運動調節血清による靭帯構築物の治療：翻訳組織工学モデル

このモデルの全体的な目標は、運動と栄養が結合組織の合成と機能に与える影響を判断することです。この技術は、運動の前後に採取されるヒト血清を用いて3次元組織を治療することで、運動が靭帯や腱の機能にどのような影響を与えるかを理解することができます。3D Tissue Ensuring は、十分に特性評価された in vitro アッセイの利点と、in vivo 組織の機能、形態、および生化学的特性を兼ね備えています。

テキストプロトコルに従って事前にシリコンコーティングされた35mmプレートを準備した後、金型内の各円筒形ウェルの中央に1本の微細ピンを配置してアンカー金型を準備します。βリン酸三カルシウムとオルトリン酸溶液を1ミリリットルあたり1〜3グラムで、氷上のプラスチック製の計量ボートで組み合わせます。プラスチック製のセルスクレーパーを使用して、セメントを激しく混合します。

セメントを粉砕して混合を続け、混合物を型にピペットで入れ、充填された型を2,250倍gで5分間遠心分離します。遠心分離に続いて、ブラッシングセメントアンカーを室温で一晩硬化させます。翌朝、アンカーを型から取り外し、シリコンコーティングされた各プレートに12mm間隔で2つのアンカーを固定します。

ピン留めされたプレートに70%エタノールを噴霧して滅菌し、プレートと蓋の両方を充填してから、プレートを生物学的安全キャビネット(BSC)に入れます。少なくとも30分後、プレートを吸引し、BSCで試用できるようにします。蓋を元に戻し、必要になるまでBSCに保管します。

バイオハザード物質の適切な使用と廃棄について、地域のバイオハザード規制を遵守します。無菌性を維持し、生物学的安全キャビネット内でコンストラクト形成ステップを実行します。一次線維芽細胞、試薬、およびピンで固定されたブラシトアンカーを備えたシリコンコーティングプレートを調製した後、テキストプロトコルに従って、15センチメートルプレートで細胞を70%コンフルエントまで培養します。

次に、細胞懸濁液のコンストラクト当たり681マイクロリットル、トロンビンのコンストラクト当たり29マイクロリットル、アプロチニンのコンストラクト当たり2マイクロリットル、およびアミノヘキサン酸のコンストラクト当たり2マイクロリットルからなるマスターミックスを調製する。溶液をよく混合した後、ブラッサイトセメントアンカーの周りの8の字パターンで各ピン留めプレートに714マイクロリットルを追加し、マスターミックスがアンカーの側面に直接接触するようにします。各プレートを軽くたたいて、ミックスを均等に分散させます。

最も重要なステップは、細胞座位フィブリンゲルの形成です。セルシーティングマスターミックスがアンカーに直接接触していることを確認し、プレートを軽くたたいて混合物を均等に分散させます。一度に1つのプレートで、286マイクロリットルのフィブリノーゲンをプレート上に均等に滴下します。

すぐにプレートを前後左右にスライドさせてフィブリノーゲンを分散させ、細胞に埋め込まれたフィブリンゲルを形成してから、次のプレートに進みます。コンストラクトを摂氏37度、二酸化炭素5%に維持された無菌インキュベーターに入れ、フィブリノーゲンの重合を可能にするために少なくとも15分間インキュベートします。成長培地に200マイクロモルのアスコルビン酸、50マイクロモルのプロレン、およびTGFベータ1のミリリットルあたり5ナノグラムを補給することにより、供給培地の構築物あたり2ミリリットルを調製します。

各構築物を覆うために2ミリリットルの供給培地を使用し、摂氏37度と5%二酸化炭素に維持された無菌インキュベーターで合計14日間、または所望の終点まで培養し、2ミリリットルの供給培地で培地を2日ごとにリフレッシュします。ヒト血清を採取するには、テキストプロトコルに従って安静時血液サンプルを採取し、参加者に研究目標に合った運動モードを行ってもらいます。ここに示されているのは、高強度のレジスタンスエクササイズの30分間の試合です。

運動セッションの15分後に血液サンプルを採取し、血液を凝固させた後、サンプルを1、500倍gで10分間回転させます。無菌条件下で、血清を無菌チューブに移し、培地調製を行います。靭帯構造の準備に続いて、力変換器に結合された逆成形グリップを備えたPBS浴で引張試験機を使用して引張試験を実施します。

これにより、試験中にブラッサイトセメントアンカーが所定の位置に保持されます。デジタルキャリパーを使用して、靭帯構造の長さと長さを決定し、組織の断面積を計算します。靭帯コンストラクトをプレートから外し、アンカーをリバースモールドグリップに配置して、コンストラクトがPBSに沈んでいることを確認してから、グリップ間の距離を調整し、コンストラクトの長さを初期の長さに設定します。

試験を開始し、毎秒0.4ミリメートル、または毎秒3%のひずみ速度でコンストラクトを破損させます。試験後、組織を処理し、テキストプロトコルに従って人工靭帯のコラーゲン定量化を行います。培養に1〜2日かかると、ACL線維芽細胞がフィブリンゲルに付着し、細胞突起が延長され、牽引力を発揮し始めます。

2つのアンカーポイントの間に張力が発生し、細胞はこの軸に平行に整列し、コラーゲンの沈着を開始します。ここに示されているのは、故障するまでテストされた靭帯の代表的な応力ひずみプロットです。これらの実験では、運動前後の血液サンプルからヒト血清を単離し、FBSの代わりに使用して、運動誘発性の生化学的環境が豊富な培地を生成しました。

このグラフに示されているように、14日間の培養期間後、靭帯構築物は、運動後の血清に応答して、最大引張荷重とコラーゲン含有量の両方で有意な増加を示しました。習得すると、靭帯構造は2日間で作成でき、2週間で引張試験、コラーゲン含有量の定量化、およびその他の生化学的分析の準備が整います。このトランスレーショナルin vitro in vivoモデルは、運動が靭帯、腱、そして実際には体内のほぼすべての組織の機能をどのように改善するかを理解するという、より広範な使命の一部です。

これは、運動、栄養、ローディング、あらゆる種類の成長因子など、人間や動物に対して行うことができるあらゆるタイプの介入による治療後に、コラーゲン含有量と結合組織機能を決定することができる、非常に堅牢で強力な技術です。