Name: やっぱりアオモンイトトンボ精子における活性酸素種の細胞内局在の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶSolea senegalensis精子における活性酸素種の細胞内局在評価法。DCFH-DA蛍光色素と共焦点顕微鏡を用いて、ミトコンドリアや核との相互作用を可視化し、酸化ストレスが精子運動性に与える影響を評価します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AQUAGAMETE FA 1205 コスト行動に感謝いたします。この作品は AGL201568330 C2 1 R プロジェクト (MINECO/フェダー) によって財政上支えられます。デイヴィッド g. Valcarce 資金が供給された軍事政権・ デ ・ カスティーリャ ・ イ ・ レオン (EDU1084/2012 年) とフォンド社会 Europeo。著者は、博士アナ リアサ Stolt 海ファーム社、博士パウリノ ・ デ ・ ラパス、博士・ イグナシオ ・ マルティネス モンテロとホセ ・ ラモン ・ Guiérrez を認めます。我々 はビデオ撮影にポーラ フェルナンデス Colado をありがとうも。

注: 螢光色素インキュベーションと共焦点解析コントロールと扱われたサンプルの少なくとも 2-3 時間になります。データ処理は、この時間の計算には含まれません。必要な材料は、材料テーブルで見つけることができます。このプロトコルは、新鮮なまたは凍結精子に適用できます。やっぱりアオモンイトトンボ冷たい水、冷たい条件 (4 〜 7 ° C) の下で常に仕事で産卵する魚の種であります。プロトコルの一般的なビューは、図 1を参照してください。
1 実験前に準備作業
<ol><li>ミトコンドリア染色 1 mM 原液分析学年 DMSO を準備します。</li>
	<li>1 μ g/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole 二塩酸塩 (DAPI) 脱イオン水で原液を準備します。</li>
	<li>200 mOsm/kg リンゲル液 (116 mM NaCl、KCl、2.9 mM 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES、pH 7.7) の準備します。</li>
	<li>4 mM 2 ', 7 ' dichlorodihydrofluorescein ジアセテート (DCFH DA) 分析グレードのメタノールで原液を準備します。 注: は、-20 ° c まで必要な因数でストックのソリューションを維持します。</li>
	<li>4-7 ° C で、遠心を設定します。</li>
</ol>2. 螢光色素の孵化前にサンプル準備
注: ピペッティングと再、精子の穏やかな処理が望ましいです。
<ol><li>凍結保存した細胞を扱う場合水のお風呂が、やっぱりアオモンイトトンボ精子1040 ° C で融解することを備えることができます。7 槽のわらのサンプルを浸す s。</li>
	<li>カットするはさみを使用して、および microfuge の管にサンプルを空にして 4-7 ° C、1 分 1000 x g で遠心分離機します。</li>
	<li>汚損のプロトコルを妨げることができる任意のコンポーネントを破棄する分注して凍結サンプルから精液または凍結と精漿を削除します。</li>
	<li>50-100 μ L の 4 ° C 200 mOsm/kg リンガー液で細胞を再懸濁します。</li>
	<li>ノイバウアーや実体顕微鏡下で似たようなカウントの商工会議所と精子の濃度を決定します。</li>
	<li>1 - 2 106セル/mL 4 ° C リンガー液 0.5 mL の最終巻で x を細胞懸濁液を希釈します。</li>
</ol>3. 螢光色素インキュベーション
注: 螢は、低光の条件、特に溶液中で処理しなければなりません。
<ol><li>DCFH DA 原液の 3.125 μ L を追加 (サンプルの最終濃度: 25 μ M) 作業サンプル希釈します。4-7 ° C で闇10で 40 分間インキュベートします。</li>
	<li>30 分後の DAPI 原液 0.5 μ L を追加 (最終濃度サンプル: 2 μ M) とミトコンドリア染色原液 0.5 μ (サンプルの最終濃度: 100 nM) のサンプルに。暗闇の中で 10 分間両方の螢を孵化させなさい。</li>
</ol>4. 共焦点の顕微鏡検査のための試料
<ol><li>培養時間後 1000 x g、1 分の 4-7 ° C の細胞懸濁液を遠心します。</li>
	<li>ピペットで上澄みを慎重に廃棄します。</li>
	<li>200 mOsm/kg リンガー液の 10-20 μ L を追加します。</li>
	<li>濃縮細胞懸濁液の場所 5 μ L は、スライドにドロップします。</li>
	<li>慎重に、スライドを準備上のカバーを置く、ポーランド語でそれを封印します。ポーランドが乾燥して準備は共焦点の顕微鏡検査のための準備です。</li>
</ol>5 実験前共焦点のセットアップ
注: 顕微鏡によって DCFH DA が「焼かれる」。まず非貴重なサンプルに最適な条件を確立します。
<ol><li>顕微鏡、レーザー、カメラ、顕微鏡を実行しているコンピューターをオンにします。</li>
	<li>各螢光色素の励起と放射の最大値を考慮して励起レーザーを設定します。<ol>
<li>DAPI、用励振最大 358 nm、排出量最大 465 nm。</li>
		<li>ミトコンドリア染色用励振最大 644 nm、排出量最大 662 nm。</li>
		<li>DCFH-DA を使用して励起最大 504 nm、排出量最大 525 nm。</li>
	</ol>
</li>
	<li>精子に集中する 25 X 目的と作業を開始します。この螢光色素は、最高の強度を報告するために焦点を DAPI チャネルを選択します。セルを集中している、かつて用 63 X または 100 × 対物徹底的な評価ソレア アオモンイトトンボ精子サイズが約 2 μ m なので。</li>
	<li>各チャネルのピンホール、利得と電圧を最適化します。同じように、背景を減らすためにデジタル オフセットを調整します。すべてのパラメーターは、使用される螢光色素に最適な一度設定を保存します。単一のルーチン試験のソレア アオモンイトトンボ精子細胞を用いて (これらのパラメーターは、各実験で変化があります) 次: 1 の利得電圧 750 V のピンホール。</li>
</ol>6. 画像の取得
<ol><li>画像獲得の目的の品質条件を選択します。ビット深度、イメージ形式、光シート厚さのような取得設定を定義し、単一の両面照明を選択します。単一のルーチン試験のソレア アオモンイトトンボ精子使用 (これらのパラメーターは、各実験で変化があります) 次: フレーム; 1024 px のサイズビット/ピクセル 16;スキャン速度が 2-4)。</li>
	<li>開き、開始フィールドの画像を撮影してスキャン領域を中央にします。</li>
	<li>トリミング ツールを使用すると、関心領域を選択し、押しますライブ。</li>
	<li>範囲インジケーター ツールの助けを借りて、背景を減らすためにデジタル オフセットを調整します。チャンネルごとにこれを行うし、イメージを取る。</li>
	<li>各チャンネルごとの螢光と、その組み合わせの品質を確認します。</li>
</ol>7. 3 D イメージ ビデオを作成します。
<ol><li>Z スタック取得設定。<ol>
<li>ソフトウェアで Z スタック オプションを選択します。</li>
		<li>単一のセル、セルのグループまたは関心領域を選択し、フォーカスをします。</li>
		<li>Z スタック '最初スライス' と '最後のスライス' オプションを区切るし、良い焦点の助けを借りて、0.2 μ m 間隔に z ステップを確立します。最高の強度を報告ことがありますこの螢光色素と精子の頭全体を簡単に選択できるため、集中する DAPI チャネルを選択します。各チャンネルに最適なアクイジション ・ パラメーターを選択し、実験を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Z スタック実験を実行します。チャンネルを分割し、各シグナルの細胞内の局在を観察します。</li>
	<li>Z スタック プロセス。<ol>
<li>ボリューム レンダリング: 実験が終わったら、Z スタック処理ソフトウェアのオプションを選択し、ボリュームのレンダリング オプションを選択します。ステップと回転度 (360 °) の数を選択します。動画の拡張子を持つファイルを保存します。</li>
		<li>ステレオ: オプションでステレオを選択プロセス ウィンドウ。このツールは、チャンネルの分割とビデオの 3 D 画像を作成することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li>
<li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li>
<li>Gürler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability%2C+synthesis+of+reactive+oxygen+species%2C+and+DNA+damage+of+bovine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383(2015).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li>
<li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li>
<li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+phosphatidylserine+translocation%2C+intracellular+hydrogen+peroxide%2C+and+DNA+integrity+in+canine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm.</a> Theriogenology. 73 (3), (2010).</li>
<li>Guthrie, H. D., Welch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reactive+oxygen+species+on+sperm+function%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of reactive oxygen species on sperm function.</a> Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).</li>
<li>Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+and+sperm+function--in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health.</a> J Androl. 33 (6), (2012).</li>
<li>Valcarce, D. G., Robles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+captivity+and+cryopreservation+on+ROS+production+in+Solea+senegalensis+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa.</a> Reproduction. 152 (5), (2016).</li>
<li>Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradoxical+relationship+between+stallion+fertility+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress.</a> Biol Reprod. 91 (3), (2014).</li>
<li>Cabrita, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0044848614002105">Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis.</a> Aquaculture. 432, 389-401 (2014).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

精子の運動性と機能キー細胞小器官であるミトコンドリアが知られています。これらの細胞小器官は、同時に直接活性酸素産生に関与しています。興味深いことに、適切な精子機能1活性酸素の制御のレベルが必要です。肯定的な哺乳類11不妊と酸化ストレスとの関係が示されているが、過剰なレベルに影響を与える精子品質12。正または負の効果に決定的なことができる 1 つの重要な要因は、ROS レベルだけでなく、活性酸素の細胞内局在性です。活性酸素の有害な影響の 1 つは DNA 損傷9を生産したがって ROS レベルがミトコンドリアの正常であるに対し ROS の核の存在核潜在的な損傷の指標となる可能性があります。共焦点顕微鏡 ROS の細胞内局在性に関する情報を提供できるような技術と既存の定量法 (例えば, フローサイトメトリー) を補完する必要があります。
共焦点顕微鏡は、活性酸素の細胞内の局在化を...

活性酸素種の生産は、精子の質とリンクされている最近1。ミトコンドリアの活性酸素産生には、通常の生理学的なプロセスを考えることができる、さまざまなレベルで精子の損傷の明確な原因は活性酸素産生の過剰による酸化ストレス。人間、酸化ストレスは、男性不妊症、運動性や受精2を受けるための能力を変更することに関連付けられています。哺乳類で、凍結精子サンプルの DNA の完全性の変化は H2O23の合成にも関連しています。
凍結保存は養殖で銀行の遺伝子のための一般的な手法です。この技術はやっぱりアオモンイトトンボなど生殖器の問題を持つ種で特に重要です。市場でこの貴重な種は、求愛の不足のため飼育下で生まれた個体の生殖機能障害を示しています。この事実は、精子の凍結保存を人工受精精子の可用性を持っている必要になります。しかし、凍結は、酸化ストレスと抗酸化サプリメントの有益な効果が報告されての精子4有害なことができるのソース可能性があります。ミトコンドリアをターゲットとした抗酸化作用による活性酸素抑制は黄色いナマズ5精子凍結保存用伝え有益であった。
したがって、精子サンプル中の ROS のレベルは、これらの分子は、精子の生存と不妊治療8の欠点として認識されているので、特に凍結6、7の後知ることが重要。さらに、細胞内 ROS の分布を調査、潜在的な損傷のレベルを推測する重要な可能性があります。例として通常、精子機能と互換性のある、ミトコンドリアにおける活性酸素の低レベルを想定できるが、核内活性酸素の高レベルは、精子の DNA 損傷の指標かもしれない。H2O2は、ミトコンドリアから解放されることができる、小さなおよび電荷レス分子9だから核を浸透最も関連性の高い活性酸素の 1 つです。ジクロルフルオレッセン ジアセテート (DCFH DA) 具体的には緑色の蛍光を発光細胞内の過酸化水素を明らかにできます。この記事は、やっぱりアオモンイトトンボ精子共焦点顕微鏡を用いた H2O2細胞内の局在を検出するための詳しいプロトコルが表示されます。

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6883</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</サブ></td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>C1016&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>カバー スリップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO、分析グレード</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>メタノール、分析グレード</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MitoTrackerディープレッド&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機(冷蔵)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアーチャンバー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717810</td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10143562BEF</td><td></td></tr></tbody></table>

やっぱりアオモンイトトンボ精子における活性酸素種の細胞内局在の評価

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

酸化ストレスは、精子の質を減少させる重要な要因の 1 つです。どんな種の重要度が高いは、精子の活性酸素種 (ROS) を検出するための効率的なプロトコルの開発が、これらのメソッドは、使用頻度の低いと硬骨魚も少ない。凍結保存は遺伝子銀行を含め、さまざまな目的のため養殖の便利なテクニックを年間を通じて精子可用性を保証します。凍結/融解手順や原因になる活性酸素産生精子細胞に損傷を与えます。考えると、将来の損害が活性酸素産生の過剰の原因、ローカリゼーション、ここによって精子の H2O2を検出し、共焦点顕微鏡による細胞内局在化を評価する詳細な方法について提供しています。この目的のため 3 螢 (2 ', 7 ' Dichlorodihydrofluorescein セルロースジ アセテート (DCFH DA)、ライブ ミトコンドリア染色と 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole 二塩酸塩 (DAPI)) の組み合わせは、2 H2O の共局在の評価に使用されます。精子核やミトコンドリアソレア senegalesis精子サンプル。

共焦点顕微鏡は、魚類の精子細胞内 ROS の評価のための理想的な方法です。(図 1) 本論文で示した 3 つの螢 (DAPI、ミトコンドリア染色、DCFH DA) の組み合わせは、基礎研究に適用することができますし、改善で使用されるプロシージャにアプリケーションを持つことができます多くの有用な情報を提供します凍結プロトコルなどの産業水産植物細胞内 ROS の存在とその他のパラメーターを関連付けるために実施される各種の解析: 運動性、生存率、良いと悪いブリーダーの活性化運動や他の多くの間で季節精子バリエーションのさまざまなパターン。現在の仕事で精子内細胞内の H2O2配布の 2 つの異なるパターンが表示されます: ミトコンドリアや核 (図 2 3) の普及と併置されています。ROS による低潜在的な損傷を示すこれらの精子は、DNA 損傷に苦しむそれらは示した DCFH DA は核のラベルもミトコンドリアでのみ DCFH DA のラベルを示...

このプロトコルは、やっぱりアオモンイトトンボ精子核の ROS は、ミトコンドリアのライブ ミトコンドリア染色 DAPI の敏感な螢光色素 DCFH-DA を使用して内 H2O2の局在を検出するための詳細な方法についてを記述します。可視化、それぞれ。プロトコルは、新鮮なまたは解凍精子と 2 h 内で実行する設計されています。

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

本実験の目的は、共焦点顕微鏡を用いてSolea senegalensisの精子における活性酸素種の細胞内局在を評価することである。活性酸素種は、さまざまなレベルで細胞損傷を引き起こし、効果的な精子機能への安全上の懸念となる。脂質過酸化は運動能や受精に悪影響を及ぼす可能性があるため、精子は特に酸化ストレスに敏感であると考えられる。活性酸素種は、内因性アポトーシス経路を誘導することさえあります。過酸化物はミトコンドリアから放出され、小さく電荷を持たない分子であるため、核内に浸透してDNAに影響を与えることができます。本プロトコルでは、細胞内に取り込まれた後、酸化反応によって修飾され、緑色蛍光を発するフルオロフォアを使用します。これにより、活性酸素種の局在を正確に把握することができます。本ビデオでは Solea senegalensis の精子を用いていますが、このプロトコルは商業的価値のある近縁種や、Sibrifis や Mirica などの母種にも適用可能です。また、物理反応生物学や養蜂分野における本手法の活用例などが挙げられます。プロトコルに従った凍結沈殿の評価。この精子活性化前後の活性酸素種ラベルの比較。または、活性酸素種ラベルと良好な呼吸および不良な呼吸との相関性を調べることができます。まず、フルオロクロムのストック溶液を調製します。フルオロクロムの取り扱いは、安全データシート（SDS）の推奨事項に従って行う必要があることに注意してください。ストック溶液の秤量および調製時には、細心の注意を払ってください。ストック溶液は分注し、使用時まで-20°Cで保存してください。本プロトコルでは3種類の蛍光色素を使用します。遠赤色蛍光色素は生細胞内のミトコンドリアを染色し、ミトコンドリアの局在確認に使用できます。DAPIは、DNA染色のための蛍光顕微鏡観察で広く使用されるプローブであり、DNAのアデニン・チミンリッチな領域に強力に結合します。また、2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートは、細胞透過性の非蛍光性プローブです。これは細胞内で脱エステル化され、酸化されると強い蛍光を発する27-dichlorofluoresceinに変化します。このプロトコルは、新鮮な精子または凍結保存された精子を用いて開始できます。本例では、凍結保存サンプルを使用しました。40 °Cで解凍するためのウォーターバスを準備します。器具を洗浄します。適切な個人用保護具を着用し、凍結保存されたストローを選択してください。ストローをバスに7秒間浸します。ハサミを使用して、融解したサンプルをマイクロ遠心チューブに移します。常に4 °Cで作業してください。サンプルを1分間遠心分離します。ペレット化したsowelsに影響を与えないよう、凍結保護剤を注意深く除去します。50または100 µLの少量のRINGA溶液で再懸濁します。細胞懸濁液の希釈液を新しいバウアーまたは同様の血球計数器に注入し、細胞数を計測します。サンプルの濃度を算出してください。あらかじめ冷却したRINGA溶液を用い、最終容量0.5 millilitersとなるように、細胞懸濁液を100万から200万cells/mm³まで希釈します。ピペッティングや再懸濁を行う際は、精子を慎重に扱う必要があります。3.125 µLのジクロロフルオレセインジアセテートストック溶液を調製サンプル溶液に添加します。サンプル中の最終濃度は25 µMとなります。4～7°Cで40分間インキュベートします。30分後、サンプルにDAPIストック溶液0.5 µLとミトコンドリア染色ストック溶液0.5 µLを添加します。両方のフルオロクロムのインキュベーション時間は10分間です。スライドガラス上に、濃縮した細胞懸濁液を5 µL滴下します。調製物にカバーガラスを慎重に載せ、密封します。装置の電源を入れ、コントロールパネルで100倍の対物レンズを選択します。顕微鏡でサンプルを特定し、ランプを点灯させます。システムソフトウェアを使用すると、必要なフルオロクロムをリストから直接選択できます。セットを選択してください。励起波長最大465 nanometersのDAPI、励起波長最大662 nanometersのMitoTracker Deep Red、および放出波長最大525 nanometersのDCFを使用します。ビームを目視装置（接眼レンズ）に向けます。関心領域に焦点を合わせます。ソフトウェアに戻り、フレームサイズを選択します。より高い分解能を得るために、双方向スキャンモードを設定してください。次に、希望のスキャン速度を選択します。まず、スキャン領域を開いて中央に合わせます。視野の画像を撮影してください。クロップツールを使用して関心領域を選択し、「Live」を押します。次に、作業領域を選択します。レンジインジケーターツールを使用してデジタルオフセットを調整し、背景ノイズを低減させてください。これを各チャネルに対して行い、画像をキャプチャします。これは結果の例です。マージ画像、各蛍光色素の個別のチャンネル、およびそれらの組み合わせを示しています。これはSolea senegalensisの精細胞のラベルスキームです。取得した画像を確認すると、予想通りDAPIは核に、MitoTrackerはミトコンドリア環内にそれぞれ位置していることが分かります。最初のステップとして、Zスタック撮影を行います。Zスタックウィンドウに移動し、微動フォーカスを使用して、撮影の開始位置と終了位置を選択してください。最適な取得パラメータを選択し、実験を実行します。各スライドの画像が得られます。これはzスタック結果の例です。チャンネルを分割して、細胞内における各シグナルの位置を観察することができます。3Dウィンドウに移動すると、さまざまなグラフオプションを選択できます。多くのパラメータをカスタマイズできるほか、チャンネルの分割および合成が可能です。これは、Solea senegalensisの精子内における活性酸素種の局在の異なるパターンを示す3Dビューの例です。上の視野では、DCFは主にミトコンドリアに共局在していますが、下の視野では、シグナルが核まで広がっています。このビデオを視聴することで、共焦点顕微鏡を用いてこれらの精子における過酸化物の細胞内局在を評価する方法を習得できます。トラブルシューティングのアドバイスおよびその他の情報は、本文中でご確認いただけます。

evaluation-intracellular-location-reactive-oxygen-species-solea

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は、定性的および定量的研究のための様々なアメーバおよび哺乳動物細胞モデルに適用することができる反応性酸素種（ROS）の測定のためのプロトコルのセットを適合。...

、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量

ここでは、生きているゼブラフィッシュの胚の酸化ストレスを測定するためのプロトコルを報告します。この手順により、全胚組織と単一細胞集団の両方で活性酸素種(ROS)を検出できます。このプロトコルは、定性的分析と定量的分析の両方を実現します。...

ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

電子常磁性共鳴 (EPR) 分光法は、フリーラジカルを測定する明確な方法です。選択的スピン プローブは、異なる細胞コンパートメント中のフリーラジカルの検出に使用します。治療、保存、および EPR...

周囲温度、77 K で生体試料の電子常磁性共鳴の使用

精子膜の完全性、精子の受精能力に関連付けられている携帯電話の機能を評価する方法論を紹介します。精子の膜の蛍光光度法による評価のための 3 つの技術について述べる:...

蛍光光度法による精子膜評価技術

このプロトコルは、細胞内の細胞内区画特異的な酸化還元状態の評価を記述する。レドックス感受性蛍光プローブは、無傷の細胞でのレシオメトリック分析を可能にします。...

細胞内膜特異的レドックス感受性緑色蛍光タンパク質を用いた細胞酸化の評価

大腸菌 は、新生児グラム陰性細菌性髄膜炎の主な原因である。細菌感染の間、好中球によって産生される活性酸素種は主要な殺菌的役割を果たす。ここでは、大...

髄膜炎性大腸菌に感染した好中球における活性酸素種のリアルタイム定量

ここでは、ミュラーグリア細胞(MGC)中の2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブ(DCFH-DA)を用いて細胞活性酸素種(ROS)を検出するための、体系化され、アクセス可能で再現可能なプロトコルを提案する。この方法は、フローサイトメーターを用いて全細胞ROSレベルを定量する。このプロトコルは非常に使いやすく、適切で再現性があります。...

ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量

精子のミトコンドリア機能を高分解能肺活法で解析することで、密閉室系で自由に動く精子の酸素消費量を測定することができます。この技術は、精子のミトコンドリアの特徴と完全性に関する情報を提供するヒト精子の呼吸の測定に適用できます。...

ヒト精子のミトコンドリア機能を評価するための高分解能肺活法

この論文では、精液中のペルオキシダーゼ陽性白血球を調べるための経済的で効率的なプロトコルを紹介します。コンピューター支援精液分析(CASA)システムの助けを借りて、精液中のペルオキシダーゼ陽性白血球の濃度を合計60分以内に取得でき、アンドロロジーラボとアンドロロジストの効率を効果的に向上させます。...

精液中のペルオキシダーゼ陽性白血球の検査

このプロトコルはハイスループットのスクリーニングのアプローチを使用して蛍光性の染料の調査としてdihydroethidium...

ジヒドロエチジウム(DHE)蛍光色素を用いた活性酸素種(ROS)生成のハイスループットスクリーニング評価

学ぶSolea senegalensis精子における活性酸素種の細胞内局在評価法。DCFH-DA蛍光色素と共焦点顕微鏡を用いて、ミトコンドリアや核との相互作用を可視化し、酸化ストレスが精子運動性に与える影響を評価します。

やっぱりアオモンイトトンボ精子における活性酸素種の細胞内局在の評価

さらに動画を探す