液体クロマトグラフィーによるイオン移動 QTOF 質量分析法によるタンパク質のバイオ医薬品の宿主細胞蛋白質の定量化のための HS MRM アッセイ

HS-MRMアッセイの全体的な目標は、ペプチド前駆体のイオンモビリティー分離とフラグメントイオンの高分解能質量分析検出を組み合わせることで、ペプチドまたはタンパク質の定量に影響を与えるMRM干渉現象を低減することです。この方法は、バイオ医薬品の特性評価、タンパク質またはペプチドバイオマーカーの定量化、定量的プロテオミクスの分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、バイオ医薬品タンパク質に存在する可能性のある低存在量の宿主細胞タンパク質を検出できることです。

まず、データ取得ソフトウェアで解析方法の作成をクリックし、生成および取得および処理方法を選択します。メソッドの名前と説明を入力し、メソッドフォルダを参照して[次へ]をクリックします。[Analysis type] で [peptide map IMS] を選択し、[next] をクリックします。

次に、現在のシステム構成を選択し、[次へ]をクリックして終了します。新しく作成した分析法で、[装置]タブをクリックし、バイナリー溶媒マネージャーを選択し、グラジエント設定を編集して、毎分 0.2 ミリリットルの流速でペプチド分離を実現します。溶媒 B を 1 から 40% まで 30 分間でグラジエント希釈し、その後 2 分間のカラム洗浄と 10 分間の平衡化を行い、合計実行時間は 45 分です。

次に、サンプルマネージャーを選択し、サンプル温度を摂氏10度に、カラム温度を摂氏60度に設定します。「装置」タブで、「Vion IMS QTof」装置を選択します。設定セクションで、アナライザーモードの感度を選択し、キャピラリー電圧に3キロボルト、ソース温度に摂氏100度、脱溶媒温度に摂氏250度、コーンガスフローに毎時50リットル、脱溶媒ガスフローに毎時500リットルを入力します。

[Experiment] タブをクリックし、モードとして [High Definition MSE] を選択します。次に、低質量の場合は 100、高質量の場合は 2000、スキャン時間の場合は 0.4 秒を入力します。衝突エネルギーのセクションでは、低エネルギー設定に6電子ボルトを入力し、15〜40電子ボルトの高エネルギーランプを選択します。

取得時間には、5 分から 30 分のカスタム ランタイムを使用します。次に、[オプション]タブをクリックし、自動ロック修正間隔が5分の自動ロック修正モードを選択します。次に、[ロック修正を続行]オプションを選択し、自動検出チェックが無効になっていることを確認します。

現在のシステム設定メニューで、Vion IMS QTof装置を選択し、[ツール]をクリックします。キャピラリー電圧は3キロボルト、サンプリングコーンは40ボルト、ソースオフセットは100ボルト、ソース温度は摂氏100度、脱溶媒温度は摂氏250度、コーンガスフローは毎時50リットル、脱溶媒ガスフローは毎時500リットル、基準キャピラリー電圧は3キロボルトを入力します。以前に調製した10ナノモルのフェイクスパイクサンプルを、前述のLC-HDMSEアッセイを使用して分析し、10マイクロリットルのサンプルを装置に注入します。

ここでは、フェイクペプチド混合物に含まれる6種類のホスホリラーゼBペプチドスタンダードの個々の配列を、HDMSE実験で観察された保持時間および最も豊富な前駆体とともに示しています。ここには、インフリキシマブ消化物にスパイクされたフェイクペプチドの1つについて取得したHDMSEスペクトルが示されています。データ集録ソフトウェアで、create analysis methodをクリックし、generate and acquire and process methodを選択します。

メソッドの名前と説明を入力し、メソッドフォルダを参照して[次へ]をクリックします。分析タイプとして「定量」を選択し、「Quantify Assay Tof 2D Chromatographic」を選択して、「next」をクリックします。次に、現在のシステム構成を選択し、[次へ]をクリックして終了します。

新しく作成したメソッドのインストゥルメントタブをクリックします。バイナリーソルベントマネージャーを選択し、グラジエント設定を編集して、毎分 0.2 ミリリットルの流速でペプチド分離を実現します。溶媒Bを1〜40%溶媒Bにグラジエント希釈して30分で希釈し、その後2分間のカラム洗浄と10分間の平衡化を行い、合計実行時間は45分です。

[装置]タブで、サンプルマネージャーを選択し、サンプル温度を摂氏 10 度に、カラム温度を摂氏 60 度に設定します。次に、Vion IMS QTof装置を選択し、設定セクションでアナライザーモードの感度を選択します。次に、キャピラリー電圧に3キロボルト、ソース温度に摂氏100度、脱溶媒温度に摂氏250度、コーンガスフローに毎時50リットル、脱溶媒ガスフローに毎時500リットルを入力します。

[実験] タブをクリックし、[実験の種類] で [関数テーブル] の 1 つ以上の MS、MSMS、または MRM 関数を選択します。デフォルトの取得機能を削除し、[add plus MRM] をクリックして、ランタイム セクションで保持期間パラメーターを編集します。Tof MRM機能エディターで、ペプチドプリカーサーマスターチャージ比を入力し、プリカーサー分解能としてlowを選択し、プリカーサーチャージ状態を入力します。

次に、開始衝突エネルギーに16電子ボルト、固定スキャン時間に0.1秒、スペクトルカラムに幅の広い製品マスター電荷比を入力します。複製ボタンを使用して、さらに 10 個の MRM 遷移を追加し、18 から 36 電子ボルトの範囲で異なる衝突エネルギー値を使用します。各ペプチドの最適な3つのトランジションを確立した後、Tof MRM実験を行い、各ペプチドで生成されるシグナルを最大化するための最適なコリジョンエネルギーを見つけました。

次に、ペプチドごとに1つのフラグメントイオンのみを含むHS-MRMメソッドを設定します。以前に作成した Tof MRM メソッドを変更するには、Tof MRM 関数の代わりに HS-MRM 関数を選択します。HS-MRM 関数エディターで、マスター電荷比を入力し、プリカーサー分解能で low を選択し、プリカーサー電荷状態を入力します。

次に、前駆体CCS値を入力し、前駆体CCS分解能を低に設定します。製品イオンについては、マスター電荷比を入力し、最適な衝突エネルギーを選択し、スキャン時間を0.4秒に選択し、すべての同位体を含むワイドスペクトル設定を選択します。最終的なHS-MRMアッセイは、各ペプチドの最適なトランジションのみを保持し、スパイクされたすべてのサンプルの分析に使用されます。

HS-MRMデータ取得法用に作成した解析法で、目的タブをクリックし、コンポーネントの管理を選択します。[実験の種類] のドロップダウン メニューから、[HS MSMS/HS MRM] オプションを選択します。「create」をクリックし、コンポーネント名、予想保持時間、抽出時間ウィンドウ、およびプリカーサーマスターチャージ率を入力します。

[XIC 抽出モード] を選択し、必要な CCS 値を入力します。フラグメントイオンについては、その充電状態とマスター電荷比を入力します。次に、HS-MRMアッセイでモニターしたすべてのペプチド成分を入力します。

同じHS-MRM取得法の目的タブで、デフォルトの量をクリックし、すべてのフェイクペプチド成分について0.1、1、10、および100ナノモルを入力します。最初の値を入力したら、右クリックして[フィルダウン]オプションを選択し、すべてのコンポーネントに同じ濃度を入力します。検量線の4つの濃度すべてについて同じ手順を繰り返します。

次に、[処理]タブに移動し、[抽出設定]をクリックします。質量許容誤差として 10 PPM を入力します。次に、[CCS drift time tolerance] をクリックし、[CCS tolerance] に 5% を入力します。

[解析]タブで、ピーク処理設定を選択します。スムージング セクションで、スムージング アルゴリズムとして mean を、半値幅として 1 つ、反復として 1 つを選択します。「波形解析」セクションで、「Automatic peak width」オプションと「automatic detection」オプションの両方にチェックが入っていることを確認します。

次に、処理タブで対象の画面設定を選択し、RTウィンドウでRTに最も近いオプションを選択します。次に、保持時間の許容範囲に 0.2 分を入力します。定量設定を選択し、キャリブレーションメニューで、検量線フィットタイプにlinear、重量タイプにOne over x squared、成分値タイプに濃度、成分値単位にミリモル/リットル、平均化によるキャリブレーションポイントの計算になしを選択します。

定量化メニューで、応答値としてareaを選択します。ここでは、すべての濃度にわたってフェイクペプチドに対して生成された HS-MRM クロマトグラムの例を示します。HS-MRMピークの波形解析後に各ペプチドについて得られた検量線をここに示します。

ここでは、4 回の繰り返し注入に基づいて計算されたピーク面積の相対標準偏差をまとめます。高選択性MRMアッセイは、イオンモビリティー前駆体分離とターゲット高分解能質量分析検出の両方を組み込んでいるため、バイオ医薬品のバッチ全体で複数の宿主細胞タンパク質の高速かつハイスループットなモニタリングアッセイになる可能性が大いにあります。このビデオを見れば、Vion IMS QTof装置で高選択性MRMアッセイを設定する方法について十分に理解できるはずです。