Name: 運動調節血清による靭帯構築物の治療：翻訳組織工学モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学ぼう、運動後のヒト血清を用いた3D靭帯構築物の作製法と引張試験による機械的特性評価。コラーゲン含量の増加と組織機能向上を検証する翻訳組織工学モデルです。

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この研究は、NSERCのポスドク研究員（DWDW）、ARCS財団奨学生（AL）、およびUC Davis College of Biological Sciences助成金（KB）によって支援されました。

<ol><li>West, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exercise-induced+biochemical+milieu+enhances+collagen+content+and+tensile+strength+of+engineered+ligaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The exercise-induced biochemical milieu enhances collagen content and tensile strength of engineered ligaments.</a> J Physiol. 593 (20), 4665-4675 (2015).</li>
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<li>Liu, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+we+should+know+before+using+tissue+engineering+techniques+to+repair+injured+tendons%3A+a+developmental+biology+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">What we should know before using tissue engineering techniques to repair injured tendons: a developmental biology perspective.</a> Tissue Eng Part B Rev. 17 (3), 165-176 (2011).</li>
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<li>Guerquin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+EGR1+directs+tendon+differentiation+and+promotes+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Transcription factor EGR1 directs tendon differentiation and promotes tendon repair.</a> J Clin Invest. 123 (8), 3564-3576 (2013).</li>
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<li>Paxton, J. Z., Hagerty, P., Andrick, J. J., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+an+intermittent+stretch+paradigm+using+ERK1%2F2+phosphorylation+results+in+increased+collagen+synthesis+in+engineered+ligaments%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Optimizing an intermittent stretch paradigm using ERK1/2 phosphorylation results in increased collagen synthesis in engineered ligaments.</a> Tissue Eng Part A. 18 (3-4), 277-284 (2012).</li>
<li>Safdar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+exercise+rescues+progeroid+aging+and+induces+systemic+mitochondrial+rejuvenation+in+mtDNA+mutator+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 4135-4140 (2011).</li>
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<li>Crane, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-stimulated+interleukin-15+is+controlled+by+AMPK+and+regulates+skin+metabolism+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Exercise-stimulated interleukin-15 is controlled by AMPK and regulates skin metabolism and aging.</a> Aging Cell. 14 (4), 625-634 (2015).</li>
<li>Rao, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meteorin-like+is+a+hormone+that+regulates+immune-adipose+interactions+to+increase+beige+fat+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis.</a> Cell. 157 (6), 1279-1291 (2014).</li>
<li>Aswad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+participate+in+the+alteration+of+muscle+homeostasis+during+lipid-induced+insulin+resistance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Exosomes participate in the alteration of muscle homeostasis during lipid-induced insulin resistance in mice.</a> Diabetologia. 57 (10), 2155-2164 (2014).</li>
<li>Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+endurance+exercise-derived+exosomes+to+treat+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases.</a> Nat Rev Endocrinol. 12 (9), advance online publication 504-517 (2016).</li>
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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

本稿は、組織発達から翻訳/臨床的質問まで、幅広い研究テーマを持つ研究者にとって有用な実験プラットフォームである靭帯組織のモデルを記述している。ここで説明するエンジニアリングされた靭帯モデルは、ワークフローのさまざまな時点で適用可能な汎用プロトコルに基づいています（ 図1およびディスカッションセクション ）。さらに、 インビトロ環境の本質的に還元的な性質は、飼育培地にコンディショニングされたヒトまたは動物の血清を補充することによって、生理学的領域に近づけることができる。 構築物は、様々な供給源からの線維芽細胞を用いて形成することができる ここに示された方法論および代表的な結果は、一次ACL線維芽細胞の使用に基づいているが、細胞単離プロトコルは、他のタイプの一次線維芽細胞を収集するために調整することができる。説明したように図4において、若いヒトドナーから単離された一次細胞で形成された人工靭帯は、低いドナー変動性を示す。一次細胞は、初期分離および通過制限によって制限される。細胞株の使用は実験の再現性を改善することができる。他の細胞タイプの使用は、細胞培養培地およびフィブリンゲル製剤の改変を必要とすることがある。例えば、我々は、ヒト間葉系幹細胞（MSC）が2週間にわたってブラシサイトセメントアンカー間に線状組織を形成することができないことを観察したが、ウマ上位デジタル屈筋腱線維芽細胞、ウマ骨髄間質細胞、ニワトリ胚腱線維芽細胞マウスC3H10T1 / 2 MSCは、フィブリンゲルを急速に収縮させて線状組織を形成する（未発表の観察）。このコントラストは、細胞収縮性、増殖および線維素溶解酵素産生の違いの結果であり得る。 化学薬品の適用および機械的刺激 本明細書に記載される方法では、フィブリンベースの組織がブルシャイトセメントアンカーの周りに形成され、ストレッチバイオリアクター11を介する機械的刺激の適用、並びにエンドポイント引張試験が可能になる。ブルサイトセメント - 軟組織界面（エントリー）の存在は、さらなる調査および改善の機会を提供する22,26（下記の臨床応用のセクションを参照）。このインビトロ環境では、化学的および機械的因子の寄与がより容易に同定され得る。これの一例が図5に示されており、それによって運動後の血清環境の効果が運動の機械的な刺激から分離された。実験的介入の時間枠、治療の組成、および観察可能な変化を期待するための適切なエンドポイントを決定するためにパイロット研究が必要な場合があります。フォ例えば、運動後の血清試験1では、実験的処置の長さは、培地を補うために使用される血清の供給によって制限され、そこから構築物は2日毎に栄養補給された。さらに、培養の2週間目に、培養培地にアスコルビン酸およびL-プロリンを維持したまま休止または運動後の血清を補充し、TGF-β1を除去した。 TGF-β1は、運動後に血清中に増加する既知の前線維増殖因子である27 。したがって、運動後血清のTGF-β1関連効果を不明瞭にするのを避けるために、このサイトカインは培地中に維持されなかった。 このエンジニアリングされた靭帯モデルは、機械的ストレッチの影響を試験するためにも使用することができる。ブルシャイトセメントアンカー端部（ 図1に示す一軸引張試験機と同様）を保持するようにリバースモデルグリップを設計することにより、ストレッチバイオリアクターをeng<html> ineered ligaments。私たちの研究室では以前、このモデルを使用して、イン・ビトロストレッチ・パラダイムの合理的な設計、あるいは潜在的にはイン・ビボでのより合理的な設計を提供する、カスタムメイドのバイオリアクター11における一軸引っ張りストレッチに対する人工靭帯の分子シグナル伝達応答を調べたストレッチ/活性/治療用途。 設計された靭帯の評価 伝統的な単層培養と同様に、3D構築物は遺伝子/タンパク質発現についてアッセイすることができる。さらに、それらの3D形態は、機能的および形態学的変化を評価する機会を提供し、構築物を長期間の研究のために培養液中で維持することができる（ 図3 ）。エンジニアリングされた靭帯は、天然の成熟した靭帯と同等ではないが、腱/靱帯の発達と類似しており、栄養素に応答して天然の組織と同様に挙動する従って、 インビトロモデルからの広範な一般化を行う前に注意が必要であるが、靭帯構築検査の結果は、そうでなければそうであるかもしれない特定の生理学的メカニズムを明らかにするか、または通知することができる。 in vivoで調べることは不可能です。 幅広い用途のフレキシブルでダイナミックなモデルのための条件付き血清を補給するための培地 ヒト血清メタボロームは、糖タンパク質、リポタンパク質、脂質誘導体、エネルギー基質、代謝産物、ビタミン、酵素、ホルモン、神経伝達物質、およびビルディングブロック/中間体の過多を含むが、これらに限定されない約4,500化合物の環境である。化合物クラス29によるヒト血清メタボロームのさらなる検査により、実験的血清をインビトロ実験に組み込むことの1つの利点がある。すなわち、血清中の〜4500の化合物の大部分は、疎水性または脂質由来であり、輸送/可溶化のための結合タンパク質の重要性を強調している。したがって、内因性化合物の輸送動態、したがってバイオアベイラビリティーおよび化合物 - 標的相互作用を実験的に要約することは、ほぼ不可能であろう。したがって、実験的血清は、可溶化、輸送、標的結合、および作用機序のためにアクセサリー分子に依存することが知られている化合物の研究に特に有効である。 私たちの研究室では、運動の健康上の利点に長い間関心があります。運動は、様々な要因（例えば、IL-6 13 、IL-15 14 、Meteorin-like 15など）に起因する可能性がある効果である、体12全体にわたる様々な組織における細胞機能および器官機能を改善する。エキソソーム16,17 ）が、全身循環に放出される。運動後の生化学的環境は、骨格筋運動に応答するホルモンの収縮および分泌腺の交感神経刺激（ 例えば 、副腎18由来のコルチゾールおよびカテコー​​ルアミン）の結果として放出される因子の両方から放出される因子を反映する下垂体前葉からのホルモン19 ）。我々は最近、運動前および後の血清のモデルを用いて、運動誘発された生化学的環境が人工組織に及ぼす影響を調べた。多くの重要な運動関連の研究課題が残っているが、このモデルは決してこのように限定されるものではない。例えば、食物または薬理学的介入後、または異なる年齢群または臨床集団からの動物またはヒトの供給源から血清を得ることができたs 30 。このようにして、目的の外因性または内在性の化合物は、生物学的利用可能な量で血清および処理媒体中に存在し、内因性環境と協調して（ すなわち 、より生理学的な状況において）標的組織と相互作用する。このアプローチは、与えられた介入が多臓器（および多化合物）効果を発揮する可能性が高く、したがって生理学的環境が共同修正される可能性が高いため、動的アプローチである。このアプローチはある種の課題を提示するが、複数の全身生化学的変数が同時に変更されるため、純粋に還元的な実験方法論31,32の欠点を克服するのに役立つアプローチである。まとめると、組織工学処理された（ 生体外生体模倣 ）組織と共に条件付き血清を実施することは、生理学、栄養および臨床研究の質問のためのツールとして使用することができる。 <strong&gt;臨床応用は数多くあります ここに示した組織工学モデルは、伝統的なインビトロモデルでは不可能な解剖学的および臨床研究の問題を調査するために使用できます。 インビボの靱帯または腱は 、エントレと呼ばれる軟組織から硬組織への移行領域を含む。機械的ストレスに関連した損傷33に対して脆弱なenthesisは、組織化学的および電子顕微鏡法22,26を介して断面で研究することができる。物理的な不活動は結合組織が低〜高コンプライアンス34の領域に負荷を伝達する能力を損ない、最終的に組織コンプライアンスの全体的な低下および傷害リスクの増大を招くため、この独特の界面は運動性が低いまたは拘束されていない人にとって二重に重要である。 私たちの研究室では最近、この組織工学モデル25 &lt;他の集団、女性の運動選手、結合組織損傷の危険性があるモデル：ACL傷害の発生率は、男性の約35倍です。生理的濃度の女性ホルモンであるエストロゲンを用いて靭帯構築物を月経周期の段階を模倣した濃度で処置することにより、この性別に基づく負傷の根底にある可能性のあるメカニズムを調べた。興味深いことに、高濃度のエストロゲンは、靭帯および腱のコラーゲンマトリックス中にリジン - リジン架橋を形成する一次酵素であるlys1オキシダーゼの遺伝子発現および活性を阻害した。重要なことに、48時間の高エストロゲン（卵胞期をシミュレートする）は、構築物のコラーゲン密度を変えずに靭帯構築物の剛性を減少させた。生理学的観点から、これは、女性における靭帯の弛緩の増加が、少なくとも部分的には、クロスリンク形成。実験的な観点から、これらの知見25は、機能的架橋結合活性を調べることができる3D構築物モデルの有用性を強調している。臨床的観点から、このモデルは、靭帯機能のエストロゲンの負の影響を防ぐことができる介入を迅速にスクリーニングするために使用できるようになりました。 閉会の言葉 ここでは、設計された靭帯の形成のための詳細な方法論と3D インビトロ組織モデルとしてのそれらの有用性を提示した。このモデルは幅広い目的に非常に適応し、細胞タイプ、介入、および目的の結果尺度の柔軟性を提供する。調整された血清を含む飼料培地を補充すると、伝統的なインビトロ環境では達成できない生理学的状況が加わり、 インビボ生理学のモデリングが改善される 。つまり、これは広く適用可能なモードであると考えています生理学と組織工学の両方の分野をさらに発展させるための刺激的な意味合いを持っています。

腱と靭帯の傷害は一般的であり、正常な運動性と生活の質に悪影響を与える可能性があります。外科的介入はしばしば必要であるが、限定された様々な成功をもたらすことができる4,5 。腱や靭帯がどのように発達し、成熟し、怪我に反応するかについての現在の理解は不完全であり、より効果的な治療法の開発についての洞察を提供するためには効果的な研究モデルが必要である5 。この知識のギャップに対処するために、動物モデルを使用することができるが、in vivo研究は本質的に複雑であり、環境を制御することおよび意図された組織への介入を直接標的とすることが困難である。対照的に、実験環境は、伝統的な単層細胞培養を用いてインビトロで容易に制御および監視することができる。しかしながら、この技術は化学的および機械的環境を単純化し過ぎる可能性があり、従って再現することはできない細胞のインビボ挙動の遅れを遅らせる。組織工学は、in vitro環境の制御と動物モデルにおける複雑なインビボ環境の利点と結びつくことができ、生理学を研究するための追加のツールを提供する。さらに、靭帯の発達の理解を武器に、組織工学は外科的再建が必要な場合に移植組織の源を提供する可能性があります。したがって、本明細書に記載される方法は、靭帯の機能および形態を研究するために使用され得るin vitroで操作される 3D組織を検証する。 フィブリンベースの腱または靱帯構築物は、コラーゲン原線維形成7および腱発生8ならびに移植組織としての有用性を前胸のヒツジモデルで評価した翻訳適用を含む生理学的過程を研究するためのインビトロモデルとして使用されているciate ligament（ACL）再建9 。私たちの研究室では、以前は、2つのブラシ石、リン酸カルシウム骨代替材料、セメントアンカーにまたがる3Dエンジニアリング靭帯モデルを確立しました。このモデルは、培養培地に生物学的因子10を補充するか、または機械的刺激11を適用するだけで、容易に異なる実験条件に供することができる。重要なことに、この骨 - 靭帯モデルは、怪我の影響を受けやすいボーンと腱の境界面である、エンセプションの詳細な分析を可能にします。 この方法論を提示するためにここで強調した1件の研究では、我々は靭帯機能に関する生化学的環境における運動誘発性変化の効果に興味があった。運動は、身体全体の様々な組織における細胞機能および器官機能を改善する2,3 、 </su様々な既知の（例えば、IL-6 13 、IL-15 14 、Meteorin様15 、エキソソーム16,17 ）、および全身循環に放出される他の未知の生化学的因子の放出に起因し得る効果であるp&gt; 。さらに、運動後の生化学的環境は、分泌腺（ 例えば 、副腎18からのコルチゾールおよびカテコー​​ルアミン、および下垂体前葉19からの成長ホルモン）の交感神経系刺激によって放出される運動反応性ホルモンによって富化される）。しかし、 インビボでは、運動の機械的刺激の効果を運動誘発生化学的変化と区別することは不可能である。いくつかの研究では、エクササイズに応答する特定の循環ホルモンおよびサイトカインの予想される上昇を特徴付けているが前述のように、 インビトロで忠実に再現するには 、既知または未知の因子が多すぎます。すなわち、インビトロ研究のいくつかの因子を単離することは、生化学的応答の複雑さに十分に対応していない。本研究では、運動によって引き起こされた血清生化学的環境の変化が人工靭帯機能にどのように影響するかを調べた。生化学的変化の影響を分離するために、抵抗運動の前後前後でヒト参加者から血清を取得し、ヒト前十字靭帯（ACL）線維芽細胞を用いて形成された3D人工靭帯を治療するために使用した。このモデルを使用して、機械的特性およびコラーゲン含量への影響を含む機能的データを得ることができ、分子シグナル伝達への影響を定量化することができる。

<table><tbody><tr><td>Austerlitz昆虫ピン、minutienステンレス鋼、サイズ0.20</td><td>Entomoravia</td><td>N / A</td><td>ブラシセメントアンカー用</td></tr><tr><td>&beta;-リン酸三カルシウム</td><td>プラズマBiotal株式会社(ダービーシャー、英国)</td><td>N / A</td><td>ブラシセメントアンカーo</td></tr><tr><td>-リン酸、85%(w / w)</td><td>EMDミリポア</td><td>PX0995</td><td>ブラシセメントアンカー用ク</td></tr><tr><td>エン酸シグマ</td><td>-Aldrich</td><td>251275-500g</td><td>ブラッシュセメントアンカー用</td></tr><tr><td>ファルコン 35 mm 組織培養皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-772A</td><td>シリコーンコーティングプレート用</td></tr><tr><td>シルガード 184 シリコーンエラストマーキット</td><td>エルスワース 接着剤</td><td>4019862</td><td>シリコーンコーティングプレート用</td></tr><tr><td>1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td> <td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>SH3002802</td><td>細胞の分離と増殖</td></tr><tr><td>100x 抗生物質/抗真菌薬溶液</td><td>VWR</td><td>45000-616</td><td>細胞単離用</td></tr><tr><td>II型コラゲナーゼ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17101015</td><td>細胞単離</td></tr><tr><td>用 100xペニシリン/ストレプトマイシン溶液</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td>細胞単離用</td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0.22&nbsp;&マイクロ;m細孔、ポリエーテルスルホン、ガンマ</td>線照射<td>EMD ミリポア</td><td>SCGP00525</td><td>試薬滅菌用</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウムとL-グルタミンを含むDMEM高グルコース</td><td>VWR</td><td>10-013-CV</td><td>細胞および組織培養用</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>バイオセラ</td><td>FBS2000</td><td>組織消化培地および増殖培地の成分</td></tr><tr><td>ペニシリンG カリウム塩</td><td>MP バイオメディカル</td><td>0219453680-100MU</td><td>成長培地の成分。100,000 U/mLまで水に溶解し、ろ過滅菌、分注し、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>CELLSTAR ポリスチレン組織培養ディッシュ (145 mm x 20 mm)</td><td>VWR</td><td>82050-598</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T10282</td><td>細胞単離用</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25200056</td><td>細胞培養用。PBSジメチルスルホキシドで0.05%に希釈</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>細胞凍結培地</td></tr><tr><td>用 Nalgene Mr. Frosty 極低温凍結容器</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>5100-0001</td><td>細胞凍結用</td></tr><tr><td>BDバキュテイナー レッドプラスチック 10mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>367820</td><td>ヒト血清採取用</td></tr><tr><td>Bound Tree Insyte Autoguard IVカテーテル、22 G x 1インチ ニードル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>354221</td><td>ヒト血清採取用</td></tr><tr><td>トロンビン、ウシ由来</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>T4648-1KU</td><td>人工靭帯形成用。DMEM高グルコース培地に200 U/mLで溶解します。0.22 &mu; でフィルターします。m、アリコート、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>フィブリノーゲン、ウシ由来</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td>人工靭帯形成用。DMEM高グルコース培地に20 mg / mLで溶解します。.0.22 &mu; でフィルターします。m、アリコート、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>ウシ肺由来アプロチニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3428</td><td>人工靭帯形成用。10 mg / mLで水に溶解します。.0.22 &mu; でフィルターします。m、アリコート、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>6-アミノヘキサン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>07260-100g</td><td>人工靭帯形成用。0.1 g/mL で水に溶解します。0.22 &mu; でフィルターします。m、アリコート、4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸2-リン酸セスキマグネシウム塩水和物</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>A8960-5G</td><td>飼料媒体の成分。DMEM高グルコース培地に50mMの濃度で溶解します。0.22 &mu; でフィルターします。mと4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>L-プロリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>フィードメディアのコンポーネント。PBSに50 mMの濃度で溶解します。0.22 &mu; でフィルターします。mと4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>トランスフォーミング成長因子-&β;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>飼料用メディアのコンポーネント。製造元の指示に従って、10 &muの濃度で再結合します。g/mLです。アリコートして-20°Cで保管します。</td></tr><tr><td>Stericup-GPの0.22&nbsp;&マイクロ;m、ポリエーテルスルホン、250&nbsp;mL、放射線滅菌EMD</td><td>ミリポア</td><td>SCGPU02RE</td><td>試薬滅菌用</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A144-212</td><td>水で6 M</td></tr><tr><td>4-ジメチルアミノベンズアルデヒド</td>に希釈 <td>Sigma-Aldrich</td><td>39070-50g</td><td>ヒドロキシプロリンアッセイ用</td></tr><tr><td>クロラミン-T三水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402869-100g</td><td>ヒドロキシプロリンアッセイ用</td></tr><tr><td>trans-4-ヒドロキシ-L-プロリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H54409-100g</td><td>ヒドロキシプロリンアッセイ用</td></tr><tr><td>1-プロパノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>279544-1L</td><td>ヒドロキシプロリンアッセイ用</td></tr><tr><td>過塩素酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421-250ml</td><td>ヒドロキシプロリンアッセイ</td></tr>用 <tr><td>酢酸、氷河</td><td>EMDミリポア</td><td>AX0073-9</td><td>ヒドロキシプロリンアッセイ用</td></tr> 水<tr><td>酸化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S318-500</td>ヒ<td>ドロキシプロリンアッセイ</td></tr>トル<tr><td>エン、無水シ</td><td>グマアルドリッチ</td><td>244511-1L</td><td>ヒドロキシプロリンアッセイコー</td></tr><tr><td>ニングコスタークリアポリスチレン96ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-200-656</td>ヒ<td>ドロキシプロリンアッセイ用</td></tr></tbody></table>

運動調節血清による靭帯構築物の治療：翻訳組織工学モデル

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

インビトロ実験は、生物学的メカニズムを理解するために不可欠である。しかし、単層組織培養とヒトの生理との間のギャップは大きく、所見の翻訳はしばしば貧弱である。したがって、代替の実験的アプローチのための十分な機会がある。ここでは、ヒトの前十字靭帯組織の残骸からヒト細胞を単離し、培養を拡大し、人工靭帯を形成するために使用するアプローチを提示する。運動は、多くの組織、器官および身体過程の機能が改善されるように、血液中の生化学的環境を変化させる。この実験では、靱帯構築培地に、運動によって「調整された」実験的ヒト血清が補充された。このように、介入は、実験的組織が完全な内因性生化学的環境に曝露されるため、より生物学的に関連している。結合タンパク質および補助化合物には、関心のない未知のエージェント。治療後、操作された靱帯は、機械的機能、コラーゲン含有量、形態、および細胞生化学について分析することができる。全体として、伝統的な単層培養および動物モデル、ここで提示される靭帯組織の生理学的モデルに対する4つの大きな利点がある。第1に、靭帯構築物は三次元であり、極限引張応力、最大引張り荷重および弾性率などの機械的特性（ すなわち機能）を定量化することを可能にする。第2に、ボーンと腱要素との間の境界であるエンテシスを、詳細かつ機能的な状況で検査することができる。第3に、運動後の血清を含む培地を調製することにより、運動の広範な健康上の利益を担う運動誘発生化学的環境の影響を偏りのない方法で調べることが可能になる。最後に、この実験モデルは、科学的研究を人道的かつ倫理的な方法で進歩させ、動物、国立衛生研究所の中心的任務、疾病管理センター、食品医薬品局（FDA）などが含まれます。

人工靱帯形成および実験的介入の概要 図1は、設計された靭帯の形成の概要を示す。ブルシャイトセメントでは、オルトリン酸/クエン酸溶液をβ-リン酸三カルシウムと円筒形のウェルに組み合わせることによって、骨代用材料22を調製する。あるいは、組織の機械的機能を直接的に測定しない場合、3-0の絹縫合糸を組織の形成におけるアンカーとして使用することができる。これらをシリコーンでコーティングした35mm皿で12mm離して固定し、70％エタノールに浸して滅菌する。線維芽細胞は、ACL再構築手術中に得られた前十字靭帯残渣から単離される。増殖後、2.5×10 5個の細胞が、ブラシサイトセメントアンカーピンディッシュに形成されたフィブリンゲルに封入される。形成後、靭帯constr機械的性質、コラーゲン含量、細胞増殖、遺伝子発現、タンパク質レベル、および組織形態の変化について調べることができる。 培養中、細胞はフィブリンゲルを収縮させ、2つのアンカーの間に線状組織を形成する（ 図2A ）。培養1〜2日後、細胞はフィブリンゲルに付着し、細胞プロセスが拡張し、牽引力を発揮し始めた（ 図2B ）。フィブリンゲルは牽引力によって収縮し、細胞酵素によって分解されるので、2つのアンカーポイント間に張力が生じ、細胞はこの軸に平行に整列し（ 図2B ）、コラーゲンの沈着を開始する。 4-5日後、構築物は、アンカーの周りで収縮して直線状の円筒形組織を形成した（ 図2A ;この時点で、外部刺激がシステムに適用され得るこの時点で、線状組織形成プロセスの混乱を回避する）。介入は、与えられた介入後のヒトまたは動物の血清、外因性サイトカインおよび成長因子、機械的刺激を用いるか、または酸素張力などの他の環境因子を変化させることによって培地を補うことからなる。 200μMのアスコルビン酸、50μMのL-プロリン、および5ng / mLのTGF-β1を補充した増殖培地（10％FBSおよび100U / mLペニシリンを含むDMEM）を使用して、我々は細胞増殖が2週間培養（ 図2C ）、実際に、光学顕微鏡法は培養14日目に高度に整列した細胞を含む高密度組織を明らかにする（ 図2B ）。 設計された靭帯の評価培養期間の終わりに、操作された靭帯は、多様体で評価することができるyの方法。このシステムの主な利点は、機械的試験（天然の靭帯の機械的役割を考慮した重要な評価）によって組織の機能的変化を決定する能力である。一軸引張試験を利用して、破壊荷重、極限引張強さ、およびヤング率を含む機械的特性を測定することができる。粘弾性特性は、応力緩和およびクリープ試験によっても測定することができる。 図3Aは、特注の一軸引張り試験機の逆成形グリップに保持された加工靱帯を示す。右のグリップは、組織が破損するまで靭帯の荷重を測定するために力トランスデューサに取り付けられています。 図3Bは、試験の失敗に対する代表的な応力 - 歪みプロットを示す。機械的試験を受けた後、同じ構築物を乾燥させ、ヒドロキシプロリンアッセイ23のために処理して、総コラーゲン含量ならびに他のバイオシェースを評価することができるmicalアッセイ。 1条件につき十分な数の追加サンプルを用いて、細胞増殖、遺伝子およびタンパク質発現、および組織学的形態に対するその効果を含む実験的介入の徹底的な試験を行うことができる。我々の研究の代表的なエンドポイントは14日間ですが、人工靭帯は、 図3Cに示すように培養28日を通して機械的特性およびコラーゲン含量を改善し続け、培養で少なくとも3ヶ月間生存することができます24 。 ドナーの変動性は、実験的な再現性にとって重要な考慮事項です。 図4は、Lee らによって報告された代表的な実験を示す。以前に記載された2週間の培養後に典型的な引張特性およびコラーゲン含量を示す7つの異なるACLドナー（n = 3の雄およびn = 4の雌）を比較した<html>補充された増殖培地。同様のACLコレクションの細胞、ドナーの年齢、損傷後の時間、性別などを用いて、操作された靭帯は、ドナー間の変動性が低く、オスとメスのドナー間の類似の特性がコラーゲン画分の違いを除いて低いことが示される。前述の研究では、人工靭帯をインビトロモデルとして使用して、なぜ女性がACL傷害の危険性が男性よりも高いのかを調べ、雌ドナーから単離されたACL線維芽細胞は本質的に弱く、 運動後の血清環境がインビトロ靭帯機能に及ぼす影響我々は以前に、人工靭帯が生理学的プロセスを探査するために使用される能力を実証した1 。ss = &quot;xref&quot;&gt; 25。 Westらが報告した以下の代表的な実験において、 1 、我々は靭帯機能に及ぼす運動の生化学的影響を決定し、ここで方法論と所見を強調した。我々は、ヒトACL細胞を用いて人工靭帯を形成し、培養7日目に、運動前または運動後に収集したヒト血清で調整した培養培地からなる介入を適用した。簡潔に述べると、我々は健康な若い男性参加者を募集し、循環ホルモンおよびヒト成長ホルモン（GH）を含むサイトカインを増加させる急性抵抗運動の前後に血液サンプルを採取した。ヒト血清を運動前および運動後の血液サンプルから単離し、エンジニアリングされた靱帯培養の2週間目の培養培地中でウシ胎仔血清の代わりに使用した（ 図5A ）。運動前および運動後の血清サンプルを、GHおよびインスリン様増殖因子1（IGF-1）の変化についてELISAを用いて分析し、その濃度は運動によって変化させることができる（ 図5B ）。この情報は、運動に応答して血清中の変化を伴う人工靭帯に対する血清効果を相関させるために使用された。 14日間の培養期間後、機械的試験およびコラーゲン含有量のヒドロキシプロリン測定を用いて靱帯構築物を評価し、運動後血清に応答して最大引張荷重およびコラーゲン含量の有意な増加を実証した。この効果がGHまたはIGF-1の運動誘発性放出に関連しているかどうかを評価することを目的として、操作された靭帯を別の実験で形成し、ヒト組換えGHまたはIGF-1の用量応答で処置した。興味深いことに、血清GHは血液中で増加したが（ 図5B -i）、培地中の組換えGH濃度の増加はコラーゲン含量を増加させなかった（ 図5D -i）か、または機械的設計された靭帯の特性（データは示されていない）。対照的に、血清IGF-1レベルは運動後には増加しなかったが、用量応答実験は培養培地中のレベルが増加すると靱帯構築物のコラーゲン含量を改善することを明らかにした（ 図4D- ⅰ）。したがって、運動は運動後のGHの堅牢な増加をもたらすが、rhGHを用いた用量応答実験は、GHが人工靭帯の表現型増強に直接関与するか否かについて疑問を提起する（少なくとも22kDaのアイソフォーム単独では責任あると思われる）。逆に、運動後15分で血清IGF-1は変化しなかったが、広範囲の濃度にわたってrhIGF-1を試験することにより、IGF-1はコラーゲン含量を改善することができた。しかし、生理学的レベルを推定した範囲でrhIGF-1濃度を増加させても、コラーゲン含有量は有意に増加しなかったことに留意すべきである。したがって、ユニークな運動後血清エンバイロエンジニアリングされた靭帯の力学およびコラーゲンの改善に重要であった。 ここで強調された研究では、実験的血清の量は倫理的考慮のため制限されていた。したがって、観察されたコラーゲンの増加に関与する分子機構をさらに調べるために、より低い血清要求を有す​​る短期2Dバイオアッセイを使用した。 ACL線維芽細胞を6ウェルプレートでコンフルエントに培養し、休息または運動後血清で1時間処理し、組換えGH、IGF-1、TGF-β1の用量反応およびPI3K / mTORC1における標的の活性化と比較した、ERK1 / 2、およびSmadシグナル伝達経路を決定した。運動後血清の存在下で、PI3K / mTORC1およびERK1 / 2経路は、それぞれS6K（ 図5D -i）およびERK1 / 2（ 図5D -i）のリン酸化によって評価されるように、より大きな活性化を示した。ホルモンおよびサイトカインの用量応答と比較して、GHはmTORシグナル伝達に対してわずかな陽性効果を示し（ 図5D -i）、IGF-1は最低用量で陽性効果を示したが、GH、IGF-1およびTGFの3つの処置-β1は、PI3K / mTORC1およびERK1 / 2シグナル伝達の増加を説明しなかった。私たちの3Dエンジニアリング靭帯モデルと2Dバイオアッセイデータは、運動後の血清環境がPI3K / mTORC1とERK1 / 2経路の活性化を通じて人工靱帯機能とコラーゲン含量を改善できることを示唆しています。 要約すると、私たちは、運動後の血清と組み合わせた人工靭帯モデルを用いて、i）人工靭帯機能およびコラーゲンに対する運動後の血清環境の効果を調べること、ii）靭帯表現型の変化を血清ホルモン濃度の変化、血清中のどの変化が変化するかを決定することを目的としているiii）靭帯機能の改善につながる運動後の血清によって活性化される分子機構を決定するために、血清生化学的環境の分子標的を調べるため2Dバイオアッセイを使用することにより、この研究の範囲をさらに広げる。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig1.jpg" /> 図1：人工靭帯の形成と使用の概要。ブルシャイトセメントアンカーが製造され、シリコーンでコーティングされたプレートに固定される。初代線維芽細胞は、ACLの残骸から分離され、拡張される。エンジニアリングされた靭帯は、フィブリンゲル中の繊維芽細胞を2つのブラシサイトセメントアンカーの周りに封入することによって形成される。操作された靭帯を培養し、所望の特定の化学的または機械的（ 例えば 、バイオリアクターを介して）の刺激で処理する。所望のエンドポイントにおいて、操作された靱帯を収集し、mechanicaについて評価することができる特性、遺伝子発現、コラーゲン含量、タンパク質発現、および組織学を含む。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig2.jpg" /> 図2.一次靭帯線維芽細胞は、フィブリンを基盤とした骨 - 骨接合の人工靱帯を形成し、2つのブラシ石セメントアンカーにまたがる。 （ A ）時間とともに、繊維芽細胞は線状組織を形成するブラシ石セメントアンカーの周りのフィブリンゲルを収縮させる。 （ B ）最初の3日間で、細胞はフィブリンゲルに付着し、細胞を構築物の長軸に整列させて牽引力を加える。 14日間にわたって、細胞は高度に整列した組織を形成する。スケールバー=160μm。 （ C ）操作された靭帯のDNA含有量は、培養14日目に細胞が増殖する。データは、群当たりn = 3-4構築物で平均±SDとして提示される。グループ。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig3.jpg" /> 図3：人工靱帯の機械的特性およびコラーゲン含有量は、経時的に改善する。 （ A ）靱帯構築物は、靭帯機能に対する所定の介入の効果を決定するために一軸引張試験を受ける。示されているように、2つの逆成形された3D印刷グリップは、設計された腱によって架橋された、相互に整形されたアンカーを保持する。アンカーは、ステッパーモーターおよび力変換器に結合され、試験された組織の応力/歪み曲線を生成し、機械的特性を決定することを可能にする。 （ B &lt;/ strong&gt;）破損した人工靱帯の代表的な応力 - 歪み曲線。 28日間にわたって、（ C ）極限引張強度（UTS）、（ D ）最大引張荷重（MTL）、（ E ）ヤング率および（ F ）コラーゲン画分が改善し続ける。データは、群当たりn = 5構築物で平均±SDとして提示される。 *は、他のすべてのグループと有意差があることを示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig4.jpg" /> 図4：設計された靭帯は、低いドナー変動性を示す機能性および生化学的な内容について評価することができる。操作された靭帯は、7人の異なるドナー（n = 3雄、n = 4雌）を形成した。 2週間後（ C ）ヤング率、（ D ）断面積（CSA）、（ E ）総コラーゲン含量（％）、コンストラクト、および（ F ）乾燥質量の一部としてのコラーゲン。データは平均±SDとして示され、統計的有意性はスチューデントのt検定で得られた。 *は他の群と有意差があることを示す（p &lt;0.05）。 Lee et al。 25 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig5.jpg" /> 図5.エンジニアリングされた靭帯は、バイオロに応答して機械的および生化学的変化を示す穏やかな介入。 （ A ）血清は、前（RestTx）および運動後（ExTx）の被験者から採取した採血から単離し、培養の2週間目に人工靭帯を処置するために使用した。 （ B ）（i）残りの血清および運動血清中のヒト成長ホルモン（GH）および（ii）インスリン様成長因子（IGF）-1レベルをELISAによって定量した。 （ C ）ExTxで処理した操作された靭帯は、（i）コラーゲン含量および（ii）最大引張荷重の改善を実証した。対比較（RestTxおよびExTx）の統計的有意性は、有意水準をp &lt;0.05に設定したt検定によって分析した。 （ D ）（i）GHおよび（ii）IGF-1の用量応答を用いて、ExTxに起因するコラーゲン含量の変化に対するこれらの因子の可能な寄与を決定した。 E）2Dバイオアッセイを使用して、GH、RestTx、およびExTxの漸増用量の分子シグナリング標的（例えば、S6K Thr38のリン酸化 ）に対する効果を比較した9および（ii）ERK1 / 2 Thr202 / Tyr204 。 2つ以上の実験群の統計的比較は、ANOVAおよびTukeyのHSDを用いて行った。データは、平均±SDとして提示される。 *は対照との有意差（p &lt;0.05）を示し、§は150 ng / mLおよび300 ng / mL IGF-1との有意差を示す。ウェストら（ West et al。 1 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55339/55339fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

本発明者らは、三次元構築物をヒトの運動調節血清で処理し、コラーゲン含有量、機能および細胞生化学について分析した靭帯組織のモデルを提示する。

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

本モデルの全体的な目的は、運動と栄養が結合組織の合成および機能に及ぼす影響を明らかにすることです。本手法では、運動前後に採取したヒト血清を用いて3D組織を処理し、運動が靭帯や腱の機能にどのように影響するかを解析します。3D組織を用いることで、十分に特性解析されたin vitroアッセイの利点と、in vivo組織の機能、形態、および生化学的特性を併せ持つことが可能になります。テキストのプロトコルに従って、あらかじめシリコンコーティングした35mmプレートを準備し、モールドの各円筒形ウェルの中心にミニチュエピンを1本ずつ配置してアンカーモールドを作成します。プラスチック製量り皿の上で、氷冷しながら、β-リン酸三カルシウムと1〜3 g/mLの正リン酸クエン酸溶液を混合します。プラスチック製セルスクレーパーを使用して、セメントを激しく混ぜ合わせます。セメントを研磨して混合を続け、混合液を型にピペッティングし、充填した型を2,250 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、ブルシャイトセメントアンカーを室温で一晩静置して凝固させます。翌朝、型からアンカーを取り出し、シリコンコーティングされた各プレートに2本のアンカーを12 mmの間隔で固定します。ピン留めしたプレートに70% ethanolをプレートと蓋の両方に充満するようにスプレーして滅菌し、その後、プレートを生物安全キャビネット（BSC）に入れます。少なくとも30分後、プレート内の液体を吸引し、BSC内で乾燥させます。蓋を戻し、使用するまでBSC内で保管します。バイオハザード物質の適切な使用および廃棄については、地域のバイオハザード規制に従ってください。無菌状態を維持し、コンストラクト形成の手順は生物安全キャビネット内で行ってください。テキストプロトコルに従って、初代線維芽細胞、試薬、およびピン留めされたブルーサイトアンカー付きシリコンコートプレートを準備した後、細胞を15 centimeterプレートでコンフルエンスが70%になるまで培養します。次に、コンストラクト1つあたり、細胞懸濁液 681 µL、トロンビン 29 µL、アプロチニン 2 µL、およびアミノヘキサン酸 2 µLで構成されるマスターミックスを調製します。溶液を十分に混合した後、各ピン留めプレートのブルシャイトセメントアンカーの周囲に、8の字を描くように 714 µL を加え、マスターミックスがアンカーの側面に直接接触するようにします。各プレートを軽く叩き、ミックスを均一に分散させます。最も重要なステップは、細胞を封入したフィブリンゲルの形成です。細胞封入用マスターミックスがアンカーに直接接触するようにし、プレートを軽く叩いて混合液を均一に分散させてください。プレート1枚ずつ、286 µLのフィブリノーゲンをプレート全体に滴下するように均等に加えてください。プレートをすぐに前後左右にスライドさせてフィブリノゲンを分散させ、細胞含有フィブリンゲルを形成させた後、次のプレートに進みます。作製物を37°C、5% CO2に維持された滅菌インキュベーターに入れ、フィブリノゲンの重合を促進させるため、少なくとも15分間インキュベートします。増殖培地に200 µMのアスコルビン酸、50 µMのProlene、および5 ng/mLのTGF beta 1を添加し、作製物1つあたり2 mLの供給培地を調製します。各構築物を覆うように2 mLの給餌培地を加え、37 °C、5% CO2に維持された滅菌インキュベーター内で、合計14日間または目的のエンドポイントまで培養します。その際、2日ごとに2 mLの給餌培地で培地を交換してください。ヒト血清を採取するには、テキストプロトコルに従って安静時の血液サンプルを採取し、その後、研究目的に適した形式の運動を被験者に実施させます。ここでは、30分間の高強度レジスタンス運動の例を示しています。運動セッションの15分後に血液サンプルを採取し、血液を凝固させた後、1,500 ×gで10分間遠心分離します。無菌条件下で、培地調製用に血清を滅菌チューブに移します。靭帯構築物の作製後、力トランスデューサーに接続されたリバースモールドグリップを用い、PBSバス内で引張試験機を使用して引張試験を行います。これにより、試験中にブルーサイトセメントアンカーが固定されます。デジタルノギスを用いて、靭帯構築物の長さと幅を測定し、組織の断面積を算出します。プレートから靭帯構築物のピンを抜き、アンカーをリバース成形グリップに取り付けます。その際、構築物がPBSに浸っていることを確認し、グリップ間の距離を調整して、構築物の長さを初期長に設定します。試験を開始し、0.4 mm/s（または3%/s）の歪み速度で、構造体が破断するまで歪みを加えます。試験後、組織を処理し、本文のプロトコルに従って作製した靱帯のコラーゲン定量を行います。培養から1〜2日後には、ACL線維芽細胞がフィブリンゲルに接着し、細胞突起を伸展させ、牽引力を及ぼし始めています。2つの固定点間に張力が生成され、細胞はこの軸に平行に配列し、コラーゲンの沈着を開始します。ここに、破断まで試験した靭帯の代表的な応力-ひずみ曲線を示します。これらの実験では、運動前後の血液サンプルからヒト血清を分離し、FBSの代わりに用いることで、運動によって誘導された生化学的環境を再現した培地を調製しました。このグラフに示されているように、14日間の培養期間後、靭帯構築物は運動後血清に反応して、最大引張荷重とコラーゲン含有量の両方において有意な増加を示しました。この手法を習得すれば、靭帯構築物は2日間で作成でき、2週間後には引張試験、コラーゲン含有量の定量、およびその他の生化学的分析が可能な状態になります。このトランスレーショナルなin vitroおよびin vivoモデルは、運動が靭帯、腱、そして実際には体中のほぼすべての組織の機能をどのように改善するかを理解するという、より広範なミッションの一環です。これは非常に堅牢で強力な手法であり、運動、栄養、負荷、あらゆる種類の成長因子など、ヒトまたは動物に対して実施可能なあらゆる介入処置後における、コラーゲン含有量および結合組織機能を決定することができます。

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