Name: 液体クロマトグラフィーによるイオン移動 QTOF 質量分析法によるタンパク質のバイオ医薬品の宿主細胞蛋白質の定量化のための HS MRM アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 学ぶHS-MRMアッセイによるイオン移動分離と高分解能質量分析を組み合わせたペプチド定量法。バイオ医薬品中の低豊度宿主細胞タンパク質の検出精度を向上させ、創薬研究に応用可能です。

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著者は、図 6 の原稿を準備するためレスリー Malouin と水株式会社からトニー カトリンを感謝したいです。

1. インフリキシマブ ダイジェスト (〜 24 時間手続き) の準備
<ol><li>重炭酸アンモニウム 50 ミリメートル、50 ミリメートル NH4HCO3, 500 mM ジチオトレイトール (DTT) 50 mM NH4HCO3と 50 mM NH4HCO3で 500 mM ヨードアセトアミド (IAM) の 1% アニオン界面活性剤の新鮮なソリューションを準備します。</li>
	<li>50 mM NH4HCO3750 μ L、インフリキシマブ mAb (10 mg/mL) 200 μ L と 1% アニオン界面活性剤溶液 50 μ L を追加し、0.05% アニオン界面活性剤の存在下で 60 ° C で 15 分のタンパク質を変性します。</li>
	<li>500 mM DTT の 40 μ L を追加し、20 mM DTT 存在下で 60 ° C で 60 分のサンプリングを軽減します。</li>
	<li>500 mM IAM の 20 μ L を追加し、アルキレート 〜 10 mM IAM の存在下で暗闇の中で部屋の温度で 30 分のサンプル。</li>
	<li>MS シーケンス グレード Lys C/トリプシンの 20 μ g を含むバイアルに遠心チューブの内容を追加し、37 ° C で 3 時間サンプルをダイジェスト</li>
	<li>MS シーケンス グレード Lys C/トリプシンのダイジェスト サンプル一晩 (12-15 h) 37 ° C で 20 μ g が含まれている別のバイアルに消化されたサンプルを転送することによって第二の酵素分注 (20 μ g) を追加します。</li>
	<li>夜通し分解後 100% ギ酸 (FA) の 5 μ l 添加し酸不安定なアニオン界面活性剤を分解する 37 ° C で 30 分間のダイジェストを孵化させなさい。</li>
	<li>アニオン界面活性剤の不溶性成分の沈殿物を遠心分離機で 4,000 x g で 15 分のダイジェストをスピンダウンします。</li>
	<li>インフリキシマブ ダイジェスト 〜 1,000 μ L を回復し、LC - オートサンプラー バイアル。ダイジェスト濃度は、〜 2 mg/mL をする必要があります。LC/MS システム解析の準備が整うまでは、-20 ° C で冷凍庫でダイジェストを格納します。</li>
</ol>2. スパイク ペプチド標準 (30 分程度)
<ol><li>室温でベンチにガラス瓶で冷凍のサンプルを置くことによってインフリキシマブ ダイジェストを解凍します。</li>
	<li>フォーからのすべての 6 ペプチド標準原液 1 μ M を準備する H2O 1 つウサギ ホスホリラーゼ b (フォー) ダイジェスト バイアルで FA (バイアルが含まれています各ペプチドの 1 nmol には) バイアルに含まれている 0.1 %1 mL を追加します。</li>
	<li>準備 4 x 1 mL 希釈溶液 0.1、1、10、および 100 nM ペプチド、0.1% を使用してを取得するフォー原液の希釈溶剤として FA。ガラス瓶 (LC 自動サンプラー バイアル) ですべての希釈を準備し、背景のマトリックスとしてすべてのバイアルにインフリキシマブ ダイジェストの 100 μ L を追加します。各 10 μ L 注入ダイジェスト背景に段の 2 μ g をロードします。希薄化後インフリキシマブ ダイジェストを含む空白のサンプルを準備 (、同じ 1:10 希釈)、ないスパイク ペプチド。</li>
</ol>3. LC/焦点電子データ取得方法のセットアップ
メモ: ワークフロー HS MRM 集録のセットアップに必要な手順をまとめた図 1 に描かれている、詳細セクション 3-6 に記載されています。各監視対象ペプチド、エレクトロ スプレー イオン化を次の最も豊富なペプチド イオンの親 m/z の保持時間を確立するデータに依存しない焦点Eデータセットの取得が必要し、対応する CCS (衝突クロスセクション) はイオン移動度の分離から派生します。さらに、データに依存しない dataset は、各ペプチド前駆体の 3 つの最も豊富なフラグメント イオンの m/z に関する情報を提供します。ワークフロー (CE 最適化) の 2 番目の手順では、アッセイの感度は各フラグメント イオンの高いイオン強度を得るために衝突細胞エネルギーをチューニングすることによって増加します。最後に、最後の手順で上記のすべてのパラメーターは監視各ペプチド HS MRM メソッド エディターを紹介します。
<ol><li>四重極飛行時間 (QTOF) 質量分析計データに依存しない取得法 (焦点E) を用いた超高性能液体クロマトグラフィー システムを結合の LC/MS 測定実験を行います。 注: 楽器の構成に関する詳細については、材料のセクションに含まれます。この楽器は、ペプチド前駆体10の分離のための旅行波イオンのモビリティのデバイスを使用します。</li>
	<li>準備 0.1% 水 (溶媒) で FA および 0.1% を含む 2 つの移動相アセトニ トリル (溶剤 B) で FA。 注: は、スパイク mAb ダイジェストの分離の荷電表面ハイブリッド (CSH) C18 カラム (2.1 × 150 mm、充填 1.7 μ m 粒子) を使用します。</li>
	<li>データ集録ソフトウェア「作成/分析法」をクリックしてし「買収の生成と処理方法」を選択メソッド名を入力、メソッド フォルダー (ディレクトリ) を参照し、「次へ」をクリックしてください</li>
	<li>「分析型」の「ペプチド マップ (IMS)、"を選択し、"楽器システム"タブで「第四紀溶剤マネージャー」計測器を選択します。200 μ L/分使用溶剤 B 30 分は続く 2 分列洗浄 40 %1 からグラジエントの流量でペプチドの分離を達成するためにグラデーションの設定を編集し、50 分の総ランタイムでの 9 分平衡をこれらの実験的導入LC メソッド エディターのパラメーター。</li>
	<li>「楽器システム」タブで「サンプル マネージャー」計測器を選択します。カラム温度 60 ° c と 10 ° C にサンプル温度を設定します。</li>
	<li>正イオン ESI 感度モード、30,000 の半値幅の典型的な解像力 QTOF 質量分析計を動作します。 注: LC/焦点Eは急速に (衝突の細胞) に衝突エネルギーを交互にスキャンを集めることによって動作するデータ集録 (DIA) モード (MS チャネル 1 スキャンの 6 V) の低エネルギーと高エネルギー (15-40 V ランプにMS チャネル 2 の前駆体選択なし断片化スペクトルを生成します)。<ol>
<li>データ集録ソフトウェアのデフォルト ソース関連 MS パラメーターを入力:「私の仕事/楽器システム、」"ヴィオン IMS Qtof"タブを選択「ツール」メニューでこれらのパラメーターを入力から: 3.0 kV キャピラリー電圧、100 ° C ソース温度、100 V のソースオフセット、50 L/h 円錐コーン電圧 40 V と流れ。脱溶媒温度を 250 ° C、500 L/h、脱溶媒ガス流量および 3.0 にキャピラリー電圧に設定 kV。</li>
		<li>データ集録ソフトウェア「作成/分析法」をクリックしてし「買収の生成と処理方法」を選択メソッド名を入力メソッド フォルダー (ディレクトリ) を参照し、「次へ」をクリックしてください</li>
		<li>「分析型」の「ペプチド マップ (IMS)、"を選択し、"楽器システム"タブで"ヴィオン IMS QTof"計測器を選択します。「完了」をクリック 注: 新しく作成された LC/焦点Eメソッドは「楽器法の構成」画面自動的に開きます。</li>
		<li>「設定」タブでこれらのパラメーターを入力: 3.0 kV キャピラリー電圧、100 ° C ソースの温度溶媒温度を 250 ° C、50 L/h 円錐形ガス フロー、および 500 L/h 脱溶媒ガスの流れ。</li>
		<li>「実験」タブの設定で「高精細 MSE」を選択し「分析法ランタイム」を選択「スキャン設定」タブでこれらパラメーターを入力: 質量 100;高質量、2,000;スキャン時間、400 さん「CE」タブで、「6 V」の省エネ設定を入力し「無効データ縮小」チェックがあることを確認 (動) 40 15 から高エネルギー ランプを選択します。</li>
		<li>50 ng/mL ロイシン エンケファリン (ル) 0.1% と 50% アセトニ トリルで準備のソリューションを吹き込むデータ集録中にロック質量校正用 10 μ L/分の流量で FA。 注: 同じ質量範囲にわたって同じレートを使用して 5 分ごとロック-大量のデータを取得します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>(読み込まれている量の列は各ペプチド標準 100 fmol) サンプルの 10 μ L 注入によって上記 LC/焦点Eアッセイを用いた 10 nM、フォー スパイク サンプルを分析します。</li>
</ol>4. 衝突エネルギー (CE) 最適化法 Tof MRM のセットアップ
<ol><li>LC/焦点Eデータセットから各フォー ペプチド フラグメント イオン m/z、前駆体、リテンション時間を取得します。M/z との最も豊富な充電状態を保持フラグメント イオンを前駆イオンと対応する 3 つの最も豊富な。 注: 通常 LC/焦点Eアッセイによって記録される低エネルギーと高エネルギーのスペクトルの例は図 2 の表示です。</li>
	<li>SRM/MRM 実験で衝突エネルギー (CE) の最適化を使用して、各ペプチド23の最高の信号を取得します。<ol>
<li>データ集録ソフトウェア「作成/分析法」をクリックしてし「買収の生成と処理方法」を選択メソッド名を入力、メソッド フォルダー (ディレクトリ) を参照し、「次へ」をクリックしてください</li>
		<li>「分析型」の「数量」を選択「数量アッセイ Tof 2次元クロマトグラフィー"を選択し、"次へ"をクリックしてください「楽器システム」タブで「ヴィオン IMS QTof」を選択し、「完了」をクリック 注: 新しく作成された Tof MRM メソッドは「楽器法の構成」画面自動的に開きます。</li>
		<li>「設定」タブでこれらのパラメーターを入力: 3.0 kV キャピラリー電圧、100 ° C ソースの温度溶媒温度を 250 ° C、50 L/h 円錐形ガス フロー、および 500 L/h 脱溶媒ガスの流れ。</li>
		<li>「実験」タブの設定で「関数テーブル」を選択し、「1 つまたは複数 MS、MSM、MRM 関数」各ペプチド「Tof MRM」機能を設定する 3「切り替え効果」(最も豊富な前駆体とその最も豊富なフラグメント イオンの 3 つの組み合わせ) を入力して下向きの矢印を使用して。 注: Tof MRM では、最高感度が得られますスケジュールされた MRM アプローチ。</li>
		<li>「Tof MRM」関数エディターでペプチドの溶出順序に従って整理される各ペプチド (少なくとも 1 分)、1 つの保持時間ウィンドウを選択します。「Tof MRM」関数エディターで挿入ペプチド前駆体 m/z と製品 m/z;ペプチド前駆体; の「低」(4 Da ウィンドウ) としてクワッド分離ウィンドウを選択します。100 ms; 固定スキャン時間を選択します。14-36 V の範囲で 12 の異なる衝突エネルギー値を次のように選択と: 14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、および 36、図 3 の例で示すように。 注: 上記 Tof MRM 法、クロマトグラフィーのピークあたり少なくとも 10 のデータ ポイントは指定各 CE の各遷移に対して収集されます。データ ファイルのサイズを減らすためには、フラグメント イオンの信号 (6 Da ウィンドウ) の「ワイド」のオプションを選択します。CE 最適化値の例を表 2 に示します。</li>
		<li>(読み込まれている量の列は各ペプチド標準 100 fmol) サンプルの 10 μ L 注入によって上記 Tof MRM アッセイを用いた 10 nM、フォー スパイク サンプルを分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 最終 HS MRM 買収ペプチド前駆体のイオン移動度の分離を使用したペプチドの定量化法のセットアップ
<ol><li>データ集録ソフトウェアの「調査」メニューのすべてのペプチドの各 CE 用に生成されたすべての 11 ガスクロマト グラフ トレースを表示し、「処理オプション/操作」ツールバーから「統合」ボタンを使用してピークを統合最高のピーク領域は、各遷移に対して最高の CE を示されます。</li>
	<li>3 各ペプチド断片の最高のピーク面積を比較し、保持は最高の「移行」(フラグメント イオン最も強烈な信号を生成する);表 2 には、最高 4 つのフォー ペプチドから得られる「切り替え効果」が表示されます。</li>
	<li>ペプチドあたり 1 つだけのフラグメント イオンを含む HS MRM メソッドをセットアップします。LC/焦点Eデータセットから各ペプチド前駆体の CCS の値を使用します。<ol>
<li>前のセクション (セクション 4) で作成した Tof MRM メソッドを修正するには、「Tof MRM」関数ではなく「HS MRM」関数を選択します。</li>
		<li>「HS MRM」関数エディターで次の前駆体関連パラメーターを入力: m/z、四重極の解像度: (4 Da) を低、充電状態、前駆体 CCS 値および前駆体 CCS 解像度: 低。製品イオンその m/z、最適な衝突エネルギーを入力、0.4 s の選択スキャン時間を選択に含めるすべての同位体の「ワイド」スペクトル設定 (6 Da)。すべての 4 つのペプチド最終 HS MRM 獲得手法の例である図 4. します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルの分析すべて空白の mAb のダイジェストから始まる HS MRM メソッドを使用して (非スパイク サンプル)、4 複製注射 (各 10 μ L) 以下の濃度の続く: 0.1、1、10、および 100 nM フォー ペプチド。</li>
</ol>6. HS MRM データセットの解析処理手法の作成
<ol><li>HS MRM データセットの分析のための処理メソッドを作成します。<ol>
<li>「HS MRM」データ取得メソッドは、分析法、「目的」タブをクリックして「コンポーネントを管理」を選択、</li>
		<li>下「実験型」ドロップ ダウン メニューから「HS MS/MS/HS MRM」オプションを選択します。</li>
		<li>「作成/新規エントリ」をクリックしてし、処理メソッド エディターで以下パラメーターを紹介: ペプチド保持時間 (RT) 前駆体充電状態、前駆体 m/z、および前駆体ドリフト時間 (DT).フラグメント イオンの質量と電荷の状態を入力し、抽出モードとして"XIC"トレースを指定します。</li>
		<li>同じ「HS MRM」獲得法「目的」タブ、「初期設定額」をクリックしてし下記の濃度を入力: 0.1、1、10、および 100 nM フォー ペプチド。</li>
		<li>「処理/抽出設定」で以下のパラメーターを入力してください: デフォルトの質量許容値、10 ppm (すべてのフラグメント イオンの m/z) の時、5% のドリフトの既定フォー ペプチドの処理方法の例については、図 5 に示すです。</li>
		<li>校正型線形カーブ フィット 1/2加重 X を選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>HS MRM データすべてのクロマト グラムを統合し、各フォー ペプチドの検量線を作成するプロセス。</li>
</ol>

<ol><li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutic+proteins+by+comprehensive+online+two-dimensional+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry.</a> MAbs. 4, 24-44 (2012).</li>
<li>Schenauer, M. R., Flynn, G. C., Goetze, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+host-cell+protein+impurities+in+biotherapeutics+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification of host-cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry.</a> Anal Biochem. 428, 150-157 (2012).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+tracking+of+host-cell+proteins+during+monoclonal+antibody+purifications+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Comprehensive tracking of host-cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry.</a> MAbs. 6, 659-670 (2014).</li>
<li>Farrell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+host-cell+protein+analysis+using+two-dimensional+data+independent+LC-MS%28E%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative host-cell protein analysis using two-dimensional data independent LC-MS(E).</a> Anal Chem. 87, 9186-9193 (2015).</li>
<li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+low-abundance+host+cell+protein+impurities+in+high-purity+monoclonal+antibodies+down+to+1+ppm+using+ion+mobility+mass+spectrometry+coupled+with+multidimensional+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography.</a> Anal Chem. 87, 10283-10291 (2015).</li>
<li>Doneanu, C. E., et al. Improved identification and quantification of host cell proteins (HCPs) in biotherapeutics using liquid chromatography mass spectrometry. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bk-2015-1202.ch013?src=recsys">Technologies for therapeutic monoclonal antibody characterization, vol. 3: Defining the next generation of analytical and biophysical techniques</a>. , Washington DC. ACS Symposium series 1202 357-393 (2015).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+co-elution+of+host-cell+proteins+with+monoclonal+antibodies+during+protein+A+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Characterization of the co-elution of host-cell proteins with monoclonal antibodies during protein A purification.</a> Biotechnol Prog. 32, 708-717 (2016).</li>
<li>Reisinger, V., Toll, H., Mayer, R. E., Visser, J., Wolschin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometry+based+approach+to+host+cell+protein+identification+and+its+application+in+a+comparatibility+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometry based approach to host cell protein identification and its application in a comparatibility exercise.</a> Anal Biochem. , 1-6 (2014).</li>
<li>Madsen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+complete+characterization+of+host-cell+proteins+in+biotherapeutics+via+affinity+depletions%2C+LC%2FMS%2FMS+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Toward the complete characterization of host-cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC/MS/MS and multivariate analysis.</a> MAbs. 7, 1128-1137 (2015).</li>
<li>Giles, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+trevelling+wave-based+radio-frequency-only+stacked+ring+ion+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Applications of a trevelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18, 2401-2414 (2004).</li>
<li>Anderson, V., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometric+multiple+reaction+monitoring+assays+for+major+plasma+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 573-588 (2006).</li>
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<li>Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+collision+energy+optimization+on+the+measurement+of+peptides+by+selected+reaction+monitoring+%28SRM%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).</li>
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</ol>

すべての著者は、いくつかの試薬とこの記事で使われている楽器のプロデューサーである水株式会社の従業員です。

高解像度 (Rs > 20,000) 質量分析法は各種計測器プラットフォームに治療用タンパク質の構造解析に使用します。対照的に、MS を用いたタンパク質定量は通常に対して SRM/MRM によって低解像度 (Rs 〜 1,000) タンデム四重極質量分析計署名ペプチッド蛋白質11,12の酵素の開裂によって生成されたを使用して,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. 一つ次元のクロマトグラフィー分離は完全に酵素消化によって生成される複雑なペプチド混合物を解決できない、ペプチド共溶出は単一タンパク質ダイジェストの場合でも、頻繁に発生します。非常に複雑なタンパク質ダイジェスト (例えば、治療用タンパク質によって生成されるペプチドが豊富な背景の存在下で釣り合いの 1-100 ppm の定量化のため)、感度、精度、または SRM/MRM の直線性の試験を受けます干渉。
SRM/MRM アッセイ前駆体/フラグメント大衆の「ユニークな」組み合わせにのみ依存する 1 次元的な選択があります。ペプチド背景が予期せずに変更されたときの状況でこれらの試このため、失敗 (例えば、バイオ医薬品サンプルの別の精製の手順から得られた)。これらの制限を克服するために提案するここで、イオンの移動が有効な高分解能四重極飛行時間 (QTOF) ハイブリッド質量分析計に実装されている選択度の高い (HS) MRM アッセイ (楽器図、図 6 を参照してください)。
楽器その他共同溶出 (干渉) ペプチド前駆体からイオン移動性細胞の興味のペプチッドの前駆体を分離、四重極の前駆体の完全同位体の封筒を分離、固定 ce の断片、衝突のセルです。その最も豊富なペプチド フラグメントによって生成される信号は、フル スキャンと同様全てのイオンよりもむしろ飛行管に質量領域を選択的にプッシュ プッシャー周波数 (ターゲット強化) を調整することによってさらに強化されます。このフラグメント イオンによって生成される高 MS 分解能 (Rs 〜 30,000) 信号を用いたペプチドの定量化を行い。SRM/MRM アッセイと比べると、HS MRM アッセイは、2 つの選択性の追加レベルを提供しています: 中 2 番目は、TOF アナライザーの増加質量分解能によって提供される前駆体レベルのイオン移動度分離によって提供されます。これらの選択性の改善によってもたらされる結果は、HS MRM クロマト グラム、図 7 に表示される 3 桁間干渉の自由であるに表示されます。
SRM/MRM アッセイとは異なり HS MRM アッセイを最適化するために調整することができますいくつかのパラメーターがあります: ペプチド前駆体 (通常は 0.2 分に設定)、四重極分離ウィンドウ (4 Da)、漂流期間 RT ウィンドウ周辺、前駆体 (対応するイオン mobilogram から前駆体のピークの半値幅 ±)、およびフラグメント イオン (20,000-40,000) の MS の解像度。HS MRM アッセイは非常に敏感な: 各フォー ペプチッドのための最低の検出量が 1 フェムトモル カラム (または 0.1 nM ペプチド濃度の観点から)。ペプチド MW を考慮した場合 (正確な MWs の表 1 を参照)、量検出柱には 1-2 pg 程度 mAb ダイジェストから背景ペプチドの有意に高い量 (2 μ g) 列が読み込まれます。
スパイクのペプチドが由来した実物大のフォー蛋白質 (97.2 kDa) の分子量を考えると、アッセイ高豊富な背景イオン存在下におけるタンパク質不純物の 50 ppm を検出することができます。(5-10 ppm) の検出下限は低分子量釣り合い (10-20 kDa) ため達成されます。アッセイは、1 〜 1,000 ppm の範囲で釣り合いを測定することができますを意味する 3 桁 (図 8 から検量線で示すように) をカバーしています。また、表 3 に示す HS MRM アッセイの再現性は小分子の SRM/MRM アッセイ、ピーク面積よりも 15 %rsds の再現性と非常によくマッチします。
モノクローナル抗体 (mAb) ダイジェストでスパイク ペプチド標準の定量化のための新規アッセイの機能を探検し、感度と広いダイナミック レンジ (少なくとも 3 つの桁) を通常カバーするためのユーティリティを実証HCP 解析で発生しました。すべての六つのペプチド基準 0.1 の低濃度で検出された高い豊富なペプチド背景 (mAb ロード ダイジェストの柱の 2 μ g) の存在下で nM (1 フェムトモル 2.1 ミリメートル ID ガスクロマト グラフ列に読み込まれて)。対象となる人事とイオン移動性前駆体分離により、HS MRM アッセイ バイオ医薬品の複数のバッチにわたって複数 HCPs の高速、高スループットの監視測定になるための素晴らしい可能性があります。

工業用の巨大生体分子 (タンパク質) の定量化 (例えばElisa)、イムノアッセイにいくつかの利点のために主に在住: 感度、高スループット、使いやすさ、サンプルあたりの低コスト。これらの生物学的アッセイは、通常彼らが HCP 濃度 (通常 ppm または ng HCP/mg mAb で表されます) を提供低豊富な蛋白質の不純物 (宿主細胞蛋白質 (HCPs) の 1 ~ 100 ppm) タンパク質医薬品の存在を分析に適用する場合個々 の HCP 汚染物質の測定し、識別できません。Elisa を補完するためにまたは Elisa 失敗1,2,3,4,5,6を提供する情報を提供するために、いくつか MS に基づく試金が最近開発されました。,7,8,9. サンプルの複雑さと濃度 (少なくとも 3 桁の衝突) の広いダイナミック レンジで、HCP ペプチドを検出するための要件のため広範なサンプル分別を入札多次元クロマトグラフィー法が従来低豊富な釣り合い1,2,3,4,5,6,7を識別するために雇われています。
自然なステップ次の HCP 識別と検証は HCP 追跡 (監視) バイオ医薬品の複数のバッチにわたって。このような状況で一つ次元 LC/MS メソッドはサンプル スループット8,9を改善するために提案されている.ただし、精度および HCP の動的範囲測定可能性があります受けます 1 D の液体クロマトグラフィー/質量分析でバイオ医薬品ペプチドの圧倒的な存在感。多次元分離と比較して、信号干渉19,20,21,22の可能性が増加一つ次元のクロマト グラフ分離のための確率前駆体ペプチドより共同溶出するが増加します。クロマト グラフ分離時間を延長することがなくペプチド前駆体を分離する直交という定款明確に有利でしょう。旅行波イオン移動度 (TWIM)10ミリ秒単位で輻輳の MS スペクトルを解決する機能があります。約 500 のモビリティの色分解を実行できる日中の 10 の完全クロマト ピーク幅と仮定して単一ペプチドの溶出 s とイオン移動度計測器の IM 分離のランタイムは 20 ms であることを考えます。
プロテインの定量のための質量分析法によるアッセイ開発しました過去 10 年間広く受け入れられて使用して選択 (複数の) 反応アプローチ (SRM/MRM 法) タンデム質量分析計11、実装を監視 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 ,,2223。この低解像度の質量分析の制約の 1 つは干渉現象19,20,21,22興味のペプチッドが「同じ」を観察前駆体とフラグメント質量その他共同溶出ペプチド存在 (1 Da ウィンドウ) 内でサンプル。SRM/MRM メソッドの精度を向上させる 2 つの方法があります: 1 つのオプションは、他のオプションに前駆体/フラグメント検出の MS の解像度を上げるには干渉の前駆イオンを削除する前駆体レベルで余分な分離ステップMS 信号の重複を避けるため。説明、選択度の高い (HS) MRM アクイジション ・ モードはここで高解像度 (Rs 〜 30,000) とペプチド前駆体のイオン移動度分離を結合することによりこれらのアプローチの両方の利点を取りますペプチド フラグメントの MS 検出。アッセイは、SRM/MRM プロテオミクス実験17,18,24で観測されたダイナミック レンジは、通常、少なくとも 3 つの注文の大きさのカバーを紹介します。
HS MRM アッセイ HCP 定量化のためのユーティリティは、モノクローナル抗体ダイジェストで異なる濃度 (0.1-100 nM の範囲) でスパイク 6 ペプチド基準によって生成された信号の直線性を監視することによって示されました。

<table><tbody><tr><td>Vion IMS Qtof 質量分析計</td><td>Waters</td><td>186009214</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class クオータナリーソルベントマネージャー(QSM)</td><td>Waters</td><td>186015041</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class FTN サンプルマネージャー(SM)</td><td>Waters</td><td>186015040</td><td></td></tr><tr><td>Acquity H-Class カラムマネージャー(CM)</td><td>ウォーターズ</td><td>186015043</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル(ACN)</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40867-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>2.1 x 150 mm CSH C18 UPLC カラム、1.8 & マイクロ;m粒子</td><td>Waters</td><td>186005298</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸、LC/MS 用溶離液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56302-10X1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Hi3 rabbit phosphorylase (PHO) MassPREP 標準</td><td>Waters</td><td>186006011</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセアミド (IAM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I-1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>LCバイアル(12x32 mmガラスバイアル、スクリューネック)</td><td>Waters</td><td>186000327c</td><td></td></tr><tr><td>ロイシンエンケファリンアセテート塩水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9133-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind 2.0 mLチューブ(2x50)</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C酵素ミックス、質量分析グレード(5 x 20 &micro;g)</td><td>プロメガ</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>水、LC / MSグレード</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>39253-1L-R</td><td></td></tr></tbody></table>

液体クロマトグラフィーによるイオン移動 qtof 質量分析法によるタンパク質のバイオ医薬品の宿主細胞蛋白質の定量化のための hs mrm アッセイ

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

低レベル (1-100 ppm) タンパク質中の不純物 (例えば、宿主細胞蛋白質 (HCPs)) タンパク質バイオ分析は高感度・広ダイナミック レンジを必要とする挑戦的な試金。一般にタンパク質の質量分析を用いた定量アッセイ (SRM/MRM) 低解像度 (Rs 〜 1,000) タンデムを使用してペプチッドの定量化を監視選択的反応モニタリング/複数反応に続いて蛋白質消化四重極質量分析計。このアプローチの限界の 1 つは興味のペプチッドはサンプル (1 Da ウィンドウ) 内で現在他の共同溶出ペプチドとして (m/z 値) の面で「同じ」前駆体フラグメントよぶに、時観察干渉現象です。この現象を避けるためには、別の質量分析によるアプローチ、ペプチド前駆体のイオン移動度分離を兼ね備えた高解像度 (Rs 〜 30,000) 高選択性 (HS) MRM アッセイを提案するペプチド フラグメントの MS 検出。モノクローナル抗体 (mAb) ダイジェストでスパイク、感度やダイナミック レンジ (少なくとも 3 桁の衝突) 通常、医療従事者で実現した低豊富なペプチド基準を定量化するこのアプローチの機能を調べた。解析。すべての六つのペプチド基準 0.1 の低濃度で検出された高い豊富なペプチド背景 (mAb ロード ダイジェストの柱の 2 μ g) の存在下で nM (1 フェムトモル 2.1 ミリメートル ID ガスクロマト グラフ列に読み込まれて)。スパイクのペプチドを抽出したウサギ ホスホリラーゼ (97.2 kDa) の MW を検討する際、このアッセイの LOQ は 50 ppm より低い。ピーク面積の相対標準偏差 (RSD) (n = 4 の複製) 調査全体の濃度範囲にわたって 15% 未満であった (0.1-100 nM または 1 〜 1,000 ppm) 本研究で。

フォー ペプチド混合物に含まれる 6 ホスホリラーゼ b ペプチド基準の個々 のシーケンス テーブル 1、その保持時間と共に表示され、焦点Eにみられる彼らの最も豊富な前駆体の実験します。高選択性 (HS) MRM アッセイの開発の最初のステップは、その対応のほとんどと一緒に各フォー ペプチドの溶出時間を確立焦点Eデータセットの取得豊富な前駆体および 3 つの最も豊富な断片。図 2 は、インフリキシマブ ダイジェストでスパイク フォー ペプチド (Pep 6) のいずれかの取得焦点電子スペクトルを表示します。3 位各ペプチドの「切り替え効果」(前駆体とフラグメント大衆の組み合わせ) を確立した後、Tof MRM 実験各ペプチド生成された信号最大にする最適な衝突エネルギーが見つけるされます。CE 最適化の実験の結果を表 2 にまとめます。最終 HS MRM アッセイ (図 4 を参照) のみベスト各ペプチドの「転移」を保持し、、すべての試料の分析に使用。すべての濃度を調査対象 4 フォー ペプチドに対して生成された HS MRM クロマト グラムの例は、図 7 に掲載されています。図 8 図 7 HS MRM ピークの統合が表示されます各ペプチド次の 4 つの較正曲線が得られます。さらに、ピーク面積相対標準偏差、計算に基づいて 4 複製注射は、表 3 に示すように 4 つのテーブルのとおりです。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ペプチド</td>
			<td colspan="2">ペプチド</td>
			<td>保持</td>
			<td colspan="4">充電状態</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">シーケンス</td>
			<td>時間 (分)</td>
			<td>+ 1</td>
			<td>+ 2</td>
			<td>+ 3</td>
			<td>+ 4</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 1</td>
			<td colspan="2">VLYPNDNFFEGK</td>
			<td>19.4</td>
			<td>1442.6951</td>
			<td>721.8512</td>
			<td>481.5699</td>
			<td>361.4292</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td>16.0</td>
			<td>1874.9065</td>
			<td>937.9569</td>
			<td>625.6404</td>
			<td>469.4821</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 3</td>
			<td colspan="2">IGEEYISDLDQLRK</td>
			<td>18.9</td>
			<td>1678.8646</td>
			<td>839.9360</td>
			<td>560.2931</td>
			<td>420.4716</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td>21.1</td>
			<td>1440.7369</td>
			<td>720.8721</td>
			<td>480.9172</td>
			<td>360.9397</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td>19.7</td>
			<td>1890.0080</td>
			<td>945.5076</td>
			<td>630.6742</td>
			<td>473.2574</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td>17.7</td>
			<td>1262.5939</td>
			<td>631.8006</td>
			<td>421.5362</td>
			<td>316.4039</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 1。フォー インフリキシマブ ダイジェストでスパイク量産準備ミックスに含まれるペプチド基準。ペプチド保持時間および彼らの最も豊富な前駆体 (太字で強調表示) を表形式で表示します。
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ペプチド</td>
			<td colspan="2">ペプチド</td>
			<td>保持</td>
			<td colspan="2">ペプチド前駆体</td>
			<td colspan="3">最も豊富なフラグメント イオン/料金</td>
			<td>最適</td>
		</tr>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">シーケンス</td>
			<td>時間 (分)</td>
			<td>m/z & 料金</td>
			<td>ドリフト時間 (ミリ秒)</td>
			<td>私</td>
			<td>II</td>
			<td>III</td>
			<td>CE (V)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 2</td>
			<td colspan="2">TCAYTNHTVLPEALER</td>
			<td>16.0</td>
			<td>625.6404 (+3)</td>
			<td>6.2</td>
			<td>714.3781 (+1)</td>
			<td>807.4177 (+2)</td>
			<td>827.4621 (+1)</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 4</td>
			<td colspan="2">LLSYVDDEAFIR</td>
			<td>21.1</td>
			<td>720.8721 (+2)</td>
			<td>7.5</td>
			<td>865.4050 (+1)</td>
			<td>964.4734 (+1)</td>
			<td>1214.5688 (+1)</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 5</td>
			<td colspan="2">LITAIGDVVNHDPVVGDR</td>
			<td>19.7</td>
			<td>630.6742 (+3)</td>
			<td>6.3</td>
			<td>642.3570 (+1)</td>
			<td>689.8391 (+2)</td>
			<td>832.4236 (+2)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pep 6</td>
			<td colspan="2">VFADYEEYVK</td>
			<td>17.7</td>
			<td>631.8006 (+2)</td>
			<td>7.0</td>
			<td>830.3931 (+1)</td>
			<td>945.4200 (+2)</td>
			<td>1016.4571 (+1)</td>
			<td>24</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2。Tof MRM 最適化実験結果: 本研究で定量化各フォー ペプチドの 3 つの最も豊富な断片が示され、対応する最適化された衝突エネルギー。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>コンク</td>
			<td>量</td>
			<td colspan="6">Pep 2 ピーク面積 (表 3 a)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>柱に (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>意味</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>439</td>
			<td>462</td>
			<td>431</td>
			<td>456</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>5121</td>
			<td>4842</td>
			<td>5198</td>
			<td>4842</td>
			<td>5001</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>63853</td>
			<td>64279</td>
			<td>66111</td>
			<td>62509</td>
			<td>64188</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>612392</td>
			<td>605553</td>
			<td>613229</td>
			<td>611004</td>
			<td>610545</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>コンク</td>
			<td>量</td>
			<td colspan="6">Pep 4 ピーク面積 (表 3 b)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>柱に (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>意味</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>275</td>
			<td>359</td>
			<td>325</td>
			<td>288</td>
			<td>312</td>
			<td>12.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>3559</td>
			<td>3694</td>
			<td>3287</td>
			<td>3754</td>
			<td>3574</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>45259</td>
			<td>45775</td>
			<td>42976</td>
			<td>45548</td>
			<td>44890</td>
			<td>2.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>459374</td>
			<td>467927</td>
			<td>436272</td>
			<td>458994</td>
			<td>455642</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>コンク</td>
			<td>量</td>
			<td colspan="6">Pep 5 ピーク面積 (表 3)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>柱に (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>意味</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>3194</td>
			<td>3243</td>
			<td>3202</td>
			<td>3257</td>
			<td>3224</td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>31464</td>
			<td>31150</td>
			<td>31464</td>
			<td>31433</td>
			<td>31378</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>313638</td>
			<td>320712</td>
			<td>311943</td>
			<td>311943</td>
			<td>314559</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>2845736</td>
			<td>2840031</td>
			<td>2882006</td>
			<td>2864052</td>
			<td>2857956</td>
			<td>0.7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>コンク</td>
			<td>量</td>
			<td colspan="6">Pep 6 ピーク面積 (表 3 D)</td>
		</tr>
<tr>
<td>(nM)</td>
			<td>柱に (fmoles)</td>
			<td>Rep01</td>
			<td>Rep02</td>
			<td>Rep03</td>
			<td>Rep04</td>
			<td>意味</td>
			<td>RSD (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1</td>
			<td>490</td>
			<td>583</td>
			<td>440</td>
			<td>440</td>
			<td>488</td>
			<td>13.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>6429</td>
			<td>6429</td>
			<td>6848</td>
			<td>6623</td>
			<td>6582</td>
			<td>3.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100</td>
			<td>71295</td>
			<td>70400</td>
			<td>71563</td>
			<td>70400</td>
			<td>70915</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>1000</td>
			<td>707640</td>
			<td>707640</td>
			<td>694461</td>
			<td>729490</td>
			<td>709808</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3。HS MRM クロマト グラムのピーク面積を含むテーブルは各 LC/MS 射出 (16 LC/MS 実行およびテスト 4 濃度) 4 フォー ペプチド (Pep 2、4、5、および 6) の記録。 相対標準偏差は調査全体の濃度範囲ですべてのペプチドよりも 15% だった。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig1.jpg"> 図 1。HS MRM の獲得方法を設定するために必要な 3 つのステップを要約するワークフロー ダイアグラム。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig2.jpg"> 図 2。HDMSE データの例: (A) 低エネルギー スペクトル Pep 6 前駆イオンを示します。(B) 高エネルギーの断片化、トップ 3 の最も豊富なフラグメント イオン (円内) Tof MRM 衝突エネルギー最適化のための選択を表示する、同じペプチドのスペクトル。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig3.jpg"> 図 3。Tof MRM 最適化を設定するために使用されるパラメーターの実験します。 各遷移に対して (16 に 36 V の範囲) の 11 の衝突エネルギーがテストされました。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig4.jpg"> 図 4。最終 HS MRM メソッドの例です。 いくつかのパラメーターが各トランジション、ペプチド前駆体 m/z の電荷状態とイオン移動度ドリフト時間、最も豊富なフラグメント イオン、最適な衝突エネルギーと MS のアクイジション時間の m/z を含む必要です。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig5.jpg"> 図 5。HS MRM のデータセットを分析するための処理方法によって使用される設定。 各ペプチド「移行」ペプチド前駆体 m/z で記述された単一によって監視されて、充電状態、および最も豊富なフラグメントとその充電状態の m/z に沿って保持時間を予想します。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig6.jpg"> 図 6。イオン移動度質量分析計の図。 他共同溶出 (干渉) ペプチド前駆体からイオン移動度セル、四重極、別に分離し、固定衝突エネルギーと断片化された HS MRM アクイジション ・ モード定量化するペプチド前駆体が区切られて、衝突のセルです。ペプチド フラグメント イオンの生成する信号がプッシャー周波数を調整することによって向上し、高 MS 分解能を用いたペプチドの定量化を行い (> 30,000) 各ペプチドが最も強烈なフラグメント イオンによって生成される信号。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2.jpg"> 図 7。4 異なる濃度で 3 桁に及ぶ 4 フォー ペプチド HS MRM クロマト グラムを記録した (0.1、1、10、および 100 nM)。 (A) pep 2 クロマト グラム、Pep (B) 4 のクロマト グラム、(C) ペップ 5 クロマト グラム、および (D) ペップ 6 クロマト グラム。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig7v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2.jpg"> 図 8。4 異なる濃度で 4 フォー ペプチド較正曲線 (0.1、1、10、および 100 nM)。 各曲線の下のテーブルは、各テーブルから 2 番目の列が予想される線形応答からの偏差率を示しています中に各注入の記録された個々 のピーク面積 (Y の値) を表示します。(A) pep 2 校正、(B) ペップ 4 校正、(C) ペップ 5 校正、および (D) ペップ 6 校正。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55325/55325fig8v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここでは、高解像度 (〜 30,000) の MS モノクローナル抗体のスパイク ペプチド水準の定量化のためのペプチド断片の検出続くペプチド前駆体のイオン移動度分離と相まってガスクロマト グラフ分析について述べるダイジェスト。

液体クロマトグラフィーによるイオン移動 QTOF 質量分析法によるタンパク質のバイオ医薬品の宿主細胞蛋白質の定量化のための HS MRM アッセイ

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

HS-MRMアッセイの全体的な目的は、ペプチド前駆体のイオン移動度分離とフラグメントイオンの高分解能質量分析検出を組み合わせることで、ペプチドまたはタンパク質の定量に影響を与えるMRM干渉現象を低減することです。この手法は、バイオ医薬品の特性解析、ならびにタンパク質またはペプチドバイオマーカーの定量および定量的プロテオミクスの領域における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、バイオ医薬品タンパク質中に存在する可能性のある低含有量の宿主細胞タンパク質を検出できることです。まず、データ収集ソフトウェアの「create analysis method（解析メソッドの作成）」をクリックし、「generate and acquire and process method（生成・収集・処理メソッド）」を選択します。メソッド名と説明を入力し、メソッドフォルダを参照して「next（次へ）」をクリックします。解析タイプとして「peptide map IMS（ペプチドマップIMS）」を選択し、「next（次へ）」をクリックします。次に、現在のシステム構成を選択し、[次へ]、[完了]の順にクリックします。新しく作成されたメソッドで［インストゥルメント］タブをクリックし、バイナリー溶媒マネージャーを選択して、流速0.2 milliliters per minuteでペプチド分離が行われるようにグラジエント設定を編集します。30分間で溶媒Bを1%から40%までグラジエント希釈し、続いて2分間のカラム洗浄と10分間の平衡化を行い、総ランタイムを45分に設定します。次に、サンプルマネージャーを選択し、サンプル温度を10 °Cに、カラム温度を60 °Cに設定します。インストゥルメントタブで、Vion IMS QTofインストゥルメントを選択します。設定セクションで、アナライザーモードに「sensitivity」を選択し、キャピラリー電圧に3 kV、ソース温度に100 °C、脱溶媒温度に250 °C、コーンガス流量に50 L/h、脱溶媒ガス流量に500 L/hを入力します。「experiment」タブをクリックし、モードに「high definition MSE」を選択します。次に、low massに100、high massに2000、scan timeに0.4 secondsと入力します。衝突エネルギー（collision energy）セクションでは、low energy設定に6 electron voltsと入力し、high energy rampに15から40 electron voltsを選択します。収集時間には、5分から30分の間のカスタム実行時間を使用します。次に、オプションタブをクリックし、自動ロック補正間隔を5分に設定して、自動ロック補正モードを選択します。その後、「ロック補正を継続」オプションを選択し、自動検出器チェックが無効になっていることを確認します。現在のシステム構成メニューで、Vion IMS QTof装置を選択し、[tools]をクリックします。キャピラリー電圧に3 kV、サンプリングコーンに40 V、ソースオフセットに100 V、ソース温度に100 °C、脱溶媒温度に250 °C、コーンガス流量に50 L/h、脱溶媒ガス流量に500 L/h、リファレンスキャピラリー電圧に3 kVを入力します。前述のLC-HDMSEアッセイを用い、あらかじめ調製した10 nMの擬似スパイク試料10 µLを装置に注入して分析します。擬似ペプチド混合物に含まれる6種類のホスホリラーゼBペプチド標準品の個々の配列を、その保持時間およびHDMSE実験で観察された最も強度の高いプリカーサーと共にここに示します。Infliximab消化液にスパイクした擬似ペプチドのうち1つのHDMSEスペクトルをここに表示します。データ収集ソフトウェアで、[create analysis method]をクリックし、[generate and acquire and process method]を選択してください。メソッド名と説明を入力し、メソッドフォルダを参照して「次へ」をクリックします。分析タイプは「定量」を選択し、「Quantify Assay Tof 2D Chromatographic」を選択して「次へ」をクリックします。次に、現在のシステム構成を選択し、「次へ」をクリックして完了します。新しく作成したメソッドの「instruments」タブをクリックします。バイナリー溶媒マネージャーを選択し、0.2 mL/minの流速でペプチド分離が行われるようにグラジエント設定を編集します。30分間で溶媒Bを1%から40%までグラジエント希釈し、続いて2分間のカラム洗浄と10分間の平衡化を行い、総ランタイムを45分に設定します。インストゥルメント（instruments）タブでサンプルマネージャーを選択し、サンプル温度を10 °Cに、カラム温度を60 °Cに設定します。次に、Vion IMS QTofインストゥルメントを選択し、設定（settings）セクションでアナライザーモードに「感度（sensitivity）」を選択します。続いて、キャピラリー電圧に3 kV、ソース温度に100 °C、脱溶媒温度に250 °C、コーンガス流量に50 L/hr、脱溶媒ガス流量に500 L/hrを入力します。「Experiment」タブをクリックし、「Experiment Type」で、1つまたは複数のMS、MS/MS、またはMRM機能を含む関数テーブルを選択します。デフォルトのデータ収集関数を削除し、「Add」プラス記号から「MRM」を選択して、ランタイムセクションの保持時間ウィンドウ（retention window）パラメータを編集します。Tof MRM関数エディターにおいて、ペプチド前駆体のマスター電荷比を入力し、前駆体分解能に「Low」を選択して、前駆体の電荷状態を入力します。次に、開始衝突エネルギーに製品マスター電荷比の16 electron volts、固定スキャン時間に0.1 seconds、スペクトルカラムにwideを入力します。複製ボタンを使用して、さらに10個のMRM遷移を追加し、18から36 electron voltsの範囲で異なる衝突エネルギー値を使用します。各ペプチドに対して最適な3つの遷移を決定した後、各ペプチドで生成される信号を最大化するための最適な衝突エネルギーを求めるために、Tof MRM実験を実施しました。次に、ペプチドあたり1つのフラグメントイオンのみを含むHS-MRMメソッドを設定します。 previously作成したTof MRMメソッドを修正し、Tof MRM機能の代わりにHS-MRM機能を選択します。HS-MRM機能エディターで、マスター電荷比を入力し、プリカーサー分解能に「low」を選択して、プリカーサーの電荷状態を入力します。次に、前駆体のCCS値を入力し、前駆体CCS分解能で「low」を選択します。プロダクトイオンについては、そのマスター電荷比を入力し、最適な衝突エネルギーを選択して、スキャン時間を0.4秒に設定し、すべての同位体を含めるためにワイドスペクトラム設定を選択します。最終的なHS-MRMアッセイでは、各ペプチドに対して最適なトランジションのみを保持し、これをすべてのスパイクサンプル分析に使用します。HS-MRMデータ収集法用に作成した解析法の「目的（purpose）」タブをクリックし、「コンポーネントの管理（manage components）」を選択します。「実験タイプ（experiment type）」のドロップダウンメニューから「HS MSMS/HS MRM」オプションを選択してください。「作成（create）」をクリックし、コンポーネント名、予想保持時間、抽出時間ウィンドウ、および親イオンの主電荷比を入力します。XIC抽出モードを選択し、期待されるCCS値を入力してください。フラグメントイオンについては、その電荷状態とマスター電荷比を入力します。次に、HS-MRMアッセイでモニタリングするすべてのペプチド成分を入力してください。同じHS-MRM測定法の目的（purpose）タブで、[default amounts]をクリックし、すべての擬似ペプチド成分に対して0.1、1、10、および100 nanomolarを入力します。最初の値を入力した後、右クリックして[fill down]オプションを選択し、すべての成分に同じ濃度を入力します。検量線の4つの濃度すべてについて、同じ手順を繰り返します。次に「processing」タブに移動し、「extraction settings」をクリックします。「mass tolerance」に 10 PPM と入力してください。続いて「CCS drift time tolerance」をクリックし、「CCS tolerance」に 5% と入力します。処理タブで、ピーク処理設定を選択します。「smooth」セクションで、平滑化アルゴリズムに「mean」を、ハーフ幅に「one」を、反復回数に「one」を選択します。「integrate」セクションで、「automatic peak width」と「automatic detection」の両方のオプションにチェックが入っていることを確認してください。次に、「処理」タブでターゲットスクリーン設定を選択し、「RTウィンドウ」で「RTに最も近い」オプションを選択します。次に、保持時間許容誤差に0.2分を入力します。「定量」設定を選択し、「キャリブレーション」メニューで、検量線適合タイプに「線形」、重み付けタイプに「1/x²」、成分値タイプに「濃度」、成分値単位に「ミリモル/リットル」、平均によるキャリブレーションポイントの算出に「なし」を選択します。定量メニューで、レスポンス値として「Area」を選択します。ここでは、すべての濃度において擬似ペプチドに対して生成されたHS-MRMクロマトグラムの例を示します。HS-MRMピークの積分後に各ペプチドについて得られた検量線をここに表示します。4回の繰り返し注入に基づいて算出されたピーク面積の相対標準偏差をここにまとめます。高選択的MRMアッセイは、イオンモビリティによる前駆体分離と標的高分解能質量分析検出の両方を組み込んでいるため、バイオ医薬品のバッチ間における複数の宿主細胞タンパク質の迅速かつハイスループットなモニタリングアッセイとなる大きな可能性を秘めています。このビデオを視聴することで、Vion IMS QTof装置で高選択的MRMアッセイをセットアップする方法を十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

安定同位体の標準と抗ペプチド抗体（SISCAPA）によって、それぞれのタンパク質の代用物としてのペプチドの定量的な測定を提供するために、安定同位体希釈質量分析法（MRM -...

質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化

組換えヒトMHC II分子と生化学的アッセイは、免疫​​原性エピトープ同定、削除、または設計に迅速かつ定量的な洞察を提供することができます。ここで、384ウェルプレートにスケーリングペプチド-MHC II結合アッセイが記載されている。この費用対効果の高い形式は、タンパク質の脱免疫やワクチンの設計と開発の分野で有用であることを証明する必要があります。...

ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ

このプロトコルは、選択された反応モニタリングを使用して、複雑な生物学的サンプル内の標的タンパク質の絶対定量アッセイを実行する方法を説明しています。これは、マウスマクロファージ走化性シグナル伝達経路のタンパク質を正確に定量するために使用されました。標的ペプチドの選択、アッセイ開発、定性的および定量的アッセイについて詳しく説明します。...

絶対タンパク質定量のための質量分析法を選択反応モニタリング

我々は、高スループット、多重化を説明、およびプロテオミクス脳脊髄液（CSF）の臨床翻訳のための潜在的に開発されたアッセイをターゲットに。テストでは、このようなアポリポタンパク質Eバリアント（E2、E3およびE4）などの神経変性のための潜在的なマーカーおよびリスク要因を、定量、およびそれらの対立遺伝子の発現を測定することができます。...

神経変性のバイオマーカーおよびアポリポタンパク質Eアイソフォームの状態を定量化するために高スループット、多重化およびターゲットプロテオームCSFアッセイ

正確に高分解能質量分析計を接続した液体クロマトグラフィーによる定圧ラベリング、広範な分別、バイオインフォマティクス...

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

このプロトコルでは、蛋白質、蛋白質の複合体、および異種サンプル中のペプチドの正確なモル質量決定の多角度光散乱と特異性の高いイオン交換クロマトグラフィーの使用について説明します。このメソッドは、ネイティブのオリゴマー、電荷変形および混合蛋白質のサンプルの特性、品質評価法に関する貴重なです。...

イオン交換クロマトグラフィー (IEX) 蛋白質の分離とキャラクタリゼーションの多角度光散乱 (MALS) に結合

タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、複数の生物学的経路を調節する広範な翻訳後修飾です。質量分析は、修飾ペプチド濃縮のための生化学的アプローチと組み合わせると、R-メチルプロテオームをグローバルにプロファイリングするための最良の技術です。ここでは、ヒト細胞における全体的なR-メチル化を高信頼で同定するために設計されたワークフローについて説明します。...

質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析

医薬品(DP)から宿主細胞タンパク質(HCP)を濃縮し、プロテオーム濃縮ビーズを使用してペプチドを検出するためのプロトコルが示されています。この分析法は、自社製のモノクローナル抗体(mAb)原薬(DS)を使用して実証されており、これは、性能の観点からさまざまな分析法を評価および比較するための十分に特性評価された標準物質です。...

エンリッチメントビーズと限定消化を組み合わせた宿主細胞タンパク質分析(英語)

液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光、飛行時間型質量分析(LC-TIMS-ToF...

液体クロマトグラフィー、トラップ型イオンモビリティー分光分析、飛行時間型質量分析を用いたヒストン修飾スクリーニング(英語)

超高速液体クロマトグラフィーと質量分析(UPLC-MS)を組み合わせたノンターゲット代謝物プロファイリングは、代謝を調査するための強力な技術です。...

超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析（UPLC-MS）による血清中の大規模非標的メタボロームプロファイリング

学ぶHS-MRMアッセイによるイオン移動分離と高分解能質量分析を組み合わせたペプチド定量法。バイオ医薬品中の低豊度宿主細胞タンパク質の検出精度を向上させ、創薬研究に応用可能です。

液体クロマトグラフィーによるイオン移動 QTOF 質量分析法によるタンパク質のバイオ医薬品の宿主細胞蛋白質の定量化のための HS MRM アッセイ

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