胎児アルコール スペクトルの無秩序のモデルラットにおける海馬機能障害を評価するためにトレース瞬目反射条件づけの使用

この実験の全体的な目標は、連想学習の一種であるトレースアイブリンク古典的条件付けの使用が、胎児アルコールスペクトラム障害のラットモデルにおける海馬機能障害の検出にどのように役立つかを実証することです。新生児ラットの子犬は、高用量のアルコール、11.9%の濃度で挑戦されますボリュームアルコール ビンジのようなファッションで。脳の成長に関して、人間の第3学期に相当する期間。

このアルコール曝露と用量のパターンは、FASDの人間の症例を模倣して、生涯にわたって脳の欠損を引き起こす重要な要因です。早期のアルコール曝露によって損なわれる重要な脳領域は海馬です。ラットが成体として成長した後、トレースアイブリンクの古典的条件付けを使用して海馬の機能障害について検査されます。

これは、海馬の完全性に依存する連想学習の高次の形式です。出生後4日目から9日目まで、ラットの子犬は毎朝体重を量られ、その体重が記録されます。次に、体重に基づいて事前に印刷されたテーブルから給餌量を取得します。

11.9%の容量のアルコール溶液を、2時間間隔で2回の給餌でラットの子犬に送達します。アルコールの1日の総摂取量は、1日あたり1キログラムあたり5.25グラムです。この過食曝露パラダイムは、乳溶液での給餌ごとに体重1グラムあたり0278ミルのアルコールを供給します。

アルコールを含むミルクを滅菌した1ミリリットルの注射器で抽出します。次に、余分な溶液を押し出して、必要な正確な量を取得します。PE-10チューブの先端を新鮮なコーン油に浸します。

これにより、挿入が容易になります。子犬の口から胃までのPE-10チューブの長さを測定します。必要に応じて、PE-50ストッパーを調整して、停止ポイントの視覚的なガイドとして機能します。

PE-10チューブを子犬の口に慎重に挿入します。通常、先端が喉に当たると、ある程度の抵抗が発生します。先端が食道の入り口に曲がるまでチューブを操作します。

チューブがオイルで滑りやすい可能性があるため、チューブを後方に滑らせないようにしてください。食道を下り、先端が胃食道括約筋を通過すると、胃に入ります。この時点で停止し、ポンプを安定させて、溶液を供給します。

これはゆっくりと行う必要があります。PE-10チューブを慎重に取り外し、溶液の逆流、血液、または身体的損傷について子犬を調べます。問題がなければ、子犬をその同腹仔と交換します。

まぶたの手術手順で使用される特定の器具については、書面によるプロトコルと材料リストを参照してください。承認された消毒剤で手術野を滅菌し、すべての手術器具と消耗品を事前にオートクレーブします。イソフルランでラットに適切な麻酔を誘発した後、ファートリマーを使用して頭を剃り、切開部位と左まぶたに十分な量の皮膚を露出させます。.

その皮膚は、70%イソプロピルアルコールとポビドンヨウ素を含む3つの交互のスクラブを行うことによって滅菌されます。標準的な手順に従って、ラットを耳バーで脳定位固定装置に固定します。ラットが適切な麻酔面を示したら、手術を進めてください。

メスの刃を使用して、正中線で前方の後部切開を行います。この切開は、目の前方に十分な領域を露出させ、ラムダの胃線のわずかに後方に露出させる必要があります。メスの刃を使用して、頭蓋骨の上の骨膜を慎重にこすり落とし、過度の出血を引き起こさないようにします。

綿棒で余分な結合組織と血液を拭き取り、擦り傷の間に滅菌生理食塩水でその部分を洗い流します。片方の頭頂骨の冠状縫合糸のすぐ後ろから穴を開けます。綿棒で血液や骨の破片を取り除きます。

破片鉗子を使用して、0 80ネジをつかみます。宝石商のドライバーを使用してネジを穴に固定し、皮質脳組織を傷つけることなく、通常は3〜4回転してネジを締めます。同じ手順に従って、残りのネジを固定します。

冠状縫合糸の後ろに両側に固定された2本のネジと、ラムダ縫合糸の前方の右頭頂骨に1本固定する必要があります。4インチのドレッシング鉗子で左目の切開部位で上部の皮膚をつかみ、3インチのドレッシング鉗子をこの目の角に向けます。26ゲージの3/8インチの針を1本取り、まぶたの角に挿入します。

面取りされた面が上を向くように針を回転させます。まぶたの中央に2本目の針を挿入します。細い鉗子を使用して3Tワイヤーをつかみ、針の1つに挿入します。

奥まで挿入する必要はありません。2本目の3Tワイヤーについても同じ手順に従います。片手で両方の針をつかみ、もう一方の手でヘッドステージをつかみます。

1回の連続的な動きで、ヘッドステージを同じ方向に導きながら、針をまぶたから引き離します。EMGヘッドステージを片手で持ちながら、もう一方の手で3インチのドレッシング鉗子を使用して、右側の一方または両方のネジに10Tワイヤーを巻き付けます。このワイヤーがネジからはみ出さないように、このワイヤーを押し込みます。

EMGヘッドステージは、次のステップに進む前に中央に配置する必要があります。4インチのドレッシング鉗子を使用して、皮膚、つまり側頭筋から表在筋膜を分離することにより、小さなポケットを作成します。ポケットを作成したら、虹彩はさみを使用して、左目の角に向かって働きかけながら、より多くの結合組織を切り取ります。

深く入りすぎたり、血管を切ったりしないように注意してください。バイポーラ電極を取り、側頭筋の湾曲に沿ってワイヤーリードをフィットできるようにワイヤーリードを形作ります。2 つのプロングは左目の後方に配置され、バイポーラ電極の下端は頭蓋骨の真上に配置されます。

Ortho Jet 粉末を液体成分に混合して、液体の粘稠度を得ます。切開部位全体にマイクロスパチュラでペーストを塗ります。ネズミの目にペーストを落とさないように注意し、閉じ込めてください。

オルソジェットを半乾燥状態にしてから、破片鉗子を使用してEMGヘッドステージの余分なアクリルを取り除きます。そして、バイポーラ電極のねじ山。余分な3Tワイヤーを切り取り、数センチの作業時間を残します。

マイクロ解剖鉗子を使用して、各3TワイヤーからPTFEシールドを慎重に取り外します。これにより、眼輪筋と接触することができます。マイクロ解剖鉗子を使用して、3Tワイヤーの両端にフックを作成します。

余分なワイヤーを切り取り、残りのワイヤーがまぶたに引っ込められるほど切り取らないように注意してください。ケーブルは社内で作られています。白いバイポーラプラグが最初に接続され、これによりショックUS刺激の配信が可能になります。

その後、オレンジ色のEMGヘッドステージプラグを接続します。ラットがまばたきをするときの筋電図活動を記録します。両方のプラグは、アームの上部にある丸い整流子につながっており、ラットが自由に動き回っても信号の連続性を維持します。

刺激アイソレータがオンになり、最終的なハードウェアチェックが行われます。これには、EMGベースラインをコンピューター画面で表示可能なレベルに調整することが含まれます。セッション1では、衝撃強度は最初に4ミリアンペアに設定され、2回の試行ごとに4ミルアンペア単位で増加します。

この段階的な手順により、ラットはショック刺激に順応することができます。8回目の試行では、このセッションとその後のすべてのセッションを通じて、衝撃強度が1.6ミリアンペアに維持されます。別のコンピューターでは、4チャンネルのデジタルオシロスコープを実行し、リアルタイムの信号診断を実行できます。

ボックス1のネズミが発したまばたきに注意してください。オシロスコープは、ベースラインEMG信号が比較的クリーンでノイズが少ないことも示しています。ウェブカメラを使えば、各ネズミも監視することができます。

これは、1400ミリ秒続く試用エポックを示すblinkソフトウェアバージョン4.0のスクリーンショットです。最初の280ミリ秒では、ベースラインのEMG活動の尺度を得るための刺激は提示されません。黄色の線は、CS前の平均ベースライン値を4ボルト超えるEMG応答がまばたき反応として適格となるしきい値線を示しています。

85デシベルのトーンコンディション刺激は、280ミリ秒の時点で配信されます。トーンは 380 ミリ秒の間オンのままですが、これは 660 ミリ秒のタイム ポイントに相当します。それが停止した後、刺激が提示されない500ミリ秒の間隔があります これはトレース期間と呼ばれ、ラットはショックUSの開始時にトーンCSのオフセットを解決する必要がありますが、まだ1160ミリ秒のマークで配信されません。

衝撃 US は 100 ミリ秒続きます。当然のことながら、ショック US は、140 ミリ秒の時間枠で測定される無条件応答 (UR) と呼ばれる防御的なまばたき応答を引き出します。1セッションのトレーニングは100回の試行で構成されています。

CSとUSがペアになっているトライアルは90件あり、10回ごとにCSのみが配信されます。セッションごとに 10 回の CS のみの試行があります。これらの試験により、CS US協会の学習の有無を調査することができます。

条件応答の形で、またはCRは、ショックUSが存在しない場合に表されます。試行間間隔は平均化されて 30 秒になるため、各試行の開始は予測できません。どの試験でも、ラットはいつでもまばたきをする可能性があり、そのEMGはソフトウェアによって記録されます。

閾値線を超える目立たないまばたきは、いつ発生するか、および試行エポックに基づいて、4つのカテゴリのいずれかの応答と見なされます。トーンCSの発症後最初の80ミリ秒間にラットがまばたきをした場合、その応答は驚愕応答またはSRと見なされます。これは、感覚運動能力を示す非連想反応ですが、CS US の関連性自体を学習するものではありません。SR 期間の後、ショック US が配信される前に点滅する場合は、条件付き応答を発しています。

前述のように、CRは連想学習の主要な尺度です。CRは、トレーニングの初期段階では発症しないと予想されていますが、トレーニングが多くの試行やセッションで進行するにつれて、これらのタイプの反応はより頻繁になり、振幅が大きくなり、タイミングが合うようになる可能性があります。CR を合計 CR と適応 CR の 2 種類に分割します。

合計CRは一般的な学習能力を反映し、適応CRはまばたきのタイミングをうまく計る動物の能力を反映しています。ショックの発生直前に、それ自体を補強する方法として、適応CR周期はショックUSの開始の200ミリ秒前です。海馬が無傷の哺乳動物では、適応CRの発現は、2つの刺激の送達に関連してまばたきの適切なタイミングに海馬が高レベルで関与していることを反映しています。

その性質上、トレース アイブリンクの古典的条件付けは、トーン CS とショック US が時間的に重なる遅延アイブリンクの古典的条件付けよりもはるかに取得が困難です。CRの発現は被験者によって異なり、離散的な脳回路への挑戦によって深刻な影響を受ける可能性がありますが、URはすべてのペアのCS US試験中に放出されることが期待されています。そのため、この測定値は感覚運動能力を反映しており、驚愕反応と同様に、CS US 関連付け自体の学習を示すものではありません。

次の一連のビデオクリップでは、ソフトウェアのセットアップとまばたきトレーニングの開始を見ることができます。blink ソフトウェアがアクティブになり、2 つの関連ファイルがリクルートされます。被験者データを含む rat ファイルと、trace eyeblink コンディショニング ファイル。

プログラムは、トレーニングが始まるまで実施されます。トレーニングが始まると、画面の右下に次の試行までカウントダウンするタイマーが表示されます。これは、セッション 1 の試行 15 のライブ ビデオ録画で、UR が発行されていますが、CR はまだ発生していません。

これは3分の1の速度でのリプレイです。次の一連のクリップでは、同じ挿管されていないコントロールラットが6回のトレーニングセッションで進行する様子のスクリーンショットを見ることができます。最終的には、合計 CR と適応 CR の両方を出力します。

これは、セッション 6 の試行 96 のライブ ビデオ クリップで、2 つのまばたきが放出され、1 つは適応型 CR で、もう 1 つは UR です。これは3分の1の速度でのリプレイです。この最後のクリップでは、アルコール挿管されたラットがセッション6の最後の試行、CSのみの試行で、600回のトレーニング試行の後でも、適応CRを確実に放出しない様子をライブビデオで見ることができます。データが収集された後、外れ値を検出するための組み込みエラーアルゴリズムを使用して、高ノイズアーティファクトと異常なCS前のベースラインEMGアクティビティで構成される悪い試行についてスクリーニングされます。

保持された良好な試験は、SR、UR、総CR、および適応CRについて、応答の割合、振幅、潜時、およびその他の重要な測定値に関してさらに分析されます。この最初の結果セットには、トレーニングの 6 つのセッションにわたる平均適応 CR が示されています。パーセンテージと振幅の測定値は、セッション2からセッション6まで、アルコール挿管群と2つの対照群の間で統計的に有意でした。

これは、適応CRの頻度と強度が、発生初期にアルコールに曝露されたラットで損なわれたことを示しています。平均無条件応答は、この2番目の結果セットに示されています。周波数と振幅の測定値は、いずれのグループ間でも統計的に差はありませんでした。

これらの結果は、早期のアルコール曝露がラットの無条件刺激に対するまばたき能力を損なわなかったこと、しかし彼らが示した障害は、獲得時にCSとUSを適切に関連付けることに失敗したことによるものであることを示しています。この実験では、ビンジのような方法で行われる発達アルコール曝露が赤字に反映され、まばたきの古典的条件付けをトレースするように海馬に影響を与えるかどうかを決定することにより、脳の行動関係を調べました。実際、まばたきの古典的条件付けは、脳の発達中のアルコール曝露に関連する神経行動学的影響を評価するための有用なツールです。

刺激パラメータや連想学習要件を変更することで、海馬以外のさまざまな脳システムの機能的完全性も評価できるという点で、非常に汎用性があります。このビデオを見た後、新生児ラットの子犬へのアルコールの投与、電極の埋め込み、まばたきテスト手順の実施に伴う複雑さを十分に理解しているはずです。このビデオをご覧いただき、誠にありがとうございます。