フローサイトメトリーによる膵臓間葉の細胞を単離と解析

この手順の全体的な目標は、膵臓間葉系細胞を単離し、その遺伝子および表面マーカー発現解析を行うことです。この方法は、間葉系細胞によってどのような手がかりが発現され、それらが上皮の発達にどのように影響するかなど、膵臓発生分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、比較的シンプルで高速であること、および選別された細胞の良好な収率を可能にすることです。

まず、HBSSを含む培養皿に内臓を沈着させ、皿を実体顕微鏡下に置きます。肝臓と腎臓を取り外して膵臓を露出させるには、細い鉗子を使用して胃、十二指腸、脾臓から膵臓を取り除きます。各膵臓が採取されたら、組織を新しく準備した消化緩衝液を含む円錐形のチューブに移し、チューブを氷の上に置きます。

すべての膵臓が採取されたら、700 RPMで攪拌しながら組織を摂氏37度の加熱ブロックに30分間移し、15分後にチューブを手動で反転させます。消化の前半後も大きな膵臓片が残っている場合は、最後の15分間は5分ごとにチューブを反転させ、必要に応じて組織をさらに5〜10分間インキュベートします。分解の最後に、チューブを氷の上に置き、各サンプルに10ミリリットルの冷たいHBSSを加えます。

遠心分離により細胞を回収し、ペレットを2ミリリットルの新鮮なPBSに再懸濁します。次に、35ミクロンのストレーナーで細胞をろ過して5ミリリットルの丸底ポリスチレン収集チューブに入れ、消化チューブを2ミリリットルの新鮮なPBSで洗浄し、洗浄液を対応する収集チューブに濾します。その後、細胞を再度遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引します。

動物の年齢に応じて細胞をソーティングバッファーに再懸濁し、新しい35ミクロンの細胞ストレーナーを介して新しい5ミリリットルのコレクションチューブにろ過します。50〜100マイクロリットルの細胞を新しいFACSチューブに分注し、各蛍光色素、生存率色素、蛍光タンパク質、未染色コントロールなどの染色コントロールを行います。各チューブを最大4ミリリットルの選別緩衝液で洗浄し、遠心分離します。

次に、動物の年齢に応じて、ペレットを新鮮な選別バッファーに再懸濁します。次に、生存率色素で細胞を染色します。RNA抽出前の細胞選別の場合、選別開始の直前に、滅菌済みの1.5ミリリットルの収集チューブに、RNAse阻害剤を含む1ミリリットルの選別緩衝液を塗布します。

5分後、収集チューブをボルテックスし、液体を取り除きます。最初の染色コントロールをボルテックスし、チューブをフローサイトメーターにロードして、ソーティングパラメータの決定を開始します。すべてのソーティングパラメータを設定したら、サンプルをロードし、細胞を1.5ミリリットルのコレクションチューブにソーティングします。

次に、選別した細胞を遠心分離して回収します。上清をペレットまで吸引し、標準的なRNA抽出プロトコルに従ってRNAを抽出します。ここでは、胚の15.5日目の胚と出生後4日目の子犬の胃、脾臓、腸、膵臓を含む孤立した全消化管が示されています。

示したように単離された胚、新生児、および成人の膵臓組織からの単一細胞のフローサイトメトリー解析により、分析されたすべての年齢のトランスジェニック膵臓組織には、異なるYFP標識細胞集団が含まれていることが明らかになりました。選別後、これらの間葉系細胞を培養して、少なくとも5継代の細胞株を確立することができます。間葉系細胞に典型的な培養細胞の線維性形態に注目してください。

選別された細胞は、RNA抽出およびcDNA合成後にqPCRで分析されたパンメセンキマートマーカーベメンチンを発現します。さらに、単離された膵臓細胞表面マーカーの発現は、トランスジェニックYFP膵臓における蛍光標識細胞の全てが、線維芽細胞によって発現すると報告されている細胞表面糖タンパク質であるCD9を発現することを示している。この手順に続いて、RNAシーケンシングなどの他の方法を実行して、間葉系細胞の遺伝子発現に関する追加の質問に答えることができます。