Name: 排せつマッサージと精子から DNA の隔離による鳥の精液採取 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学ぶ 鳥類の排せつマッサージによる精液採取と精子DNA抽出法。野生および飼育下の鳥類から高品質なDNAを迅速に分離し、行動生態学や遺伝学研究に応用できます。

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排せつのマッサージと早期支援ありがとうサンノゼ施設と研究所のジェフリー ・ Kittilson をサポートします。この作品は、BJH に ND EPSCoR FAR0022429 賞によって支えられました。出版費用は寛大清心生物学科によってをサポートされていました。

このプロトコルは脊椎動物の動物科目を含み、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ノースダコタ州立大学でによって承認されています。
1. 精液採取排せつマッサージを使用してスズメ目の鳥から
注: 排せつマッサージ繁殖アクティブな鳥のみ、効果的な精液収集手法ですが、適切な飼育状況で繁殖シーズン以外正常に実行することができます。排せつのマッサージを使用する前にターゲット種の生殖活動を決定してください。キャプチャ時に野生の鳥や鳥が飼育下で開催、この手法を使用することができます。
<ol><li>(繁殖条件) で、雄の鳥から始まる非利き手でのバンダのグリップは、腹側 (図 1) の手のひらに触れると支配的な手に鳥を転送します。<ol>
<li>鳥の頭は手のひらの外側の縁に最も近いことを確認します。軽く頭と小指、リングおよび中指を使用してボディを保護します。これは、鳥の口と尾公開を残します。</li>
		<li>緩んでいるか、軽く手のひらを使用して拘束された鳥の足を残します。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig1.jpg"> 図 1: 排せつマッサージ グリップします。鳥はその腹側の手のひらと小指担保の頭に触れると、軽く利き手でセキュリティ保護されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol start="2"><li>腔の優れた終わりのどちら側でも支配的な人差し指と親指を置き、軽く尾 (図 2) の方の非常にわずかな圧力を適用するときに一緒に指を挟んだり。排泄腔が片脚、排せつの粘膜 (ピンク インテリア) を公開します。 注: 鳥がない場合排せつの突起が小さいことができる現在、精液を生産と排泄腔が片脚にくい。経験を持つ、繁殖アクティブおよび非アクティブの男性5,11cloacas 区別するために簡単です。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig2.jpg"> 図 2: 位置や排せつ突起を指します。優れたエンド (A) にわずかな圧力を適用することによって、総排出腔を片脚します。繁殖アクティブな男性のスズメ目、排せつの突起は明白と (B) の会社。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol start="3"><li>非支配的な手で手を安定させるために尾のベースの背側に指のパッドを配置し、すぼまり腔下親指の先端。 注: 短く、滑らかなサムネイルは排せつマッサージを実行するため有利であり傷害から鳥を保護します。</li>
	<li>中型圧力、クロアカ以下の滞在の反復運動に深いと頭側非利き手親指を移動します。鳥が射精するまで続行します。個人によって通常 1 といくつかのダース ストローク間かかります。</li>
	<li>鳥が射精すると、すぐに microhematocrit チューブで精液を収集します。複数射精を取得する排せつマッサージを繰り返します。 注: スズメ目精液は明るい茶色で、通常やや濃厚。白や暗い物質排泄腔から排出、精液は、精液のサンプルを汚染する可能性があります。腔に少量の血液の外観または混合される精液は、通常のマッサージ中にあまりにも多くの圧力によって引き起こされます。</li>
	<li>DNA の抽出の 1x PBS (pH 7.4) の 20 μ L の微量遠心チューブに精液を配置します。注: 1 × PBS で保存精液人工授精には適していませんが、後日 DNA 抽出のため使用することができます-80 ° C で保存する場合PBS 室温または冷蔵しますが、精液のサンプルが到着したとき、液体の状態にする必要があります。<ol>
<li>サンプルで精子の存在を確認するには、複合顕微鏡 (図 3) の下で希釈サンプルの少量を表示します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>抽出まで-80 ° C で希釈精液を格納します。</li>
</ol>2. 鳥の精液からの DNA の抽出
注: このプロトコルは、複数の商業 DNA 抽出キットでテストされていますが、のみ 1 つの DNA キット12で使用する場合は成功しています。キットのプロトコルからの変更手順で示されます *。
<ol><li>ジチオトレイトール (DTT) 水での 1 M 溶液を準備し、vortex.* を使用してミックス<ol>
<li>因数 DTT ソリューション使用直前まで-20 ° C で保存します。抽出する各サンプルは 1 M の DTT の solution.* の 10 μ L を必要とします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 ミリメートル pH 8.0; トリス-の Cl を含むバッファーを準備します。20 mM EDTA;200 mM の NaCL;4 %sds。各サンプルを抽出するこの buffer.* の 90 μ L が必要です。<ol>
<li>室温でバッファーを保存します。それは沈殿させた場合 dissolve.* 56 ° C に温めてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ロッカーまたは 65 にシェーカーを含むインキュベーターを予熱 ° C.*</li>
	<li>すぐに抽出を開始、する前にバッファーの場合は 10 試料を抽出手順 2.2 各サンプル抽出する、例えば900 μ L バッファーに加え 100 μ L DTT ソリューションで準備の 90 μ L で 10 μ L DTT ソリューションをミックスします。この混合物は DTT buffer.* と呼ばれる、</li>
	<li>全体の希釈精液サンプルを 70 μ L 1 × PBS を追加し、vortex.* でよく混ぜ</li>
	<li>100 μ L を追加 DTT バッファー、サンプルに 10 μ L プロティナーゼ K ソリューション。20 秒間、渦、予熱したインキュベーターで 1 時間インキュベート ロッカーまたは shaker.*</li>
	<li>200 μ L バッファー アルと 200 μ L を追加新鮮なエタノール (100%)、20 seconds.* の渦</li>
	<li>スピン列にサンプル全体を転送し、6,000 x g. 破棄で 1 分コレクション チューブを遠心分離します。</li>
	<li>新しいチューブに列を配置し、500 μ L 準備バッファー AW1 を追加します。6,000 x g. 破棄で 1 分コレクション チューブを遠心分離機します。</li>
	<li>新しいチューブに列を配置し、500 μ L 準備バッファー AW2 を追加します。6,000 x g に 1 分間遠心は、フロースルーと列がチューブに戻って配置を破棄します。</li>
	<li>20,000 x g 破棄に 3 分コレクション チューブを遠心し、1.5 mL 遠心チューブに列を配置します。</li>
	<li>ピペット 35 μ L AE の列膜に直接バッファーし、5 分ではあ、室温でインキュベート</li>
	<li>スピン列 14,000 x g 破棄に 1 分を遠心し、-80 ° C で抽出されたサンプルを格納</li>
</ol>

<ol><li>Briskie, J. V., Montgomerie, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1349186">Sperm size and sperm competition in birds.</a> Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).</li>
<li>Monaghan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+life+histories%3A+the+long+and+the+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Telomeres and life histories: the long and the short of it.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).</li>
<li>Carrell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+the+male+gamete%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of the male gamete.</a> Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).</li>
<li>Burrows, W. H., Quinn, J. P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/ps/article-abstract/16/1/19/1564432?redirectedFrom=fulltext">The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey.</a> Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).</li>
<li>Wolfson, A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4510381?seq=1#page_scan_tab_contents">The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds.</a> Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).</li>
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<li>Criscuolo, F., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-048X.2008.04623.x/abstract">Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres.</a> J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).</li>
<li>Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. <a target="_blank" href="http://www.birds.cornell.edu/homestudy/handbook-of-bird-biology">Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition</a>. , Wiley-Blackwell, Princeton University Press. ISBN 9781118291047 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.scribd.com/document/54238221/QIAamp-DNA-Micro-Handbook">QIAamp DNA Micro Handbook</a>. , Third edition (2014).</li>
<li>Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+DNA+extraction+method+for+sperm+on+the+perivitelline+membrane+of+avian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs.</a> Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).</li>
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<li>Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+morphology+and+sperm+velocity+in+passerine+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).</li>
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<li>Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/232663050_Attempted_Semen_Collection_Using_the_Massage_Technique_and_Semen_Analysis_in_Various_Psittacine_Species">Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species.</a> J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

シンプルで信頼性の高い繁殖アクティブ状態でない中小鳥から精液を収集し、鳥の精子から DNA を抽出法について述べる.
記述されていた精液の DNA の抽出のプロトコルは便宜上、キットからは変更が、鳥ザーメン使用の洗練されました。精子が標準抽出化学9,13、溶解耐性と産スズメ目鳥から収集した精液のサンプルが非常に小さい (通常数マイクロリットル)。これらの要因は、DTT の適切な濃度を使用し、65 ° c. で孵化によって正常に克服するための課題を提示します。このメソッドを使用して、我々 は一貫して精子テロメアの長さ (通常 40 250 ng/μ L、射精量に応じて) 間の qPCR の分析のための使用可能な量の DNA を分離しています。
DTT は、フェノール/クロロホルム反応13との組み合わせで鳥の精子から DNA を抽出する以前使用されています。フェノール...

鳥が生物学の研究に幅広く使用されている精子は排せつを使用して簡単にサンプリングすることができますと精子の質と競争1、精子テロメア ダイナミクス2エピジェネティクス3と似たようなトピックを含む研究のための理想的な科目マッサージ。排せつマッサージは鳥4,5,6から精液を収集するための穏やかな、非侵襲的な手動技術です。繰り返しサンプルを簡単に得ることができる、特別な工具も不要、簡単にフィールドまたはラボで実行できるように。排せつのマッサージは、何十年も使用されている、利用可能な説明が書かれてから学ぶことは困難です。このパブリケーションは、排せつマッサージを学習に関わる不確実性を低減するものです。
排せつマッサージを使用して鳥から収集した精液は、運動評価4,7または人工授精8、すぐに使用または高度なイメージングおよび DNA の抽出等の用途として冷凍することができます。スズメ目の鳥から精液サンプルは小さいが密集精子を含まれています。精子9の特殊な保護機能を克服するための変更を簡単にするため商業抽出キットを使用して DNA を抽出します。抽出後、qPCR10を使用して精子テロメアを測定できます。

<table><tbody><tr><td>マイクロヘマトクリット毛細管フィ</td><td>ッシャーブランド</td><td>22-362566</td><td>任意のサプライヤーを使用することができます。チッピングスズメのような非常に小さなスズメ目の鳥など、小さな精液サンプルの収集には、より小さなチューブがより効果的である可能性があります。</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Any</td><td></td><td>DNA抽出前に精液サンプルを保管するために使用されます。</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td>どのサプライヤーでも使用できます。</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1233508</td><td>どのサプライヤーでも使用できます。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td>どのサプライヤーでも使用できます。</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td>どのサプライヤーでもご利用いただけます。</td></tr><tr><td>QIAamp DNAマイクロキット</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Qiagen QIAamp DNAマイクロキットは特にお勧めです。このDNA抽出プロトコルは、他の市販のキットでも試みられていますが、ほとんど成功していません。この理由は私たちには不明です。</td></tr></tbody></table>

排せつマッサージと精子から dna の隔離による鳥の精液採取

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

精液の採取は、精子の質、精子テロメア ダイナミクス、エピジェネティクス研究を含むアプリケーションの広い範囲のために役立ちます。鳥は広く使用されている科目は、生物学的研究、繰り返し精子サンプルを含む研究に最適です。ただし、いくつかのリソースは現在利用可能な収集および鳥の精子から DNA を抽出する方法を学びたい人のためです。ここで排せつマッサージ、鳥精子を収集するための穏やかな、非侵襲的な手動技術について述べる。文献でこの手法を確立すると、使用可能な記述から学ぶことは困難ことはできます。また、変更と商業抽出キットを使用して鳥の精液から DNA を抽出するための情報を提供いたします。排せつマッサージは、生殖状態で中規模男性鳥で容易に使用することができます。次のコレクション、精液は運動アッセイのためすぐに使用または記載プロトコルを次の DNA の抽出のために冷凍できます。この抽出プロトコル鳥精子の洗練された、いくつかのスズメ目種 (通行人国立公園、 Spizella passerina、 Haemorhous メキシコ、およびつぐみ migratorius から収集されたサンプルで正常に使用されています。) と 1 つの columbid (コルンバ ・ リヴィア)。

排せつマッサージと DNA 抽出を使用していくつかのスズメ目種と 1 つの columbid (表 1) で行われた記述のプロトコル。排せつマッサージによって収集された精液に精子の存在は、400 倍の倍率 (図 3) で少量の化合物顕微鏡下で希釈した試料を表示することによって確認されました。ここで説明されているプロトコルを使用して家すずめから収集された精液のサンプルから DNA を抽出後、8 個のサンプルはゲル電気泳動法 (図 4の 3 つのサンプルを見ることができる) DNA の梯子で実行しました。高品質 DNA の分離を成功させるに示すサンプル レーンのすべての 8 で塗りつけなし明瞭なバンドを見た。このプロトコルを使用して抽出した他のすべてのサンプルは、分光光度計 (テーブル 1を参照) を用いた DNA 濃度の評価されました。
<p class="jove_content...

このプロトコルでは、排せつマッサージ、鳥、および変更と商業抽出キットを使用して鳥の精子から DNA の抽出から精液を収集するため非侵襲的な手動技術について説明します。

排せつマッサージと精子から DNA の隔離による鳥の精液採取

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

この手順の全体的な目的は、雄鳥から精液を採取し、その精液サンプルからDNAを単離することです。この手法は、精子競争やエピジェネティックな遺伝に関連する、行動生態学および進化生態学における重要な問いに答えるために利用できます。この技術の主な利点は、操作が簡便であることです。総排腔マッサージはフィールドやラボで迅速に実施でき、DNA抽出法には市販のキットに修正を加えたものが用いられます。この手法は、繁殖期の野生鳥類または飼育鳥類に使用でき、特定の飼育状況下では年間を通じて有効です。非利き手でバンダーズグリップを用い、生殖的に活性なオスを保持します。次に、鳥の腹側を手のひらに、頭を手のひらの外側に合わせて利き手に移します。ここで、小指、薬指、中指を使って頭と体を軽く固定します。これで、鳥の総排泄孔と尾が露出した状態になります。脚はそのままにするか、手のひらで軽く固定します。次に、利き手の人差し指と親指を総排泄腔の上端の両側に添え、尾の方へ向かって軽く圧迫しながら軽くつまむことで、総排泄腔を外反させます。鳥が精液を産生していない場合を除き、ピンク色の総排泄腔粘膜が明確に現れます。経験を積めば、生殖活動中のオスと活動していないオスの総排泄腔を容易に区別できるようになります。精液を採取するには、安定させるため、非利き手の人差し指の腹を尾根の基部背面にあて、親指の先を翻転した総排泄腔の直下に配置します。爪は短く滑らかに切り揃えておくことを強く推奨します。次に、中程度の圧力をかけながら、親指を深部かつ頭側に向かって繰り返し動かし、鳥が射精するまで総排泄腔より下の位置を保持します。射精までには、わずか1回のストロークから数十回のストロークを要する場合があります。鳥が射精した直後に、粘性のある淡褐色の精液をマイクロヘマトクリット管に回収します。白または暗色の物質は汚染物質であり、少量の血液でも圧力がかかりすぎたことを示します。必要に応じてマッサージを繰り返し、複数の射精物を回収してください。DNA抽出を行う場合は、サンプルを20 µLのPBSが入ったマイクロ遠心チューブに移します。サンプル中に精子が存在することを確認するため、希釈したサンプルを少量取り、複合顕微鏡を用いて400倍の倍率で観察します。その後、使用時まで精子サンプルを-80 °Cで保存します。本プロトコルは、市販のキットを改変したものです。1 M DTT水溶液を10 µLずつ分注して調製し、-20 °Cで保存しておきます。DNA抽出を開始する直前に、各サンプルに対してDTT分注液と塩化トリス分注液を混合します。次に、各サンプルに70 µLのPBSを加え、混合液をボルテックスで撹拌します。次に、各サンプルにDTT緩衝液混合液1回分とプロテイナーゼK溶液10 µLを加えます。サンプルを混合するため、20秒間ボルテックス処理します。その後、サンプルをシェーカー付きの65 °Cインキュベーターに入れ、緩やかに撹拌しながら1時間インキュベートします。インキュベーション後、200 µLのバッファーALと200 µLの新鮮な100% ethanolを加え、サンプルを20秒間ボルテックスします。その後、各サンプルをスピンカラムに移し、6,000Gで1分間遠心分離します。回収チューブを廃棄し、カラムを新しいチューブに設置します。カラムに500 µLのバッファーAW1を加え、再度遠心分離します。再び回収チューブを廃棄し、カラムを新しいチューブにセットします。次に500 µLのバッファーAW2を加え、遠心分離サイクルを繰り返します。次にフロースルーを捨て、スピンカラムを再び遠心機にかけ、20,000Gで3分間遠心分離します。その後、回収チューブを捨て、カラムをマイクロ遠心チューブにセットします。カラムのメンブレンに直接35 µLのバッファーAEを加え、室温で5分間静置してDNAを溶出させます。次に、DNAを含む溶出バッファーを60秒間の遠心分離によってマイクロ遠心チューブに移します。その後、カラムを廃棄し、DNAを-80°Cで保存します。上述の総排泄腔マッサージおよびDNA抽出法は、複数のスズメ目の種および1種のハト科の種において成功しています。抽出したDNAのゲル電気泳動において、スマアリングのない明瞭なバンドが確認されれば、高品質なDNAの単離に成功したことを示します。この例はイエスズメの精液から得られたDNAです。このビデオを視聴することで、総排腔マッサージを用いて生殖可能な雄鳥から精液サンプルを愛護的に採取する方法と、抽出キットを用いてそれらの精液サンプルからDNAを抽出する方法について十分に理解できるはずです。適切に習得すれば、総排泄腔マッサージは正しく行うことでわずか数秒で完了させることができます。

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生物学

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