Name: 磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶ 実験的大脳マラリアマウスモデルにおけるMRIを用いたin vivo脳病理追跡法。浮腫発生と微小血管病変の時空間的進行を可視化し、新規治療戦略の評価に有用な神経感染症イメージング技術を習得できます。

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Miriam Reinigの専門家の技術支援は感謝しています。 AHは、ハイデルベルク大学医学部のポスドク奨学金から資金を受けた。 MPはElse-Kröner-Fresenius財団の記念奨励金によって支えられています。 AKMは、DZIFアカデミー（DZIF）の母子保健給付の受給者です。 JPは、ハイデルベルク分子医学研究センター（HRCMM）のキャリア開発フェローシップの受領者です。さらに我々は、スポロゾイト運動の模範的な映画を提供してくれたJulia M. SattlerとFriedrich Frischknechtに感謝する。

この記事で報告されたすべての動物実験は、実験動物科学連盟（FELASA）カテゴリBおよび実験動物科学協会（GV-SOLAS）標準ガイドラインに従って実施され、カールスルーエの地方ドイツ当局（RegierungspräsidiumKarlsruhe） 、ドイツ）。 biosavetyレベル2は、蚊とPlasmodium berghei ANKAスポロゾイトの仕事に適用されます。 1.感染<ol><li> Anophelesは、配偶子母細胞で15分間飼育することにより、 Plasmodium berghei ANKAを用いて蚊を繁殖させる。感染した蚊を湿度80％、21℃に保つ。 </li><li>血液摂取の17〜22日後にケージから女性の蚊を収集する。それらを氷上に置き、麻酔する。 </li><li>鉗子を使用して、一滴の冷RPMI培地で覆われたガラススライド上に3-4匹の蚊を置く。スライドを顕微鏡の下に置きます。 </li> &lt;鉗子を使用して、慎重に頭と体の間に蚊を伸ばします。シリンジと針を用いて唾液腺を分離する。残りの蚊でこの手順を繰り返します。 </li><li>ガラススライドから唾液腺を採取し、それらをガラスピペットで吸い取り、1.5mLの遠心チューブに集める。 注：感染率に応じて、唾液腺あたり通常8,000〜15,000の感染性スポロゾイトを得ることができます。 </li><li>約3分間、唾液腺組織からスポロゾイトを単離するために、小さなプラスチックスティックで遠心チューブ内の分離した唾液腺を粉砕します。 </li><li>残りの組織からスポロゾイトを精製するために、1,000×gおよび4℃で3分間遠心分離する。 </li><li>スポロゾイト（SPZ）を含む上清を新しい遠心管にピペットで移し、精製したスポロゾイトをNeubauer血球計で数えます。 </li><li> phを加えて精製スポロゾイトの濃度を10,000 / mLに調整するオスフェート緩衝生理食塩水。 </li><li>近交系のC57BL / 6マウスの尾静脈に合計1,000個のスポロゾイト（0.1 mL）を注入して感染を開始させます。注射を容易にするために、C57BL / 6マウスを拘束具に置き、尾を静脈（約37℃）の水に入れて尾静脈の視覚化を助ける。 注記：注入自体は、数秒以内に実行できる短い手順です。 </li><li> 1日1回、SPZ感染後3日目以降の血液塗抹標本において、血液段階の寄生虫血症をチェックする。 注：Parasitemiaのモニタリングは、Mueller らの JoVEの記事で以前に可視化されています。 8 </li><li>スポロゾイト注射後5日目から急速マウス昏睡および行動尺度（RMCBS）スコアでマウスを1日1回評価する。 注：ビデオデモンストレーションを含むこの手順の詳細な説明は、Caroll et al。 6 </li><li>評価RMCBSスコアおよび対処すべき研究課題に従って、MRI画像を有するマウス。 6 </li></ol> 2.磁気共鳴イメージングセットアップ<ol><li>高周波伝送用のボリューム共振器と4チャネルフェーズドアレイの表面受信コイルを使用して、9.4T小型動物スキャナーでMRIを実行します。マウスの体温を維持するために、温度制御された水浴を42℃にする。 </li><li> 2％イソフルランおよび圧縮空気を用いて、マウスがつま先にもはや反応しなくなるまで、チャンバー内の麻酔を誘導する。麻酔を1-1.5％に維持する。 </li><li>マウスの尾静脈に尾静脈カテーテルを置く。頭の動きを最小限に抑えるために、ヘッドロックと歯のバーが装備された動物のベッドに傷つきやすいように置き、MRIのためにマウスを配置します。マウスの頸椎をまっすぐにしないように注意してください。 </li><li>造影剤注入システムを尾静脈カテーテルに接続する。 Gd-DTPA（0.3 mmol / kg）シリンジを充填したカスタムメードの注入システムを使用するか、Gd-DTPA（0.3 mmol / kg）シリンジに接続したPEチューブを使用してください。 </li><li>デクスパンテノール眼軟膏を両眼に塗布する。 4チャンネルフェーズドアレイサーフェスレシーバヘッドコイルをマウスの頭に置きます。マウスの後ろに呼吸パッドを置き、呼吸監視装置に接続します。 </li></ol> 3.イメージングプロトコル注：対処すべき研究課題に従って、以下に列挙したプロトコールからイメージング配列を選択する。記載されているすべてのパラメータはMRIソフトウェアで有効ですが、他のソフトウェアプログラムが使用されている場合は調整する必要があります。 <ol><li>マウスの脳がマグネットのアイソセンタにあることを確認するために、ローカライズスキャンを開始します。 </li><li> 血管原性浮腫を定性的に評価するには、マルチスライスレアシーケンスを選択して3D T2強調画像を使用します。 <ol><li>次のPAを入力してください繰返し時間= 2.000ms、エコー時間= 22ms、等方性分解能= 0.1mm、視野= 20×10×12mm 3 。マトリックス= 200×100×120、フリップ角= 90~180°、 （スピンエコー）、および希少因子= 8.シーケンスを開始し、10分48秒待って生の画像を取得する。 </li></ol></li><li> 血管形成性浮腫を定量的に評価するために、マルチスライス、多重スピンエコーシーケンスを選択することによってT2緩和測定を実施する。 <ol><li>繰返し時間= 3.100ms、エコー時間= 8-136ms、8msの増分、スライス数= 17、スライス厚さ= 0.7mm、面解像度= 0.116mm×0.116mm、視野20 x20mm2、マトリックス= 172x172、フリップ角= 90-180°、 （スピンエコー）。シーケンスを開始し、8分53秒待って生の画像を取得する。 </li></ol></li><li> 血管原性浮腫および細胞傷害性浮腫の両方を定量的に評価するために、拡散強調画像/見掛け拡散係数スピンエコーEPI拡散シーケンスを選択することによって、効率的（ADC）マッピングを可能にする。 <ol><li>反復時間= 3.400ms、エコー時間= 20ms、スライス厚= 0.7mm、スライス数= 17、拡散増感方向の数= 30、b値= 1.500s / mm 2 、δ= 3msのパラメータを使用する。 、Δ= 9ms、部分フーリエ符号化加速係数= 1.51、視野= 12×15mm 2 、マトリックス= 96×128、面内分解能= 0.125mm×0.117mm、フリップ角= 90-180度、および彩度スライス（矢状）の数= 1。シーケンスを開始し、生画像が取得されるまで7分56秒待つ。 </li></ol></li><li> 微小出血を評価するには、3D T2 *加重イメージングを使用する。フロー補正FLASHシーケンスを選択します。 <ol><li>繰り返し時間= 2.000 ms、エコー時間= 22 ms、等方性解像度0.08 mm、視野= 32 x 15 x 8 mm 3 、マトリックスサイズ= 400 x 188 x 100、およびfリップアングル= 12度。シーケンスを開始し、生の画像を取得するために15分40秒待つ。 </li></ol></li><li> 動脈の開存性を評価するには、3D FLASHシーケンスを選択して、飛行時間血管造影を使用します。 <ol><li>繰返し時間= 16ms、エコー時間= 3.5ms、スライス厚さ= 0.07mm、面内分解能= 0.104×0.104mm、視野= 20×20×10mm 3 、MRIソフトウェアの以下のパラメータを使用する。 = 192×192×142、フリップ角= 15度である。シーケンスを開始し、画像が取得されるまで7分16秒待ちます。 </li></ol></li><li> 血液脳関門の崩壊を評価するには、0.3 mmol / kgの造影剤注入の前後に3D T1強調画像を使用する。グローバルラジオ周波数の励起を使用して、ラジオ周波数で損なわれたFLASHシーケンスを選択します。 <ol><li> MRIソフトウェアでは、繰り返し時間= 5ms、エコー時間= 1.9ms、等方性分解能= 0.156mm、視野20×18.7×18.7mm 3 、マトリックス128×120×120、フリップ角= 8.5°。シーケンスを開始し、画像が取得されるまで1分14秒待ちます。 </li></ol></li></ol> 4.画像処理と解析<ol><li>血液脳関門の障害を解析するには、ImageJの算術ツールまたは画像計算ツールを使用して、強化されたT1強調画像から3D非拡張T1強調画像を差し引きます。減数画像を評価し、血液脳関門の障害に対応する信号の増加を確認する。 9 </li><li>脳の容積を分析するには、ネイティブ3D T1または3D T2加重データセットを使用します。セグメンテーションエディタを使用して、脳を嗅球から小脳まで描写する。 10 </li><li> 血管形成性浮腫 <ol><li> MRIソフトウェアでT2緩和測定データを処理するか、非線形最小二乗適合手順を使用します。 11 MRI sofを用いたADCマップを得るための拡散強調データの処理twareまたはFDTツールボックス（ 材料表を参照）。 </li><li>関心領域を異なる解剖学的領域に手動で配置します。 注記：重要な脳の腫脹により、関心領域の自動配置が正しく登録されないことがあります。選択された解剖学的領域のT2時間およびADC値がこのようにして得られる。 </li></ol></li><li>微小出血量を分析するには、セグメンテーションエディタを使用して、T2 *加重データセット上に卵形の暗い焦点として現れる微小出血を描写する。 </li></ol>

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</ol>

著者は、利益相反がないことを宣言します。

この記事では、実験的脳マラリアの変化を描写する全脳MRIプロトコルについて説明します。我々は、今日までマラリア研究においてMRIが十分に活用されておらず、我々のプロトコールが他の研究者を助けることを期待している。私たちは役に立つかもしれないいくつかの追加ポイントについて説明したいと思います。 重度の病気のマウスが画像化される場合、位置決めが重要である。頭蓋内圧の上昇により、マウスは死亡しやすいため、頚椎を伸ばしてはならない。麻酔も最低限に保つ必要があります。軽度の疾患を有するマウスを画像化する場合、MRIにとって最良の時点は、最初の臨床症状の予期される発症の12〜24時間前である。 ECM（RMCBSスコア20）の臨床徴候を示さないマウスにおいて、嗅球における軽度の血管原性浮腫が見られる。 MRIプロトコル自体の長さは、具体的な研究の質問に従って適応させることができます。最小原則血管形成浮腫および微小出血負荷/微小血管障害の存在を判断するために、T2加重配列またはT2リラクソメトリーおよびT2 *加重配列を含むべきである。良...

マラリアは世界的に重要な健康問題です。重度のマラリアは部分的に脳の関与を特徴とし、しばしば不良な予後因子である。 5歳未満の小児では、マラリア伝播率の高い地域で脳関与が一般的であり、その年齢層でのマラリア関連死亡の主な原因となります。積極的な治療は命を救うことができますが、脳マラリアの検出は、特に初期段階では困難です。脳マラリアに関連する病理学的プロセスには、脳血管障害および脳浮腫が含まれ、重度の脳の腫脹を招く可能性がある。この記事では、実験的脳マラリア（ECM）の全脳インビボイメージングを可能にする磁気共鳴イメージング（MRI）プロトコルを紹介します。 ECMが中央でどのように開始するかについてはほとんど知られていないが、全脳高分解能イメージング法はこの疾患では十分に活用されていないあるいは特定の機序が原因となってこの疾患に至ることがあります。脳全体をカバーするインビボ MRIは、ECM病理のより良い理解を得るための重要な研究ツールである。 MRIは、最近、ECMだけでなくヒト大脳マラリアにおいても死の重要な予測因子であると最近認識されている世界的な脳の脳の腫脹を評価することができる。重度の脳の腫脹は、致命的な疾患で起こり、ECMモデルとヒトの疾患（炎症性および微小血管の両方の変化が特徴である疾患）との間のいくつかの病理学的特徴の1つを表す。 4 ECMは、致死的Plasmodium berghei ANKA感染によるCBAまたはC57BLマウスで誘導することができる。 ECMの発症は、感染後6日目から10日目までに典型的に起こり、フィッティング、運動失調、呼吸困難、昏睡をもたらし、これがラップにつながるイドの死。ラピッドネズミ昏睡および行動尺度（RMCBS）は、ECMの臨床症状を評価するのに役立つスコアです。これは、0から2のスコアを付けられた10のパラメータで構成され、最大20の可能なスコアを有する。6最近、我々はECMマウスにおけるRMCBSスコアの重症度とMRIによって示される病理学的変化との間に良好な一致を示した。 7このプロトコールでは、マウスにおけるECM誘導およびECMによるマウスのインビボ磁気共鳴イメージングについて記載する。

<table><tbody><tr><td>麻酔用</td><td>イソフルラン</td><td>バクスター</td><td>1001747</td></tr><tr><td>Dotarem</td><td>Guebert</td><td>1086923</td><td>Gd-DTPA造影剤; 0.5 mmol/mL</td></tr><tr><td>Amira (画像処理プログラム)</td><td>FEI Group</td><td></td><td>Version Amira 5.3.2</td></tr><tr><td>MATLAB&nbsp;</td><td>The MathWorks, Inc.,</td><td></td><td>Release 2012b</td></tr><tr><td>FDTツールボックス&nbsp;</td><td>FMRIBのソフトウェアライブラリ</td><td><a href="http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html">http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html</a></td><td></td></tr></tbody></table>

磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging

脳マラリアは重篤なマラリア疾患の兆候であり、しばしば死の前兆です。積極的な管理は命を救うことができますが、脳マラリアの検出は難しい場合があります。私たちは、浮腫や微小血管の病理など、ヒトの疾患の複数の特徴を共有する脳マラリアの実験的マウスモデルを紹介します。磁気共鳴画像法(MRI)を使用して、血液脳関門の破壊、浮腫の発生、およびそれに続く脳の腫れを検出し、追跡することができます。これらの関連する病理学的変化を視覚化できる複数のMRI技術について説明します。したがって、MRIは、浮腫、脳の腫れ、微小血管の病理などの病理学的変化をin vivoで視覚化および追跡するための貴重なツールであることを示しています。

C57BL / 6マウスでは、 P. berghei ANKAスポロゾイトによる感染後6日目〜10日目の間にECMの最初の臨床症状が観察される。 ECMは感染マウスの60〜80％で発症し、24〜48時間以内に急速に昏睡と死に進行する。対照的に、ECMを発症しないマウスは、過気管支喘息により重度の貧血から感染後第2週後に死亡する。 12 MRIイメージングでは、ECMの最も早い兆候が、マウスの嗅覚系に属し、脳の吻側部分に位置する嗅球に見える。 （コントラスト強調されたT1加重画像で見られる）血液量増加とT2強調画像でのT2シグナルの増加、T2リラクソメトリーおよび拡散強調画像での増加は、早期の血管形成性浮腫を示している穏やかな病気（RMCBSスコア20-16）に既に存在し、病気の重症度が増すにつれて広がり始める嗅球において、相対的なT1シグナル画像は、微妙な血液脳関門の破壊を検出するの...

私たちは、実験的な脳マラリアのマウスモデルを記述し、磁気共鳴画像法を用いて生体内で炎症性および微小血管の病理をどのように追跡できるかを示します。

Cerebral malaria is a sign of severe malarial disease and is often a harbinger of death. While aggressive management can be life-saving, the detection of ...

この手法の全般的な目的は、実験的脳マラリアにおける病理学的変化をin vivoでモニタリングすることです。本手法は、脳全体の病理が空間的および時間的にどのように進展するかをin vivoで可視化できるため、実験的脳マラリアの病態生理における重要な疑問を解決するのに役立ちます。これにより、脳病理の詳細な評価が可能となり、脳マラリアに対する新規治療戦略の有効性を評価するために利用できます。MRIのセットアップは、ラボマネージャーのManuel Fischerが行います。まず、吸血から17〜22日経過した雌の蚊をケージから回収します。ピンセットを使用して、冷やしたRPMI培地を1滴垂らしたガラススライドの上に、蚊を3〜4匹配置します。次に、スライドを顕微鏡下に置きます。ピンセットで蚊の頭部と胴体の間を慎重に広げ、シリンジと針を用いて唾液腺を単離します。続いて、ガラスピペットで唾液腺を吸い上げてガラススライドから回収し、1.5 milliliter centrifuge tubeに移します。次に、小型のプラスチックスティックを用いて、遠心チューブ内の分離した唾液腺を3分間破砕し、唾液腺組織からスポロゾイトを分離します。1,000 ×g、4 °Cで3分間遠心分離し、残りの組織からスポロゾイトを精製します。スポロゾイトを含む上清をピペットで新しい遠心チューブに移し、ノイバウエル血球計数器で精製したスポロゾイトを計測します。スポロゾイトは典型的な反時計回りの運動を示します。次に、リン酸緩衝生理食塩水を加えて、精製したスポロゾイトの濃度を1mLあたり10,000個に調整します。最後に、C57BL/6マウスを拘束具に入れ、尾静脈を視認しやすくするために尾を温水に浸します。次に、感染を開始させるため、合計1,000個のスポロゾイト（0.1 milliliters）を尾静脈に注入します。まず、高周波送信にボリュームレゾネーターを使用する9.4T小動物用磁気共鳴画像法（MRI）スキャナーにマウスを移動させます。その後、両眼にデクスパンテノール眼軟膏を塗布します。マウスの体温を維持するため、温度制御水槽を42°Cに設定して電源を入れます。次に、マウスの尾静脈に尾静脈カテーテルを挿入します。続いて、頭部の動きを最小限に抑えるため、ヘッドロックとトゥースバーを備えたアニマルベッドにマウスを腹臥位かつ背中を丸めた状態で配置し、MRI撮影のポジショニングを行います。マウスの頸椎を伸ばさないように注意してください。0.3 millimole per kilogram Gd-DTPAを満たした造影剤注入システムを尾静脈カテーテルに接続します。次に、4-Channel Phased Array Surface Receiverヘッドコイルをマウスの頭部に設置します。最後に、マウスの背中に呼吸用パッ

in-vivo-tracking-edema-development-microvascular-pathology-model

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医学

軟膜微小循環の時間的空間的血行動態および炎症性イベントに追従するように生体顕微鏡。...

クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

我々は、GFPトランスジェニックマラリア原虫を用いて脾臓の生体顕微鏡検査を実施するための方法およびこの器官内の寄生虫のモビリティと血流​​の定量化を示す。...

脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流​​の定量的解析

このビデオでは、脳マラリアの実験的なマウスモデルの生成を示しています。Plasmodium bergheiに感染した雌の蚊から分離されたスポロゾイトは、拘束されたマウスの尾静脈に注入され、血液脳関門の破壊と脳の炎症を引き起こし、脳マラリアを引き起こします。この感染マウスモデルは、脳マラリアに関連するin...

宿主蚊由来スポロゾイトを用いた実験的脳マラリアのマウスモデル作製

出典:Arango-Lievano, M. et.al., Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases(脳血管系の縦断的In vivoイメージング:中枢神経系疾患との関連性)。J. Vis. Exp. (2016)このビデオは、蛍光標識されたアミロイドプラークと脳血管系を視覚化するためのin vivo...

アルツハイマー病モデルマウスにおける脳血管およびアミロイドプラークのin vivoイメージング

私たちは、ex vivoで標識された細胞とマウスモデルで、MRIを用いたin vivo細胞追跡のための一般的なプロトコルを記述します。細胞標識、画像取得処理および定量のための標準的なプロトコルが含まれる。...

細胞追跡のためのin vivoでの19 F MRI における

このビデオでは、ナイーブマウス視覚投影の造影MRイメージングのための急性視神経挫滅損傷および慢性視神経変性に関連視神経変性の繰り返しと縦のin vivo試験では、臨床3 Tスキャナを使用して、方法を示しているノックアウトマウス（P50 KO）。...

マウスにおける造影MRIによる視神経線維の整合性in vivoイメージング

このプロトコルは、脳の血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光（NIRF）イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）の適用を説明します。この技術は、血栓負担と進化の定量化を可能にします。 NIRFイメージング技術は、マイクロCT技術は、金ナノ粒子を用いた動物生体の内部に血栓を視覚化しながら、蛍光、切除した脳内の血栓標識可視化します。...

直接脳血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影

この原稿が縦2光子顕微鏡を用いたin vivoでのアミロイド斑の蓄積の間に脳血管系のリモデリングを追跡するための手順を説明します。間引き頭蓋骨製剤は、アルツハイマー病のマウスモデルにおける脳損傷の進行を評価するために、蛍光色素の可視化を可能にします。...

縦<em&gt;インビボ</em&gt;脳血管系のイメージング：中枢神経系疾患との関連

ここで提示されるのは、外傷性脳損傷のマウスモデルにおける非侵襲的間葉系幹細胞(MSC)の送達および追跡のためのプロトコルである。超常磁性酸化鉄ナノ粒子は、リアルタイムMRIを用いた鼻腔内送達に続くMSC標識および非侵襲的なインビボ追跡のための磁気共鳴画像(MRI)プローブとして採用されています。...

外傷性脳損傷マウスモデルにおける鼻腔内送達後のMRIを用いた超常磁性酸化鉄標識間葉系幹細胞の追跡

頭蓋内脳転移のモデル化は、腫瘍の大きさと治療に対する反応を正確かつタイムリーな方法で監視できないことによって複雑になる。提示された方法論は、磁気共鳴画像分析と頭蓋内腫瘍注射を組み合わせ、これを組み合わせると、正確で一貫した注射、強化された動物モニタリング、および正確な腫瘍体積測定を育成する。...

頭蓋内注射と磁気共鳴画像による脳転移のモデル化

本プロトコルには、蛍光発泡スチレン微小球を用いた in vivo 二光子顕微鏡イメージングに最適な慢性頭蓋ウィンドウおよび微小血管塞栓症マウスモデルの段階的アプローチを詳細に記述しています。...

蛍光発泡スチレン微小球を用いた 生体内 2光子顕微鏡用微小血管塞栓症マウスモデル

学ぶ 実験的大脳マラリアマウスモデルにおけるMRIを用いたin vivo脳病理追跡法。浮腫発生と微小血管病変の時空間的進行を可視化し、新規治療戦略の評価に有用な神経感染症イメージング技術を習得できます。

磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡

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