胎児アルコール スペクトルの無秩序のモデルラットにおける海馬機能障害を評価するためにトレース瞬目反射条件づけの使用

本実験の全体的な目的は、連合学習の一種であるトレース眼瞼古典的条件付けを用いることで、胎児性アルコールスペクトラム障害のラットモデルにおける海馬機能不全をどのように検出できるかを示すことです。新生仔ラットに対し、ヒトの脳成長における第3三半期に相当する時期に、11.9% volume volumeの高濃度アルコールをビンジ様に投与します。

このようなアルコール曝露のパターンと用量は、胎児性アルコールスペクトラム障害（FASD）の人間の症例を模倣した、生涯にわたる脳機能欠損を引き起こす重要な要因となります。早期のアルコール曝露によって損なわれる重要な脳領域の一つが海馬です。ラットが成体へと成長した後、トレース眼瞼反射古典条件付けを用いて海馬機能不全の検査を行います。

これは海馬の完全性に依存する高次の連合学習の一形態です。生後4日から9日目まで、ラットの幼仔を毎朝的に計量し、その体重を記録します。その後、体重に基づいた印刷済みの表から給餌量を確認します。

ラットの幼若個体に対し、2時間の感覚を空けて2回の給餌により11.9% (v/v) のアルコール溶液を投与します。アルコールの1日あたりの総投与量は 5.25 g/kg/day です。このビンジ暴露パラダイムでは、1回の給餌につき、ミルク溶液を用いて体重 1 g あたり 0.278 mL のアルコールを投与します。

滅菌済みの1 mLシリンジを用いて、アルコールを含む乳汁を抽出します。次に、余分な溶液を押し出し、必要な正確な量にします。PE-10チューブの先端を新鮮なコーンオイルに浸します。

これにより挿入が容易になります。子犬の口から胃までのPE-10チューブの長さを測定します。必要に応じて、停止位置の目印となるようPE-50ストッパーを調整してください。

PE-10チューブを仔マウスの口に慎重に挿入します。通常、チューブの先端が喉に達するといくらかの抵抗を感じます。チューブの先端が食道入口部まで曲がるまで、チューブを操作してください。

オイルで滑りやすくなっているため、チューブが後方に滑らないように注意してください。そのまま食道へと進め、先端が胃食道接合部を通過すると、胃に入ります。この時点で停止し、ポンプを固定して、溶液を注入してください。

この操作はゆっくりとした速度で行ってください。PE-10チューブを慎重に取り外し、幼鼠に溶液の逆流、出血、または外傷がないか確認します。問題がなければ、幼鼠を兄弟個体と共に戻します。

眼瞼手術に使用する具体的な器具については、書面によるプロトコルおよび材料リストを参照してください。承認済みの消毒剤で手術部位を滅菌し、すべての手術器具および消耗品を事前にオートクレーブで滅菌します。イソフルランでラットに適切な麻酔を導入した後、バリカンを使用して頭部を剃毛し、切開部位および左眼瞼に十分な皮膚を露出させます。

70% isopropyl alcoholとポビドンヨードを用いて、皮膚を3回交互にスクラブ洗浄し、滅菌します。標準的な手順に従い、イヤーバーを用いてラットを脳定位固定装置に固定します。ラットが適切な麻酔深度に達したことを確認し、手術を開始します。

メスを用いて、正中線に沿って前後に切開します。この切開により、眼の前方からラムダ縫合線（lambda sutoral line）のわずか後方まで、十分な領域を露出させる必要があります。メスを使用して、頭蓋骨上の骨膜を慎重に掻き出します。この際、過剰な出血が起きないよう注意してください。

綿棒で余分な結合組織と血液を拭き取り、掻爬の合間に滅菌生理食塩水で患部を洗浄します。片側の頭頂骨の冠状縫合の直後から穴をあけます。綿棒を用いて血液と骨片を除去します。

スプリンター鉗子を用いて0 80ネジを掴みます。精密ドライバーを使用してネジを穴に固定し、皮質脳組織を損傷しない程度に、通常3〜4回転させて締め付けます。残りのネジについても同様の手順で固定します。

冠状縫合の後方に左右2本のネジが固定されており、右頭頂骨のラムダ縫合前方に1本のネジがあるはずです。4インチのドレッシング鉗子で左目の切開部位の上部の皮膚を把握し、3インチのドレッシング鉗子をこの目の隅に向けます。26ゲージ 3/8インチの針を1本取り、まぶたの隅から挿入します。

針を回転させ、針先（ベベル）が上を向くようにします。2本目の針をまぶたの中央に刺入します。精密ピンセットを使用して3Tワイヤーをつかみ、針のいずれかに挿入します。

最後まで挿入する必要はありません。2本目の3Tワイヤーについても同様の手順で行います。片方の手で両方の針を保持し、もう一方の手でヘッドステージを保持してください。

一度の連続した動作で、ヘッドステージを同じ方向に誘導しながら、針を眼瞼から引き抜きます。片手でEMGヘッドステージを保持し、もう片方の手で3インチのドレッシング鉗子を使用して、10Tワイヤーを右側の1つまたは両方のネジに巻き付けます。このワイヤーがネジから突き出ないように、端を押し込んで固定します。

次のステップに進む前に、EMGヘッドステージを中央に配置してください。4インチのドレッシング鉗子を用いて、皮膚（すなわち浅筋膜）を側頭筋から剥離し、小さなポケットを作成します。ポケットが作成できたら、アイリス剪刀を用いて、左目の隅に向かってさらに結合組織を切除します。

深く挿入しすぎたり、血管を切断したりしないよう注意してください。バイポーラ電極を取り、ワイヤーリードを側頭筋の曲面に沿って配置できるように成形します。2本のプローブは左眼の後方に、バイポーラ電極の下端は頭蓋骨の直上に配置します。

Ortho Jetパウダーを液体成分と混ぜ合わせ、液状のコンシステンシーにします。マイクロスパチュラを用いて、切開部位の周囲全体にペーストを塗布します。ラットの目にペーストが入らないよう注意し、塗布範囲内に留めてください。

Ortho Jetを半乾燥状態にし、その後、スプリンター鉗子を使用してEMGヘッドステージおよびバイポーラ電極のネジ山部分にある余分なアクリルを除去します。3Tワイヤーの余分な部分を切り落とし、作業用に数cm残しておきます。

マイクロ解剖ピンセットを使用して、各3TワイヤからPTFEシールドを慎重に取り除きます。これにより、ワイヤが眼輪筋に接触できるようになります。マイクロ解剖ピンセットを用いて、3Tワイヤの両端にフックを作成します。

余分なワイヤーを切り取ります。この際、残ったワイヤーが眼瞼内に後退してしまうほど切りすぎないよう注意してください。ケーブルは自社製です。まず白いバイポーラプラグを接続し、これによりショック超音波刺激の送達が可能になります。

その後、オレンジ色のEMGヘッドステージプラグを接続します。これにより、ラットがまばたきをする際の筋電図活動を記録します。両方のプラグはアーム上部の円形コミュテータにつながっており、ラットが自由に動き回っても信号の連続性が維持されます。

刺激アイソレーターの電源を入れ、最終的なハードウェアチェックを行います。これには、EMGのベースラインをコンピュータ画面で確認可能なレベルに調整することが含まれます。セッション1では、まず衝撃強度を4 milli ampsに設定し、2試行ごとに4 mil amp単位で増加させます。

この段階的な導入手順により、ラットを電気ショック刺激に慣れさせることができます。8回目の試行までには、ショック強度は1.6 milli ampsに維持され、このセッションおよびそれ以降のすべてのセッションで同様に維持されます。別のコンピュータで4チャンネルのデジタルオシロスコープを動作させ、リアルタイムで信号診断を行います。

ボックス1のラットによって放出された瞬目（まばたき）に注目してください。オシロスコープはまた、ベースラインのEMG信号が低ノイズで比較的クリーンであることを示しています。ウェブカメラにより、各ラットをモニターすることも可能です。

これはblinkソフトウェアバージョン4.0のスクリーンショットであり、1400ミリ秒間続く試行エポックを示しています。最初の280ミリ秒間は、ベースラインのEMG活動を測定するために刺激は提示されません。黄色の線はしきい値線を示しており、CS前の平均ベースライン値を4ボルト上回るEMG反応がまばたき反応として認定されます。

85デシベルのトーン条件刺激が280ミリ秒の時点で提示されます。トーンは380ミリ秒間持続し、これは660ミリ秒の時点に相当します。トーンが停止した後、刺激が提示されない500ミリ秒の間隔があります。これはトレース期間と呼ばれ、ラットはトーンCSのオフセットと、1160ミリ秒の時点で提示されるショックUSのオンセットを関連付けなければなりません。

電気ショックの無条件刺激（US）は100ミリ秒間持続します。当然ながら、ショックUSは防御的な瞬目反応を誘発します。これは無条件反応（UR）として知られ、140ミリ秒の時間窓内で測定されます。1回のトレーニングセッションは100回の試行で構成されます。

CSとUSがペアになる試行が90回あり、10回ごとの試行ではCSのみが提示されます。1セッションあたり10回のCS単独試行が行われます。これらの試行により、CS-US連合の学習が成立したかどうかを調査することができます。

条件反応（CR）は、ショックという無条件刺激（US）が存在しない時に発現します。各試行の開始時間を予測不能にするため、試行間間隔は平均30秒に設定されています。任意の試行において、ラットはどの時点でも瞬きをする可能性があり、そのEMGがソフトウェアによって記録されます。

閾値線を超える個別の瞬きは、発生タイミングと試行エポックに基づき、4つのカテゴリーのいずれかの反応としてみなされます。トーンCS開始後の最初の80ミリ秒以内にラットが瞬きをした場合、その反応は驚愕反応（SR）とみなされます。これは感覚運動パフォーマンスを示す非連合的な反応であり、CS-US連合の学習そのものを示すものではありません。SR期間後、かつショックUSが与えられる前に瞬きをした場合は、条件反応を示したことになります。

前述のとおり、条件反応（CR）は連合学習の主要な指標です。トレーニングの初期段階ではCRの発現は期待できませんが、多くの試行とセッションを経てトレーニングが進むにつれて、これらの反応はより頻繁になり、振幅が増大し、タイミングがより正確になります。CRは、全CRと適応的CRの2つのタイプに分類されます。

総CRは全般的な学習能力を反映し、適応的CRは動物がまばたきのタイミングを適切に調整できる能力を反映します。ショックに備えるための適応的CR期間は、ショックUS開始前の200ミリ秒間とされます。海馬が正常な哺乳類において、適応的CRの発現は、2つの刺激の提示に関連してまばたきのタイミングを適切に制御する際、海馬が高レベルで関与していることを反映しています。

その性質上、トレース眼瞬模範条件付けは、トーンCSとショックUSが時間的に重複するディレイ眼瞬模範条件付けよりも習得がはるかに困難です。CRの表出は被験者によって異なり、特定の脳回路への負荷によって深刻な影響を受ける可能性がありますが、URはCS-USのペア提示が行われるすべての試行で誘発されることが期待されます。したがって、この指標は感覚運動機能を反映するものであり、驚愕反応と同様に、CS-US連合の学習自体を示すものではありません。

以下のビデオクリップの一連の流れでは、ソフトウェアの設定と眼瞼反射訓練の開始について説明します。blinkソフトウェアを起動し、2つの関連ファイル、すなわち被験者データを格納したラットファイルと、トレース眼瞼反射条件付けファイルを読み込みます。

プログラムはトレーニングが始まるまで設定された状態で維持されます。トレーニングが開始されると、画面の右下に次の試行までのカウントダウンタイマーが表示されることに注目してください。これはセッション1の試行15のライブビデオ録画で、URは誘発されていますが、CRはまだ形成されていない状態です。

ここでは、速度を3分の1にしたリプレイを提示します。続く一連のクリップでは、挿管していない同一の対照ラットが6回のトレーニングセッションを経て進行する様子をスクリーンショットでご確認いただけます。最終的に、このラットは全般的なCRと適応的なCRの両方を示すようになります。

セッション6の試行96のライブビデオクリップです。ここでは2回のまばたきが認められ、一方は適応的なCRであり、もう一方はURです。次に、3分の1の速度で再生します。最後のクリップでは、アルコールを挿管したラットのセッション6の最終試行（CSのみの試行）のライブビデオをご覧いただきます。600回のトレーニングを経た後でも、適応的なCRを安定して発現させません。データ収集後、外れ値を検出するための組み込みエラーアルゴリズムを用いて、高ノイズのアーチファクトや異常なCS前のベースラインEMG活性を含む不適切な試行のスクリーニングを行います。

保存された良好な試行について、反応率、振幅、潜時、およびその他の重要な指標に関して、SR、UR、全CR、および適応的CRのさらなる解析が行われました。最初の結果セットに、6回のトレーニングセッションにおける平均適応的CRを示します。セッション2からセッション6にかけて、アルコール注入群と2つの対照群の間で、反応率と振幅の両方の指標において統計的に有意な差が認められました。

これは、発達早期にアルコールに曝露されたラットでは、適応的CRの頻度および強度が損なわれていたことを示しています。2つ目の結果セットに平均非条件反応を示します。頻度と振幅のいずれの指標においても、群間に統計的な有意差は認められませんでした。

これらの結果は、早期のアルコール曝露が無条件刺激に対するラットのまばたき能力を損なわせたのではなく、習得過程においてCS（条件刺激）とUS（無条件刺激）を適切に関連付けられなかったために障害が生じたことを示しています。本実験では、ビンジ様（ binge-like）の形式で投与された発達期のアルコール曝露が、トレース眼瞼古典的条件付けの欠損に反映されるように海馬に影響を与えるかどうかを検討し、脳と行動の関係を調査しました。実際に、眼瞼古典的条件付けは、脳の発達期におけるアルコール曝露に関連する神経行動学的な影響を評価するための有用なツールとなります。

刺激パラメータや連合学習の要件を変更することで、海馬以外のさまざまな脳系の機能的完全性を評価できるため、非常に汎用性が高い手法です。このビデオを視聴することで、新生仔ラットへのアルコール投与、電極の植え込み、および瞬目反射テストの手順に伴う複雑な詳細について十分に理解できたはずです。ご視聴ありがとうございました。