計測とモデリング収縮乾燥ヒト角質層で

この手法の全般的な目的は、さまざまな化学的処理を施したヒト角層のex vivoサンプルにおいて、動的機械剛性と乾燥ストレスの蓄積を定量化することです。本手法は、角層の組成やパーソナルケア製品による皮膚組織の処理が、機械的特性および動的な乾燥挙動にどのように影響するかなど、バイオメカニクスおよび化粧品科学の分野における重要な疑問への回答に寄与します。この技術の主な利点は、他の機械的評価法に比べてより迅速な代替手段となり、必要となる皮膚組織量が大幅に少なくて済み、さらにサンプルの底面からの蒸発を防ぐことで、より生理学的に妥当な乾燥状態を提供できることです。

エラストマーコーティング済みのカバーグラスを調製するには、まずSylgard 184硬化剤とベース固形分を、ベースと硬化剤の比率が55:1になるように混ぜ合わせ、均一な状態にします。合計で6g必要です。次に、溶液を脱気します。

次に、この溶液を用いてスピンコーターでカバーガラスをコーティングします。ワイドボアピペットを使用して、混合液 1 mL をカバーガラスの中央に滴下します。その後、カバーガラスを 2,000 rpm で 60 秒間スピンコートします。

この方法で、コーティングしたカバーガラスを5枚または6枚作成します。カバーガラスをキュアさせるため、60 °Cのオーブンに12時間保持します。翌日、エラストマーフィルムの厚さを測定します。

カミソリを使用して、エラストマーフィルムの端をカバーガラスから持ち上げます。次に、不滅マジックを用いて、エラストマーフィルムの上面と、その下にある処理済みのカバーガラスに印を付けます。ここで、倒立顕微鏡を使用して、これらの印の焦点面間のZ高さを測定し、フィルムの厚さを測定します。

標準的な手順に従ってSC組織を調製します。サンプルを作成するため、SCから直径6 mmのパンチサンプルを採取します。サンプルの最外面の中心に、不滅インクマーカーで印を付けます。次に、約90 µLのビーズ濃縮液を含む15 mLの水にサンプルを浮かべ、SC表面に蛍光マーカービーズを付着させます。

30分間緩やかに撹拌し、必要に応じてビーズ濃度を調整します。処理後、各サンプルを水に浸し、エラストマーにマウントします。コーティング済みのカバースリップを、エラストマー側がSCの下側に向くように、SCの下に15〜30度の浅い角度で配置します。次に、SCが上に付着した状態でカバースリップを水から引き上げます。これにより、しわや気泡が入ることなく、SCサンプルをスムーズにラミネートできます。

次に、マウントしたサンプルを室温で約1時間乾燥させます。乾燥後、サンプルを水を入れたシャーレが入った密閉チャンバーに移します。サンプルを24時間置いて湿度を平衡化させます。

翌日、長時間のイメージングセッションのために、サンプルを灌流チャンバーに固定します。灌流チャンバーを基板の上に配置し、真空グリースを用いて灌流チャンバーの端をエラストマーに密閉します。その後、SCサンプルの全体を捉えるのに十分な視野で、蛍光画像および透過光画像を記録します。

その後16時間にわたり、10分ごとに画像を撮影します。化学薬品用ドラフトチャンバー内で、小さなプラスチックキャップに1 mLのシランを充填します。そのキャップを、エラストマーでライニングされたカバーガラス1枚を入れた密封容器に移します。この際、直接接触しないようにしてください。

室温で5時間インキュベートします。待機している間に、テキストプロトコルに従ってビーズ溶液を20 milliliters調製し、10 centimeterのディッシュに注ぎます。5時間後、シラン化された基材のエラストマー側を下にして、ゆっくりとビーズ溶液に入れます。

各ディッシュに2つの基板をロードし、基板をビーズと45分間反応させます。その後、ピンセットを用いて基板を取り出し、蒸留水で洗浄して未結合のビーズを除去します。次に、圧縮空気の緩やかな気流で乾燥させ、密閉された遮光ボックスに保存します。

前述の手法を用いて、水槽内でSCサンプルを処理済み基板上に転写します。SCをマウントした直後、希釈されていない蛍光マーカービーズ溶液を5 µL滴下してください。その後、SCを60分間乾燥させます。

次に、灌流チャンバー内で40倍の対物レンズを備えた顕微鏡を用い、SCの厚さを測定します。リモートフォーカスアクセサリーを使用して、2つのビーズ層間のZ方向の高さの差を記録し、SCの厚さの時間経過に伴う変化を測定します。一方の層はSCと基材の界面にあり、もう一方はSCの上にあります。上述の手法を用いて、SCサンプルを調製し、蛍光ビーズでコーティングしました。

相対湿度25%で16時間乾燥させた後、変位を測定しました。サンプルの円対称性により、これらの変位は方位角平均されました。乾燥過程を通じて、方位角方向の変位は小さいままでした。

しかしながら、半径方向の変位プロファイルは中心からエッジに向かって単調に増加し、平衡に達するまでその大きさが増大しました。30分間隔で記録されたプロファイルは、面内変位の時間的推移を示しています。SCの平均厚さは、主に最初の2時間にかけて、乾燥中に減少しました。

その後、最小二乗法を用いて変位プロファイルを線形弾性収縮モデルに適合させることで、乾燥ダイナミクスを分析した。このモデルから、乾燥に伴う収縮応力および弾性係数を抽出した。どちらのパラメータも、乾燥の最初の2時間で急速に増加した。

この手順を行う際は、サンプルを基板に完全に密着させることが重要です。本手順に続き、脂質染色などの他の手法を行うことで、特定の化粧品処理が組織の脂質組成をどのように変化させるかといった追加の疑問を検討することが可能です。