ダイナミックな3D腹膜のマイクロデバイスに卵巣癌多細胞スフェロイドの挙動のモデル化

この手順の全体的な目標は、卵巣がんの転移が起こる細胞および機械部品を使用して腹腔内環境をエミュレートするためのダイナミックなマイクロ流体ベースの共培養プラットフォームを作成することです。このマイクロをこのプラットフォームに使用することで、腹膜播種の微小環境など、がん生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、精密に制御されたフリーフロー下での3D共培養が、腹腔内で発生する卵巣がん細胞とメトセジア細胞との間のin vivoコミュニケーションをよりよく模倣することです。

マイクロ流体チャネルパターンを設計および描画し、テキストプロトコルに従って作成した後、SU82075フォトレジストの層をシリコンウェーハ上に1800RPMの回転速度でスピンコートします。フォトレジストでコーティングされたウェーハを、摂氏65度のホットプレートに直接5分間焼きます。その後、摂氏95度で25分間、余分な溶剤を取り除きます。

SU82075フォトレジストの2層目をウェーハ上にスピンコートし、最終的な厚さを250マイクロメートルにします。フォトレジストでコーティングされたウェーハを、摂氏65度のホットプレートに直接7分間、次に摂氏95度のホットプレートに30分間置いてから、ウェーハをゆっくりと室温まで冷却します。次に、フォトマスクをウェーハの上に直接位置合わせして配置します。

次に、それをUVライトに20秒間さらして、パターンを交差させます。ホットプレート上で、コーティングされたウェーハを摂氏65度で5分間、摂氏95度で12分間焼き、予備粘度用の溶媒を除去します。ウェハーをSU8現像液に25分間浸漬することにより、交差長のないフォトレジストを除去します。

次に、イソプロパンでウェーハをすすぎ、加圧空気を使用して乾燥させます。ポリジメチルシロキサンまたはPDMS塩基と硬化剤を10対1の質量比で組み合わせ、混合および脱気機能の下で遠心ミキサーを使用して溶液を混合します。PDMS混合物をウェーハに約5mmの高さまでゆっくりと注ぎます。

PDMSを真空デシケーターで40分間脱気します。次に、PDMSを摂氏65度のオーブンで2時間硬化させます。PDMSスラブをマスターから慎重に剥がし、スライドガラスのサイズになるまでチャネルに沿ってPDMSをトリミングします。

次に、1mmの生検パンチでPDMSをパンチし、デバイスの入口と出口を作成します。加圧空気を使用してPDMS表面を清掃し、粘着テープでほこりやPDMSの破片を取り除きます。次に、チャネル側を上に向けてPDMSスラブをプラズマクリーナーに配置します。

次に、きれいなスライドガラスをPDMSスラブと一緒にプラズマクリーナーに配置します。PDMSとスライドガラスを空気プラズマ下で高無線周波数またはRFレベルで1分間処理します。次に、プラズマクリーナーからサンプルを取り出した後、PDMSをスライドガラスに結合して、不可逆的な共有結合を作成します。

PDMSチップを150°Cのホットプレートに1時間置くと、接着強度を高め、PDMSの疎水性を戻してから使用してください。マイクロ流体チャネルをフィブロネクチンでコーティングするには、まず30マイクロリットルの75%エタノールを使用してチャネルを滅菌します。エタノールを取り除き、PBSを使用してチャネルを2回すすぎます。

次に、チャネルからPBSを完全に吸引します。30マイクロリットルの溶液を含む無血清M199MCDB105培地に1ミリリットルあたり10マイクログラムのフィブロネクチン溶液を調製し、チャネルをゆっくりと満たし、テープを使用してそれらを密封します。次に、チップを摂氏4度で一晩インキュベートします。

初代腹膜中皮細胞またはHPMCをマイクロ流体チャネルに播種するには、テキストプロトコルに従って培養細胞をすすぎた後、HPMCを再懸濁するために2ミリリットルの10%FBS培養培地を使用します。血球計算盤を使用して、細胞をカウントし、細胞濃度を10の3.5倍10〜6番目の細胞/mLに調整します。フィブロネクチンでコーティングされたマイクロ流体チップを摂氏37度のインキュベーターで5分間温めてから使用してください。

次に、フィブロネクチン溶液を完全に吸引し、30マイクロリットルのHPMC懸濁液を各チャネルにゆっくりとピペットで移します。テープを使用してチャネルを密閉し、デバイスをCO2インキュベーターに一晩置きます。卵巣がんのスフェロイド形成を誘導するには、滅菌水に0.5%アガロースを溶解します。

50マイクロリットルのアガロース溶液を96ウェルプレートのウェルに分注します。以前に培養したヒト上皮癌細胞をカウントした後、5%FBS培養培地に細胞を5,000細胞/ミリリットルの密度で再懸濁します。200マイクロリットルの細胞懸濁液を各アガロース被覆ウェルに移します。

そして、細胞を摂氏37度と5%のCO2で48時間培養します。がんスフェロイドを1ミリリットルの無血清培地で予め湿らせた50ミリリットルの遠心分離チューブに移し、スフェロイドをGの750倍で5分間スピンダウンします。無血清M199MCDB105培地中のCMFDA溶液1ミリリットルあたり2.5マイクログラムを調製した後。

がんスフェロイドを1ミリリットルの溶液に再懸濁し、スフェロイドを摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、スフェロイド数を数え、無血清培地を使用して濃度をミリリットルあたり2, 000スフェロイドに調整します。スフェロイドをローディングする前に、100マイクロリットルの無血清M199MCDB105培地をゆっくりと注入して、チャネル内の接着していない中皮細胞を洗い流します。

蛍光標識スフェロイド懸濁液30マイクロリットルを各チャネルにロードします。次に、マイクロ流体チップをCO2インキュベーターに入れます。新鮮な無血清のM199MCDB105培地を装填したシリンジを1メートルの長さのチューブに取り付けて、増殖プラットフォームを組み立てます。

シリンジをシリンジポンプに置き、プランジャーとシリンジ本体を固定します。次に、シリンジポンプをインキュベーター内のマイクロ流体チップと同じ高さの水平位置に取り付けます。媒体がチューブ内でオーバーフローするまで早送りボタンを押し続けて、チューブ全体に媒体をすばやく注入します。

次に、目的の流量で注入を実行します。テキストプロトコルに従って、チューブをチャネルの入口に接続します。次に、ショート出力チューブを使用して、チャネルの出口を50ミリリットルの円錐形チューブに接続し、流出媒体を収集します。

最後に、明視野顕微鏡または蛍光顕微鏡を使用して、HPMCとがんスフェロイドを観察します。このビデオで説明されているマイクロ流体プラットフォームを使用して、卵巣がんスフェロイドを流体力学条件下で中皮細胞でモデル化しました。この図に示すように、マイクロデバイスで16時間培養した中皮細胞は、HPMCの単層を形成することに成功しました。

この実験では、患者会で見られるものとサイズが類似した直径約100マイクロメートルの多細胞スフェロイドを緑色蛍光色素CMFDAで標識しました。その後、スフェロイドをHPMCでコーティングされたマイクロ流体チャネルに移し、懸濁状態に留まり、細胞形態を捕捉しました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、3日間で数時間で行うことができます。

この手順の10分の1は、マイクロ流体チャネルに気泡を持ち込まないように覚えておくことが重要です。この手順に続いて、薬物治療、接着アッセイ、中皮クリアランスアッセイなどの他の方法を実行して、がんの進行に対する腹腔内微小環境の影響などの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、がん生物学の分野の研究者が人間の腹膜縮死を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、流体の流れで腹膜マイクロデバイスを生成し、腹腔内で卵巣がんの行動を開始する方法について十分に理解できるはずです。アセトンなどの有機硫黄を現像剤やサイラインとして扱うことは、非常に危険であることを忘れないでください。この手順を初めて行うときは、手袋や白衣の着用などのMPの注意を常に講じる必要があります。

このオフィスを扱うすべての手続きは、極度のカバーの下で行われるべきです。