多光子顕微鏡によるライブセルイメージングのための大人のトランスジェニックゼブラフィッシュ網膜外植片の文化

この単離手順の全体的な目標は、損傷したゼブラフィッシュからの網膜外植片培養物で運動間核遊走を受けている増殖細胞の生細胞イメージングを可能にすることです。この方法は、どのようなメカニズムが運動間核移動を促進するのか、腎前駆細胞の運動間核移動におけるミュラーグリアが同様に制御されているのかなど、網膜再生における重要な疑問に答えることができます。この手法の主な利点は、再生中に運動間核移動を受けている増殖細胞の動的挙動を監視できることであり、これにより細胞周期段階特異的なメカニズムの調査が可能になります。

この方法は、運動間核移動に関する洞察を提供するだけでなく、ミクログリアの挙動や死にゆくニューロンのミュラーグリア食作用の調査など、他の網膜研究分野にも適用できます。この手順は、ゼブラフィッシュを乾いたペーパータオルに移すことから始めます。次に、湾曲した鉗子で片方の目を取り出し、FluoroDishに移します。

実体顕微鏡下で、瞳孔がFluoroDishのカバーガラスに面して目の向きを変え、目の後ろの視神経が見えるようにします。次に、視神経をできるだけ目の後ろに近づけて切除します。さらに、目の外側の結合組織を取り除きます。

一対の鉗子で鼻側と側頭側の間に目を持ち、片方のハサミ刃で篇椎板を突き刺し、目の鼻側と側頭側の両方に沿って切断することにより、視骨を切開します。次に、網膜の背側と腹側を引き離します。網膜に接続されているレンズを2対の鉗子で保持しながら、1対の鉗子で背側網膜から強膜を取り除きます。

その後、網膜を傷つけずにレンズと硝子体を取り外します。次に、神経節細胞層をFluoroDishのカバーガラスに向け、網膜を平らにします。その後、10マイクロリットルの1%低融点アガロースで網膜を囲みます。

わずかな上昇でも組織を通して焦点を合わせる能力に影響を与える可能性があるため、網膜が液体アガロースによって持ち上げられていないことを確認してください。浮き上がりが見られる場合は、ピペットを使用してアガロースを取り外してください。アガロースがカバーガラスから組織を持ち上げないようにすることが重要です。これにより、高品質の画像を取得する能力が低下します。

この手順を数回繰り返してから、1%低融点のアガロースをFluoroDish全体に塗布します。アガロースが固まったら、1.5ミリリットルの培地を組織に加えます。画像取得ソフトウェアで、A1 MP GUI TI パッド、A1 compact GUI、および ND 取得ウィンドウを開きます。

多光子イメージングの場合は、A1コンパクトGUIウィンドウでIRNDDオプションが選択されていることを確認します。次に、設定フィールドで、最初のダイクロイックミラーにIRDMを選択し、バンドパスフィルターが525〜50に設定されていることを確認してGFP蛍光を取得します。次に、A1 MP GUIウィンドウでIRレーザーをオンにします。

レーザーの準備が整うまで数分かかります。その後、波長を910ナノメートルに設定してGFPの蛍光を励起し、オートアライメントボタンをクリックしてレーザーを位置合わせします。網膜培養物を多光子顕微鏡ステージに置いた後、光電子増倍管の露出過多を避けるために、シャッターを開く前に部屋と機器の照明がオフになっていることを確認してください。

騒音レベルを下げるには、顕微鏡を暗い環境に保管してください。スキャンエリアウィンドウで設定された2回のズームで300 x 300ピクセルの視野の画像を取得し、A1コンパクトGUIウィンドウで選択したピクセルあたり4.8マイクロ秒のピクセル滞留時間を取得します。A1 MP GUIウィンドウで取得領域を変更し、A1コンパクトGUIウィンドウでゲインを変更して、レーザー出力を大まかに設定します。

次に、神経節細胞層に着目し、ND取得ウィンドウ内のzサブウィンドウでzスタックの上部焦点面を設定します。焦点面を外側の核層のレベルまで動かしますが、これは、薄暗く標識されたGFAPおよびGFP陽性細胞の存在によって特徴付けられます。これは、内側の核層の対応する細胞に対して丸く拡大しています。この平面をZスタックの一番下に設定します。

次に、zステップサイズを0.7〜1マイクロメートルに設定します。z強度補正を設定するには、z強度補正ウィンドウを開き、ndからzスタック範囲の設定を選択します。次に、z強度補正ウィンドウで下部の焦点面をクリックし、レーザー強度とゲインを設定します。

その後、Z 強度補正ウィンドウの Z 値の横にある矢印をクリックして、選択した焦点面の Z 強度補正ウィンドウの [デバイス設定] に後から表示される設定を確認します。中間面と上面に対してこのプロセスを繰り返し、レーザー出力とゲインを上げます。A1 MP GUIウィンドウで取得領域を設定し、イメージングの開始時に15より大きい取得領域と126を超えるゲインを選択しないようにして、写真の漂白とノイズレベルの増加を回避します。

その後、z強度補正ウィンドウで相対強度補正を選択します。ND 取得ウィンドウの時系列サブウィンドウで、期間を 8 時間に設定し、間隔を遅延なしに設定します。次に、ND取得ウィンドウのzスタックサブウィンドウで「run z correction」をクリックして、3次元時系列を取得します。

この手順では、分裂している GFAP 核と GFP 陽性核を含む領域を切り抜きます。INM を受けない核が少なくとも 1 つ含まれるトリミング領域を選択して、基底 INL に対して分割核が移動した距離を後で測定するための参照点を設定します。3D再構築の準備に役立ちます。

[スライスの表示] ビュー機能を使用して、直交投影を生成します。その後、モードをスライスから最大強度投影に変更します。次に、直交最大投影のXYビューをオフにします。

移動する原子核と分裂する原子核が最もよく見える方向に応じて、XZ ビューまたは YZ ビューもオフにします。マウスの右ボタンで残りの画像をクリックし、このビュー機能から新しいドキュメントを作成してXZまたはYZ画像シリーズを抽出します。必要に応じて、画像を回転させます。

手動測定機能を使用して、基底INLに残り、INMを受けない核の最下部レベルで、画像を横切って水平線を引きます。解析ソフトウェアの線測定ツールを使用して、時系列の基準線と移動する核の基底点との間の距離を測定します。ここに示されているのは、多光子顕微鏡によって取得されたタイムラプス記録の異なる時点における網膜外植片のzスタック画像シリーズの最大YZ投影です。

手動測定機能の下のラインツールを使用して、星で示された参照セルのレベルに水平線を配置しました。垂直測定線は、水平線から始まり、移動するGF APおよびGFP陽性核の基底位置まで延びて配置されました。多光子タイムラプス記録では、前図で測定した細胞F0が頂端に移動し、発生した娘細胞D1とD2が基底に移動した距離。

赤い線は頂端の移動速度が計算された測定値を示し、黒い線と灰色の線はそれぞれD1とD2の基礎移動速度を計算するために使用された測定値を示しています。距離は、核膜が破壊される前の頂端移動と娘細胞D1の急速な基底移動の段階について、それ自体の時間に対してプロットされました。習得すると、適切に実行すれば、3匹の魚からの網膜の分離は60〜90分で行うことができます。今回は準備手順を除外します。

この手順を試みる際には、網膜外植片の生存率を確保するために、できるだけ早く作業することを覚えておくことが重要です。また、より深い組織層でのイメージングを可能にするために、網膜をできるだけ平らに取り付けることも重要です。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュの網膜を分離してマウントする方法、運動間核移動をモニタリングするためのライブセルイメージングの実施方法、および移動速度の決定方法について十分に理解できるはずです。