとにそれぞれ2、4、および5 mLの最終播種量を得る次に、細胞培養インキュベーターで増殖するために、対応する各プレートで調製したハイドロゲルに細胞溶液を慎重に滴下します。2〜4日後、リングはポストに向かって完全に収縮します。

したがって、10、20、または35 mLのTGF Beta 1をそれぞれ35、60、および100 mmのリングに追加します。35mm血管用の血管構造を組み立てるには、ポリカーボネート円錐管の50mLの上部から2インチの断面を切り取り、PDMSは上端を35mmプレートに接着して、リングスタッキング用の背の高いプレートを作成します。60 mmと100 mmの容器の高さのリングスタッキングプレートの場合、直径1.75インチのポリカーボネートチューブを縦方向に2.5インチのセクションに切断して、背の高いプレート壁として機能します。

背の高いプレートの底には、厚さ0.125インチのポリカーボネートシートを直径2インチの円にカットします。アクリル溶剤セメントを使用して、ポリカーボネートチューブセクションを円形のカットピースに結合します。直径5mm、10mm、20mmの支柱を長さ50mmで3Dプリントします。

次に、各容器に10 mLの未硬化シリコーンを加え、PDMSが完全に硬化する前に、各3Dプリントポストを各35、60、および100mmの容器に中央に配置します。そして、皿を摂氏60度のホットプレートに2〜3時間置きます。PDMSが硬化したら、示したようにプレートを70%エタノールで滅菌し、続いて乾燥エタノール滅菌容器をUV光に30分間さらします。

次に、2対の非常に細い鉗子を使用して、しっかりと転がされた平滑筋ハイドロゲルリングの最初に片側を持ち上げ、次にもう一方をポストから持ち上げます。次に、リングの片側を慎重にスライドさせ、次に大きいサイズのコンテナの背の高い支柱にもう片側をスライドさせます。円周方向に作業し、緩やかに緩やかに動かしながら、リングをポストにゆっくりと押し込み、その後、目的の血管の長さが得られるまで追加の組織リングを積み重ねます。

すべてのリングを積み重ねたら、ポストが作業面と平行になるようにプレートを回転させ、プレートをゆっくりと回転させながら、それぞれ35、60、100mmの容器の外面に40、80、160マイクロリットルのトロンビンをゆっくりと加えます。次に、40、80、160マイクロリットルのフィブリノーゲンを、それぞれ35mm、60mm、100mmの各コンストラクトに、コンストラクトを活発に回転させながら、できるだけ迅速かつ均等に添加します。トロンビンとフィブリノーゲンは、混合するとすぐに固いゲルに固まります。

次に、各コンストラクト容器に20 mLの分化培地を加え、必要になるまで容器を摂氏37度のインキュベーターに入れます。組織学的解析により、すべての環状サイズで高い細胞性が明らかになり、小さな環の外縁に少量の残留フィブリンゲルが観察されました。大きなリングでは、一部のフィブリンゲルが細胞内容物に散在しており、中間リングと大きなリングの両方でコラーゲン産生の兆候が明らかです。

アルファ平滑筋アクチンおよびトロポミオシン発現の組織リング解析により、すべてのリングサイズが両方の抗体に対して陽性であることが明らかになり、平滑筋の表現型が維持されたことが確認されました。引張試験では、3つのサイズのリングすべてで、リングと血管のサイズの増加と相関して強度が増加する一貫した傾向が示されています。種々のリングサイズを作成するための細胞播種数も播種表面積と相関する。

これらの容器構造は、毎分100〜417mlの流量で最大5分間の流れに耐えることができ、血管が増殖システムに接続する場所ではわずかな漏れしか観察されません。一度習得すると、技術が適切に実行されれば、リングは1時間で設計できます。この手順を試行する際には、ゲルの設定と適切なリング形成を確保するために、ハイドロゲル成分を完全に混合することを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、他の種類の組織をエンジニアリングするために、他の種類の細胞型のリングを作成するなどの他の方法を実行できます。このビデオを見れば、リングスタッキング法を使用してさまざまなサイズの血管組織を設計する方法について十分に理解できるはずです。